Summary
Wij introduceren een nieuw hypoxische kamer systeem voor gebruik bij aquatische organismen zoals kikker- en zebravis embryo's. Ons systeem is eenvoudig, robuust, kosteneffectief en zorgt voor inductie en onderhoud van hypoxie in vivo en gedurende 48 uur. We presenteren 2 reproduceerbare methoden om de effectiviteit van hypoxie te monitoren.
Abstract
Hier introduceren we een nieuw systeem voor hypoxie-inductie, die we ontwikkelden om de effecten van hypoxie in aquatische organismen zoals kikker- en zebravisembryo's te bestuderen. Ons systeem bestaat uit een kamer met een eenvoudige installatie die toch robuust is om een specifieke zuurstofconcentratie en temperatuur in elke gewenste experimentele oplossing te induceren en in stand te houden. Het gepresenteerde systeem is zeer kosteneffectief maar zeer functioneel, het maakt inductie en onderhoud van hypoxie mogelijk voor directe experimenten in vivo en voor verschillende perioden tot 48 uur.
Om de effecten van hypoxie te monitoren en te bestuderen hebben we twee methoden ingezet: meten van de mate van hypoxie-induceerbare factor 1alfa (HIF-1a) in hele embryo's of specifieke weefsels en bepaling van retinale stamcellen proliferatie door 5-ethynyl-2'- Deoxyuridine (EdU) incorporation in het DNA. HIF-1α niveaus kunnen dienen als een algemene hypoxie marker in het hele embryo of weefselVan keuze, hier embryonale netvlies. EdU-integratie in de prolifererende cellen van embryonale retina is een specifieke uitkomst van hypoxie-inductie. Zo hebben we aangetoond dat hypoxische embryonale retinale progenitors proliferatie verminderen binnen 1 uur incubatie onder 5% zuurstof van zowel kikker- als zebravis embryo's.
Eenmaal beheerd, kan onze installatie worden gebruikt voor kleine aquatische modelorganismen, voor directe in vivo experimenten, gedurende een bepaalde periode en onder normale, hypoxische of hyperoxische zuurstofconcentraties of onder een ander gegeven gasmengsel.
Introduction
Hypoxia onderzoek heeft tal van toepassingen. Deze omvatten onder meer het onderzoek naar de pathogenese en het ontwikkelen van behandelingen voor medische aandoeningen die gekenmerkt worden door hypoxie 1 en acute ziekte op hoog niveau 2 . Hypoxische stress veroorzaakt belangrijke metabolische veranderingen in alle organismen die zuurstof vereisen. Hypoxische stress beïnvloedt ook foetale groei en ontwikkeling en de pathogenese van diverse menselijke ziekten, met inbegrip van intraderine groeibeperking 3 . Hypoxische stress kan niet alleen leiden tot verminderde geboortegewicht, foetale en neonatale sterfte, maar kan ook leiden tot veel complicaties in het volwassen leven, zoals hart- en vaatziekten, type 2 diabetes, obesitas en hypertensie 4 . Hypoxische stress wordt ook vaak waargenomen bij het ontwikkelen van vaste tumoren, wanneer het tumorweefsel zijn bloedtoevoer uitstoot. Het is daarom van cruciaal belang om de effecten van hypoxie in vivo en direct tijdens embr te kunnen bestuderen Yonische ontwikkeling.
Onder de meest bekende methoden die zijn toegepast om de effecten van hypoxie tijdens de ontwikkeling te bestuderen, is het gebruik van kobaltchloride in het groeimedium of incubatie van het organisme in een hypoxische kamer. Cobaltchloride induceert kunstmatig een hypoxische reactie onder normale zuurstofconcentratie, door zijn rol bij de stabilisatie van hypoxie-inducerende factor-1 alfa (HIF-1a) door het voorkomen van de proteosomale afbraak van 5 , 6 , 7 . Echter, als een handige methode 8 kan het gebruik van kobaltchloride en andere soortgelijke chemische hypoxie-mimetica onspecifiek schadelijk effect hebben op cellen en weefsels, bijvoorbeeld apoptose 9 . Daarom zijn hypoxische kamers een betere methode voor het induceren van "natuurlijke hypoxie" in levende organismen door middel van normale ontwikkeling.
Ntent "> We hebben zich beziggehouden met het ontwikkelen van een systeem voor de inductie van hypoxie bij aquatische dierlijke embryo's. Zowel kikkers als zebravis zijn nu informatieve gewervelde modelorganismen geworden voor studies van talrijke biologische processen, evenals modellen voor diverse menselijke ziekten. Kikker- en zebravisembryo's Ontwikkelen extern, elimineren de complicatie van de materiële compensatie. Verder maakt een snelle ontwikkeling mogelijk om milieufactoren te manipuleren en de fenotypische veranderingen in orgelvorming in real-time te waarnemen. Bovendien worden veel componenten van belangrijke signaaltransductieroutes sterk bewaard in Deze modelorganismen zijn in detail beschreven door een groot aantal literatuur. Het belangrijkste voordeel bij het gebruik van kikkers en zebravis embryo's om de effecten van hypoxie op de ontwikkeling van gewervelde dieren te onderzoeken is dat alle processen direct kunnen worden gecontroleerd, aangezien zuurstof snel de embryo's binnentreedt. Zo, bij kikkers en zebravis, zoals in tegenstelling tot andere modelorganismen zoalsMuisembryo's, kan de invloed van een specifieke zuurstofconcentratie worden bestudeerd in het weefsel van belang, zonder rekening te houden met de aanwezigheid of het gebrek aan functionele vasculatuur.De meeste in de handel verkrijgbare opstellingen voor hypoxische incubatie hebben het nadeel van vergelijkbaar groot en met bijbehorende hoge lopende kosten. Afgezien van hun hoge initiële kosten- en gasverbruik vereist evenwicht en onderhoud van gemeenschappelijke hypoxiekamers een constante hypoxische atmosfeer tegen het gasgradiënt dat van nature in deze kamers voorkomt door hun grotere grootte en / of organisme-ademhaling. Dit vereist werk van gasfans en een koelsysteem, wat de hoeveelheid extra benodigde apparatuur verhoogt, belemmert de behendigheid van de onderzoeker en vermindert de eenvoud van de experimentele procedure. Daarentegen is de opstelling die we hier presenteren vergelijkbaar robuust, maar zeer kosteneffectief, klein, makkelijk te bepalen en f mogelijk te makenAst gas-evenwicht, stabiele hypoxische atmosfeer en eenvoudige uitwisseling van materialen en oplossingen binnen de kamer. Ons systeem kan worden gebruikt voor gebruik met een aquatisch model organisme van belang.
We hebben een hypoxische kamer geconstrueerd die handig klein is en kan daarom in een gemeenschappelijke laboratorium-incubator worden geplaatst, waardoor experimentele procedures bij elke specifieke temperatuur gemakkelijk worden toegestaan. Door de beperkte temperatuur en zuurstofconcentratie in het medium te bieden, ligt het voordeel van ons systeem tegen de in de handel verkrijgbare hypoxie-incubators in zijn kleine grootte en kostenefficiëntie. Zo kan onze setup worden opgesteld met behulp van algemene laboratoriumvoorraden beschikbaar voor de meeste onderzoekslaboratoria en vereist geen dure materialen. Daarnaast produceert onze installatie geen warmte, in tegenstelling tot de in de handel verkrijgbare hypoxia incubators, en maakt het gebruik bij temperaturen kleiner dan kamertemperatuur in een incubator geplaatst. De laSt is vooral kritisch voor het werk met koudbloedige organismen zoals kikkers en vissen waar ontwikkelings- en metabolische tarieven sterk afhankelijk zijn van temperatuur.
Zeer kosteneffectief en gemakkelijk gebouwd, onze gas-incubatiekamer is desondanks zeer veelzijdig bij het vaststellen van verschillende hypoxische of hyperoxische condities, evenals het mogelijk maken om snel en makkelijk te beheren van verschillende media en oplossingen voor een groot aantal experimentele omstandigheden. Daarnaast maakt ons systeem gebruik van een 24-putje plaat in plaats van veelgebruikte gerechten of laboratoriumtanks 10 , 11 , 12 , en laat ons systeem in een keer observatie en experimentele behandeling van meerdere mutante condities.
Om te controleren of correcte inductie van hypoxie is, hebben we de niveaus van het HIF-1a eiwit door Western blot detectie gecontroleerd. Daarnaast is het aantal proliferatiecellen voor en na incubatieN in de hypoxische kamer kan worden gebruikt om te bepalen of hypoxie in het weefsel is geïnduceerd. Deze methode is gebaseerd op onze eerder gepubliceerde resultaten 13 , waaruit blijkt dat proliferatie in embryonale retinale stamcel niche afneemt bij inductie van hypoxie. Zo hebben we het niveau van retinale stamcellen proliferatie gecontroleerd door 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) toe te voegen aan het embryo-medium en het meten van de opname ervan in het DNA van nieuw prolifererende cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierenwelzijn van de Universiteit van Cambridge.
1. Onderhoud van dieren
- Kikker embryo's
OPMERKING: Embryo's kunnen worden opgeheven en onderhouden volgens de dier- en laboratoriumfaciliteit. Hier wordt een voorbeeld van het dierenonderhoud beschreven.- Bereid 0,1x gemodificeerde Barth's Solution (MBS) oplossing: 0,88 mM NaCl, 10 μM KCl, 24 μM NaHC03, 100 μM HEPES, 8,2 μM MgS04, 3,3 μM Ca (NO3) 2 en 4,1 μM CaCl2, pH 7,6 .
- Verkrijg Xenopus laevis embryo's door in vitro bevruchting.
- Ovulatie veroorzaken bij volwassen vrouwelijke Afrikaanse klauwkikkers ( Xenopus laevis) door injectie met een zwangere mersseron gonadotropine een week (60 IE) en 12 uur (500 IE) vóór het leggen van eieren.
- Verzamel oocyten en bevrucht ze in vitro met gehomogeniseerde mannelijke testis.
- raiZie embryo's in 0.1x MBS bij 16-18 ° C. Volg de embryo's volgens de Normale tabel van Xenopus laevis 14 . Wees voorzichtig bij het selecteren van volledige en levende embryo's voor het experiment.
- Zebravis embryo's
OPMERKING: Embryo's kunnen worden opgeheven en onderhouden volgens de dier- en laboratoriumfaciliteit. Hier wordt een voorbeeld van het dierenonderhoud beschreven.- Bereid embryo-medium op: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgS04 en 0,00001% methyleenblauw.
- Onderhoud en ras WT AB stam Danio rerio bij 26,5 ° C.
- Verzamel de embryo's op de ochtend van de bevruchting, verhoog tot 4 d na bevruchting (dpf) bij 28 ° C in embryo medium bereid zoals hierboven beschreven, selecteer en trap zoals eerder beschreven 15 .
2. Inductie van hypoxie in vivo
- Gebruik een fokwatertank ( Figuur 1A ) die normaal gesproken in de visfaciliteit gebruikt wordt voor de hypoxische kamerconstructie. Deze tank moet in een 24-putjesplaat passen.
- Bereid een 24-putjesplaat met meshbodem zoals afgebeeld in Figuur 1 . Verwijder de plastic bodem van de 24-putjesplaat ( afbeelding 1B ), bijv ., Door hiervoor een freesmachine te gebruiken.
- Vul de ruimte tussen het plastic van de putjes en de muren van de plaat met epoxyhars. Bevestig elk nylonfilter ( Figuur 1C ) met een maasdiameter van 0,1-0,2 mm op het kunststof met kunststofhars en laat de plaat helemaal droog zijn.
- Nadat u droog bent, boren u drie of vier tunnels ( Figuur 1D ) van 10 mm lengte en 5 mm diameter in de hars- en mesh-beklede plaatwanden. Bevestig plastic of Teflon staven( Figuur 1E ) van geschikte diameter en 30 mm lengte aan de tunnels en plaats de plaat in de gewenste tank.
- Plaats de 24-putjes plaatje in de watertank van de keuze. Met behulp van een siliconenpijp ( Figuur 1F ) bevestigt u een gasreservoir ( Figuur 1G ) met het gewenste O2 / N2-mengsel of een ander gasmengsel naar keuze aan een verdeelklep ( Figuur 1H ) met een geschikte gasregelaar (I) (BOC 200 bar). Gebruik hier gastanks die een mengsel van 5% zuurstof en 95% N 2 bevatten in de hypoxie-experimenten die hier worden gepresenteerd.
- Stel de zuurstofstroom in het kamermedium in op 0.0017-0.0019 kubieke meter per seconde. Onder deze gasstroom zou geen storing van het medium in de putjes van de plaat moeten worden gezien.
- Gebruik hiervoor de hoge-zuiverheid tweetraps gasregelaar. Stel de regelaar in om de binnendruk van de te verminderenE gastank (1000 - 2500 PSI) tot een afleverdruk van 10 PSI gedurende het experiment. Aldus werd volgens de specificaties van deze gasregelaar een stromingssnelheid van 0,00189 kubieke meter per seconde bereikt gedurende het experiment.
- Sluit de siliconenbuis en de verdeelklep aan op een keramische schijfdiffuser ( figuur 1J ) in de aquatisch tank. Sluit de aquatentank en doe het deksel voorzichtig af, bedek het met siliconenvet ( Figuur 1K ) (vergelijk met figuur 1 ). Als er een bepaalde niet-kamertemperatuur nodig is, plaats de hypoxische kamer in een laboratorium incubator met de gewenste temperatuur.
- Afhankelijk van het type embryo dat in het experiment wordt gebruikt, vul de hypoxische kamertank met het juiste embryo-medium en begin het diffusie van het gasmengsel door de keramische schijfdiffuser. Equilibreren gedurende 10-15 minuten.
- Na evenwicht met thE gewenst zuurstofmengsel, meet zuurstofconcentratie in het water met behulp van een oxymeter of zuurstof probe. Gebruik hiervoor een oxymeter met de optische zuurstof- en temperatuursensor voor optische optische vezels.
- Selecteer voorzichtig de embryo's voor het experiment, gebruik hele en levende embryo's voor de hypoxie-incubatie. Hier, ons kikker embryo's van stadium 38 of zebravis embryo's 4 dpf in de hier gepresenteerde experimenten.
- Plaats de embryo's in de incubator ( Figuur 1K ) met de gas incubatiekamer en laat ze evenwetten tot de temperatuur van de incubator.
- Breng de embryo's zorgvuldig in de putjes van de meshed 24-well-plaat ( Figuur 1B ) van de gas incubatie kamer, met behulp van een plastic pipet. Gebruik altijd een plastic pipet voor het overbrengen van embryo door het protocol.
OPMERKING: Elke putje van deze plaat kan opnemenTot 5 kikker embryo's van stadium 38 of maximaal 7 zebravis embryo's van 4 dpf. Label de putten zorgvuldig als u verschillende genotypen gebruikt. - Onderhoud van de gas incubatie kamer onder een constante infusie met het gekozen gasmengsel gedurende 5 uur of gedurende een langere periode die het experiment past. Gebruik hier een mengsel van 5% O2 en 95% N2.
- Verzorg de embryo's zorgvuldig door de gas incubatiekamer terug naar het normoxische medium dat overeenkomt met het embryotype en ga onmiddellijk door met de stappen 3 of 4.
- Als er een verdere normoxische behandeling nodig is, moet u de embryo's voorzichtig terugzetten naar het normoxische medium dat overeenstemt met het embryotype.
3. Controle op succesvolle hypoxie-inductie door het controleren van HIF-1a-niveaus
- Voorbereidende werkzaamheden
- Bereid 0,4 mg / ml MS222 oplossing in 0.1x MBS op.
- Bereid homogenisatiebuffer voor: Verkoop Radioimmunoprecipitatie Assay buffer (RIPA bUffer) voor homogenisatie van weefsel en vul de hoeveelheid buffer die nodig is voor uw experiment met Protease Inhibitor tot een eindconcentratie van 1: 100 v / v.
- Bereid oplossingen voor Western blot voor.
- Bereid 4x Laemmli gel loading buffer: 425 mM Tris pH 8,0, 40% v / v Glycerol, 8% v / v SDS, 4% v / v bèta-mercaptoethanol, 0,5% w / v Bromfenol Blue, 10 ml totaal volume ddH 2 O.
- Bereid 5x loopbuffer: 15 g Trizma base, 72 g Glycine, 5 g SDS, 1 L totaal volume ddH 2 O.
- Prepare Transfer buffer: 2,66 g Trizma base, 14,4 g glycine, 200 ml 100% methanol, 1 L totaal volume ddH 2 O.
- Bereid 10x TBST: 5 ml 1 M Tris pH 8,0, 30 ml 5M NaCl, 2,5 ml Tween 20, 1 liter totaal volume H20.
- Bereid blokkerende oplossing: 4% w / v schuimmelkpoeder in 1x TBST.
- Verzameling van weefsel
- Anesthetiseer de embryo's door te zwemmen in 0,4 mg / ml MS222 oplossing16 , 17 en ze over te brengen in een plastic reactiebuis gevuld met homogenisatiebuffer met behulp van een plastic pipet. Gebruik 20 μL buffer per embryo. Merk op dat ten minste 5 kikker embryo's van stadium 38 of 7 zebravis embryo's van 4 dpf nodig zijn om een significante verandering in HIF1a eiwit niveaus te bepalen.
- Homogeniseer het weefsel met behulp van een geschikt weefselhomogenisator of een sonicator. Verwijder het puin door centrifugeren (15 min; 13.000 xg; 4 ° C).
- Alternatief dissekteer de retina's uit de verdoofde kikkerembryo's 17 en homogeniseren zoals hierboven. Gebruik 20 μL homogenisatiebuffer per 10 retina's.
- Neem de supernatant met een pipet, denatureren bij 85 ° C gedurende 5 minuten en aanvulling met Laemmli gel-laadbuffer tot een eindconcentratie van 1x v / v ( bijv . Voeg 5 μL 4x Laemmli-buffer toe aan 15 μL homogenaat). Gebruik deze supernatant voor de WesTern blot of bevriezen de monsters bij -20 ° C.
- Western Blot
- Laad de monsters die zijn bereid zoals beschreven in stap 3.2 op een prepast 12% gel in een elektroforese systeem met behulp van 1x v / v Running buffer. Gebruik een eiwit ladder voor het bepalen van de eiwitgrootte. Breng de eiwitten over op een nitrocellulosemembraan (0,45 μm membraan) in Transfer buffer gedurende 1 uur op ijs bij 4 ° C, volgens protocol van de fabrikant.
- Blokkeer onspecifieke bindingsplaatsen die het membraan incuberen in Blokbuffer gedurende 60 minuten. Volg met 3 x 10 min wast in 1x TBST.
- Incubeer het membraan in oplossingen van respectievelijk 1: 100 v / v respectievelijk 1: 5000 v / v, kanin anti-HIF-1a antilichaam en muis anti-a-tubuline, in Blokkerende oplossing gedurende 2,5 uur bij RT. Volg met 3 x 10 min wast in 1x TBST.
- Voor detectie, incuberen in geiten-anti-konijnen en geiten-anti-muis HRP-geconjugeerde antilichamen die 1: 1000 v / v verdund zijn in Blokoplossing gedurende 1 uur.Volg met 3 x 10 min wast in 1x TBST en visualiseer de HRP-kleuring met behulp van een commerciele kit en een gewenste ontwikkelmachine.
- Kwantificeer de hoeveelheid HIF1a eiwit met behulp van digitale kwantificering.
4. Monitoring van de proliferatie van cellen in hypoxie
- Voorbereidende werkzaamheden
- Bereid 5 mM EdU oplossing in het gewenste embryo medium. De oplossing kan onmiddellijk of aliquot worden gebruikt en gedurende maximaal 6 maanden bij -20 ° C opgeslagen worden.
- Bereid Fosfaatbufferde Zoutoplossing (PBS) of koop PBS uit commerciële middelen. Autoclaaf gedurende 10 minuten bij 115 ° C.
- Bereid oplossingen voor de detectie van EdU-opneming op.
- Bereid fixatieoplossing voor: 4% v / v 16% Formaldehyde voorraadoplossing in PBS.
- Bereid sucroseoplossing op: 30% w / v sucrose in PBS.
- Bereid PBST: 0,1% v / v Triton X-100 in PBS.
- Bereiding Blokkerende oplossing: 10% v / v Warmte-geactiveerde geitenserum (HIGS) in PBST.
- Bereid DAPI oplossing: 1: 1000 v / v 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) in PBST.
- Incubatie van embryo's in hypoxie voor EdU-incorporation
- Vul de gas incubatie kamer met 400-500 ml 5 mM EdU oplossing aangevuld met 1% v / v DMSO. Pre-equilibreer de oplossing met hetzelfde gasmengsel dat 15 minuten vóór het experiment in het experiment werd gebruikt. Merk op dat het volume van de incubatieoplossing kan worden geminimaliseerd door kortere staven ( figuur 1E ) aan de onderkantplaat te bevestigen.
- Sluit de gasleiding aan op de gascilinder met een gasmengsel van 5% O2 en 95% N2. Incubeer de oplossing gedurende 15 minuten.
- Breng de embryo's naar de hypoxische kamer, verdeel ze gelijkmatig tussen de putten en incubeer gedurende 2 uur. Elke put kan tot 5 kikker embryo's van stadium 38 of maximaal 7 zebravis embryo's 4 dpf passen.
- Ontleed het embryoS voor EdU-opneming.
- Tijdscursus van embryo-incubatie in hypoxie en EdU-integratie
- Vul de gas incubatie kamer met 500 ml embryo medium van keuze. Sluit de gasleiding aan op de gascilinder die een gasmengsel van 5% O2 en 95% N2 bevat en het medium gedurende 15 minuten met het gasmengsel evenwaren.
- Breng de embryo's naar de hypoxische kamer, verdeel ze gelijkmatig tussen de putjes en incubeer voor de gewenste periode tot 48 uur. Voor de laatste 1 uur vervangt het embryo medium met 5 mM EdU oplossing aangevuld met 1% v / v DMSO.
- Breng de embryo's terug naar de normoxische schotel en analyseer voor EdU-incorporation.
- EdU-inbedrijfnemingsdetectie en analyse
- Anesthetiseer de embryo's door te zwemmen in 0,4 mg / ml MS222 oplossing.
- Breng de embryo's over naar een geschikte glazen fles en bevestig door incubatie in fixatieoplossing voor 2 haT RT of O / N bij 4 ° C. Volg met 3 x 10 min wast in PBS. Breng de embryo's zorgvuldig over naar de sucroseoplossing voor weefselcryoprotectie. Incubeer gedurende 4 uur of tot de embryo's naar de bodem van de glazen fles zinken.
- Bevestig de embryo's in embedding medium (optimale snijtemperatuur verbinding). Kryosectie blokkeert met embryo's onmiddellijk of opslaan voor maximaal 14 d bij -80 ° C.
- Kryosectie de blokken die embryo's bevatten met behulp van een cryostat. Verzamel secties van 12 μm (zebravis embryo's) of 16 μm (kikker embryo's) dikte op microscoop dia's en laten drogen. Proces cryosecties onmiddellijk of opslaan bij -20 ° C gedurende maximaal 3 maanden.
- Detecteer EdU-incorporation door immunofluorescente kleuring met behulp van een commerciële chemische kit. Bereid de hoeveelheid EdU Reaction Mix die nodig is voor het aantal cryosecties in het experiment, zoals beschreven door de fabrikant.
- Voor 500 μL EdU Reaction Mix gebruiken 430 μL 1X EdU reactiebuffer, 20 μl CuSO4, 1,2 μL Alexa Fluor azide, 50 μl 1X EdU bufferadditief.
- Was de cryosecties eenmaal met PBS om het embeddingsmedium en 3 x 5 min met PBST te verwijderen om het weefsel te permeabiliseren. Incubeer de cryosecties in blokkerende oplossing gedurende 30 minuten.
- Incubeer de cryosecties met de EdU Reaction Mix gedurende 1 uur en gevolgd door 3 x 10 minuten wast in PBST. Behandel de cryosecties met DAPI-oplossing gedurende 15 minuten, gevolgd door 3 x 10 minuten wast in PBST. Monteer de glijbanen met gekleurde cryosecties in montagemedium, bedek met dekglazen en laat het drogen alvorens te analyseren onder een fluorescerende microscoop of voor maximaal 1 jaar bij 4 ° C te bewaren.
- Analyseer de cryosecties met anti-EdU-kleuring onder een omgekeerde confocale scanmicroscoop en bepaal het aantal EdU-positieve cellen met behulp van digitale kwantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door gebruik te maken van het hypoxische kamer systeem dat we hier presenteren, kunt u de effecten van hypoxie individueel en in vivo in hele levende dieren bestuderen. Hypoxie kan worden geïnduceerd door hele embryo's van kikker of zebravis in de hypoxische kamer te plaatsen ( Figuur 1 ) en worden onderworpen aan verschillende combinaties van omstandigheden. Een afbeelding van onze voltooide gaskameropstelling is in figuur 2 weergegeven . We hebben de zuurstofconcentratie in het incubatiemedium gecontroleerd met behulp van een glasvezelsensor (2.1.9) op verschillende tijdspunten tijdens het experiment. Deze gegevens wijzen erop dat we door onze experimenten stabiele hypoxie (6-6,5% opgeloste zuurstof) hebben geïnduceerd ( tabel 1 ).
Eerst hebben we alomtegenwoordige en retinale niveaus van HIF-1a in normoxia en in hypoxie beoordeeld, zoals in onze hypoxische kamer geïnduceerd. HIF-1αIs een eiwit dat gestabiliseerd wordt onder lage zuurstofconcentraties. We hebben HIF-1a-niveaus gemeten in embryo-lysaten van hele kikker die onder normale zuurstofconcentratie werden gehouden of onderworpen aan 5% hypoxie en in lysaten van hun geïsoleerde retina's. Zoals getoond in Figuur 3 , wordt HIF-1a onder hypoxie gestabiliseerd in zowel hele embryo's als in retina. De stabilisatie van HIF-1a wordt bereikt in verschillende putjes van de mesh-bodem incubatieplaat ( Figuur S1 ).
Zoals we eerder hebben aangetoond, heeft hypoxie invloed op proliferatie van retinale stamcellen voorlopers in de ciliaire marginale zone (CMZ) van het retina 13 . Zo is het toezicht op de proliferatie in het CMZ door middel van EdU-incorporatie een goede marker voor succesvolle inductie van hypoxie. Wij incuberen embryo's in een hypoxische kamer die bij 5% zuurstof wordt gehandhaafd en de retinale proliferatie beoordeelde zoals beschreven in Stap 4.2. Zoals verwachtEd, normoxische controle retinas liet intense EdU-kleuring zien in de CMZ, waar prolifererende voorvaders zich bevinden in zowel kikker ( figuren 4B en 4D ) en zebravis embryo's ( figuren 5A en 5C ). Na zuurstofafwijking in de hypoxische kamer werd een sterke afname van CMZ-stamvader proliferatie waargenomen in zowel kikker ( figuren 4C-4D ) en zebravis embryo's (figuren 5B, 5C). Om de omvang van het effect te bepalen, hebben we een tijdsoort uitgevoerd, waarbij de embryo's in hypoxische kamer gedurende langere perioden van maximaal 24 uur geïncubeerd worden, waarbij de proliferatie door EdU-integratie wordt onderzocht zoals beschreven in stap 4.3. We zouden kunnen aantonen dat de afname in retinale proliferatie proliferatie acuut en best binnen 2 uur was, en bleef gedurende vele uren volhouden ( Figuur 4D ), terwijl embryo's normaal ontwikkeld werden volgens hun ontwikkelingsfase. Dit resultaat suggereert dat ons systeem efficiënt hypoxie kan induceren in een target tiVan belang, op korte incubatietijden, evenals deze omstandigheden gedurende langere perioden onderhouden, terwijl de normale embryoontwikkeling wordt ondersteund.
Figuur 1: Schematische representatie van de experimentele gaskamerinstelling. ( A ) aquatische aquarium (22) x 10,5 cm (breedte) x 10,5 cm (hoogte)) ( B ) 24-brusselplaat met natte bodem (12,8 x 8,6 x 1,7 x 1,5 cm diameter) Filter met een maasdiameter van 0,1-0,2 mm ( D ) tunnels van 10 (lengte) x 5 mm (diameter) ( E ) Teflon of PVC staven met geschikte diameter en 30 mm lengte ( F ) De gewenste zuurstof / CO 2 -mengsel ( H ) verdelerklep ( I ) gasventiel ( J ) cerAmic disc diffuser ( K ) tank deksel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een beeld van de experimentele gaskamerinstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Meting van zuurstofconcentratie bij verschillende incubatietijden in de gaskamer. Klik hier om een grotere versie van deze f te bekijken igure.
Figuur 3: HIF-1a-niveaus verhogen bij hypoxie-inductie in Xenopus embryo's en hun retina's. Western blots van eiwitlysaten uit hele embryo's ( A ) of uit geïsoleerde embryonale retina's ( B ) die onder normale zuurstofconcentraties of in hypoxie worden gehouden. Blots werden gescoord voor HIF-1a subeenheid en a-tubuline. Ten minste 5 embryo's of 22 retina's werden genomen voor elke aandoening ( n = 5) ( C, D ) Kwantificering van de Western blot uitgevoerd in respectievelijk ( A, B ). De eiwitgehalten van HIF-1a werden genormaliseerd aan het eiwitgehalte van a-tubuline. Foutstaven vertegenwoordigen standaardafwijkingen tussen experimenten. * P -waarde <0,05, *** p -waarde <0,001; N = 5.D / 55710 / 55710fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 4: Hypoxie vermindert proliferatie van progenitoren in de retinale stamcel Niche of Frog Embryos. ( A ) Schematische weergave van een dwarsdoorsnede via een 38-traps Xenopus retina, waarin de positie van de ciliaire marginale zone (CMZ) ( B , C ) EdU-incorporation wordt gemeten na een 2 u EdU-puls in DAPI-gekleurde retina's uit 38 stadium Kikker embryo's onder normoxia ( B ) of in de hypoxische kamer ( C ). Magenta = DAPI vlek; Grijs = EdU vlek. Schaalstaven = 50 μm ( D ) Kwantificering van het experiment uitgevoerd in B en C. Foutbanden vertegenwoordigen standaardafwijkingen. ***
Figuur 5: Hypoxie vermindert proliferatie van progenitoren in de retinale stamcel nis van 4 dpf zebravis embryo's. EdU-opname gemeten na een 2 u EdU-puls in DAPI-gekleurde retina's van 4 dpf oude WTE zebravis embryo'sEr normoxia ( A ) of in de hypoxische kamer ( B ). Magenta: DAPI vlek; Grijs: EdU vlek. Schaalstaven = 50 μm ( C ) Kwantificering van het experiment uitgevoerd in B en C. Foutbanden vertegenwoordigen standaardafwijkingen. *** p -waarde <0,001; N = 7. Voor elke conditie werden 10-15 retinas gekwantificeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend Figuur 1: HIF-1a-niveaus verhogen bij hypoxie-inductie consistent in verschillende putten van de plaat en tussen verschillende experimenten. Western blots van eiwitlysaten uit hele Xenopus embryo's onder normale zuurstofconcentraties ofIn twee verschillende putten van de hypoxische kamer onder inductie van hypoxie gedurende 2 uur in experiment 1 ( A ) of in experiment 2 ( B ). Blots werden gescoord voor HIF-1a subeenheid en a-tubuline. 5 kikker embryo's van stadium 38 werden voor elke conditie genomen. Experimenten 1 en 2 zijn onafhankelijke biologische replicaten ( C, D ) Kwantificering van de Western blots uitgevoerd in respectievelijk ( A, B ). De eiwitgehalten van HIF-1a werden genormaliseerd aan het eiwitgehalte van a-tubuline. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we een makkelijke maar robuuste nieuwe methode voorgesteld om hypoxie in te stellen die is aangepast voor gebruik met kikker- en zebravis embryo's, maar kan ook geschikt zijn voor andere aquatische organismen. Het grote voordeel van deze methode ligt in zijn eenvoud en kostenefficiëntie. Niettemin zijn de met deze methode behaalde resultaten zeer robuust. We hebben aangetoond dat hypoxie efficiënt in de kamer kan worden geïnduceerd, zowel in volledige embryo's als in specifieke weefsels - hier, retina's. Om de effectiviteit van hypoxia-inductie te bepalen hebben we de niveaus van HIF-1a-eiwit in volledige embryo- en retinale lysaten gecontroleerd. Volgens onze resultaten kan hypoxie-inductie als succesvol beschouwd worden als een verhoging van de HIF-1a-niveaus 1 uur in de hypoxische kamer kan worden waargenomen in vergelijking met normoxische controle en genormaliseerd tot globale eiwitniveaus, bijvoorbeeld met behulp van α-tubulinniveaus Als controle. We bevestigden de activiteit van hypoxie in weefsel door het controleren van stamcel proliferatieAtion in retinas door EdU incorporation en zou kunnen tonen, in overeenstemming met onze eerder gepubliceerde resultaten 13 , dat hypoxie geïnduceerd met behulp van de hier gepresenteerde setup leidt tot een afname van retinale stamcellen proliferatie in zowel kikker- als zebravis embryo's.
Een van de kritieke stappen van dit protocol is om ervoor te zorgen dat de hypoxische kamer goed afgesloten is. Het wordt bereikt door gebruik te maken van een passende afdichting op het deksel van de tank, die in ons geval siliconen vet was. Daarnaast zal plaatsing in een incubator helpen om lekkage van atmosferische zuurstof in de kamer te vermijden, door een extra barrière te verschaffen. Een meting van zuurstofconcentratie met een passende sonde of elektrode zorgt er ook voor dat de hypoxische zuurstofgehaltes stabiel blijven en zonder schommelingen. Daarnaast moet voorzichtig zijn met het openen van de kamer voor langere tijdsperioden, terwijl oplossingen of monsters tussen experimenten worden uitgewisseld.
Gezien snelle evenwichtIbration tijden van 10 tot 15 minuten voor hypoxie vestiging, is er maar een klein deel van het gasmengsel nodig en een lage gasstroomsnelheid nodig om het systeem zelfs voor langere perioden te behouden dan beschreven in de representatieve resultaten (24 uur). De oplossingen die in het experiment worden gebruikt, dienen vooraf gelijkwaardig te zijn om hypoxie gedurende 15 minuten voorafgaand aan incubatie in de kamer te bereiken (zoals beschreven in 4.2.1). We hebben de hypoxische kamer gedurende 48 uur van constante hypoxie gebruikt zonder fouten, zoals blijkt uit onze zuurstofconcentratiemetingen ( tabel 1 ). Opgemerkt moet worden dat de juiste gasdiffusie tijdens langere incubatietijden gecontroleerd moet worden. Tenslotte moet er rekening gehouden worden met het plaatsen van de embryo's in de putjes (stap 2.2.1.) Om vermenging van embryo's van verschillende mutantdieren / experimentele omstandigheden te vermijden. Dit is vrij eenvoudig te bereiken gezien de relatief hoge muren van de enkele putjes van de plaat.
Ondanks dat het eenvoudig maar effectief isEn robuust systeem voor hypoxie-inductie, heeft het gebruik van de hier beschreven kamer een nadeel voor experimenten die gebruik maken van dure incubatieoplossingen en media. Het minimale volume media in de kamertank mag niet onder 400 ml vallen. Wijzigingen kunnen echter aangepast worden aan lagere volumes: we hebben de lengte van de stangen ( figuur 1E ) aan de plaat (2.1.4 en 4.2.1) aangepast, zodat we alleen 50 ml media / oplossing . Hoewel deze niet ideaal is voor langere incubatietijden, kan deze opstelling hetzelfde gaspijp passen en kan ze afdicht worden om voldoende hypoxie gedurende maximaal 8 uur te waarborgen.
Gecombineerd, onze gaskamer setup kan worden gebruikt voor gebruik met elk aquatisch model organisme en is afgescheiden van andere soortgelijke commercieel beschikbare systemen door zijn eenvoud, kosteneffectiviteit en robuustheid. Eenmaal gecontroleerd, kan het worden gebruikt voor directe in vivo experimenten, in een bepaalde periode en onder een verlangenD gasatmosfeer met inbegrip van hypoxie, hyperoxie of andere gasmengsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Support from Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z van WAH en de DFG-gemeenschap KH 376 / 1-1 toegekend aan HK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl/0.1x MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3/0.1x MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1x MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca(NO3)2/0.1x MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | CG10 | Frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | Gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | Aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | Gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | Hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | Hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | Hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | For embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | Embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | Tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | Tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4x Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4x Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4x Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10x TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | Tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | Tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Oxoid | BR0014G | 1x |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) | Sigma | G6767-100ml | Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | Embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | Mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
- Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
- Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude? Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
- Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
- Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
- Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
- Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
- Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
- Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
- Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
- Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
- Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Nieuwkoop, D. P., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
- McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).
