Summary
我々は、カエルやゼブラフィッシュの胚などの水生生物に使用するための新しい低酸素チャンバーシステムを紹介します。私たちのシステムはシンプルで頑丈で、費用効果が高く、インビボで48時間まで低酸素症の誘導と持続が可能です。低酸素症の有効性をモニターする2つの再現可能な方法を提示する。
Abstract
ここでは、カエルやゼブラフィッシュの胚などの水生生物における低酸素の影響を研究するために開発した低酸素誘導のための新しいシステムを紹介します。私たちのシステムは、簡単なセットアップを特長とするチャンバーで構成されていますが、実験ソリューションの中で特定の酸素濃度と温度を誘導し維持するには堅牢です。提示されたシステムは非常に費用対効果が高いが、高度に機能的であり、インビボおよび48時間までの様々な期間の直接的実験のための低酸素の誘導および持続を可能にする。
低酸素症の影響をモニターし、研究するために、全胚または特定の組織における低酸素誘導因子1アルファ（HIF-1α）のレベルの測定、および5-エチニル-2'-デオキシウリジンによる網膜幹細胞増殖の測定、デオキシウリジン（EdU）をDNAに組み込む。 HIF-1αレベルは、全胚または組織中の一般的な低酸素症マーカーとして働くことができるここでは胚性網膜です。胚性網膜の増殖細胞へのEdU取り込みは、低酸素誘導の特異的産物である。したがって、我々は、低酸素胚性網膜前駆細胞が、カエルおよびゼブラフィッシュの両方の胚の5％酸素下でのインキュベーションの1時間以内に増殖を減少させることを示した。
習得したら、私たちの設定は、小さな水生生物、直接的なインビボ実験、任意の所与の期間、正常、低酸素または高酸素酸素濃度下で、または任意の他の所定のガス混合物で使用することができる。
Introduction
低酸素症の研究には多くの用途があります。これらには、低酸素症1および急性高病気2を特徴とする病状の病因の調査および治療の開発が含まれる2 。低酸素ストレスは、酸素を必要とする全ての生物において主要な代謝変化を引き起こす。低酸素ストレスは、子宮内発育制限を含むいくつかのヒト疾患の胎児の成長および発育および病因にも影響する3 。低酸素ストレスは、出生時体重、胎児および新生児死亡率の低下につながるだけでなく、心血管疾患、2型糖尿病、肥満および高血圧のような成人においても多くの合併症を引き起こす可能性があります4 。低酸素ストレスは、腫瘍組織がその血液供給を超えて増殖する固形腫瘍発生の間にしばしば観察される。したがって、インビボでの低酸素症の影響を直接的に調べることが重要であるヨニック開発。
発生中の低酸素の影響を研究するために用いられてきた最もよく知られている方法の中には、増殖培地中での塩化コバルトの使用または低酸素室での生物のインキュベーションがある。塩化コバルトは、低酸素誘導性因子-1アルファ（HIF-1α）のプロテオソーム分解を防止することによる安定化の役割のために、通常の酸素濃度下で人工的に低酸素応答を誘導する5,6,7。しかしながら、簡便な方法8であることから、塩化コバルトおよび他の同様の化学的低酸素擬態物の使用は、細胞および組織、 例えばアポトーシス9に非特異的有害な効果を有し得る。したがって、低酸素室は、正常な発達過程を経て、生体内の「自然低酸素症」を誘導するより良い方法です。
ntent ">水生動物胚の低酸素誘導系の開発に注力してきたカエルとゼブラフィッシュの両方は、様々な生物学的過程の研究のための有益な脊椎動物モデル生物であり、様々なヒト疾患のモデルでもあります。母体の補償の合併症を排除し、外的に発達させ、母親の補償の合併症を排除することができます。また、早期開発により、環境因子を操作し、臓器形成における表現型の変化をリアルタイムで観察することができます。カエルとゼブラフィッシュの胚を用いて脊椎動物の発生に及ぼす低酸素の影響を研究することの主な利点は、酸素が迅速に胚に浸透するため、すべてのプロセスを直接監視することができることです。したがって、カエルおよびゼブラフィッシュでは、他のモデル生物とは対照的に、機能的脈管構造の存在または欠如を考慮することなく、目的の組織において特異的酸素濃度の影響を研究することができる。低酸素インキュベーションのための市販されているほとんどのセットアップは、比較的に大きく、それに対応して高いランニングコストを有するという欠点を有する。それらの初期初期費用およびガス消費量が高いことを除けば、一般的な低酸素症室の平衡および維持は、より大きなサイズおよび/または生物呼吸のためにこれらの室で自然に生じるガス勾配に対して一定の低酸素雰囲気の維持を必要とする。これにはガスファンと冷却装置の使用が必要となり、設備の追加が増え、研究者の手間がかかりにくくなり、実験手順が単純になります。対照的に、ここに示す設定は、比較的堅牢ですが、非常に費用対効果が高く、小さく、確立しやすく、f安定した低酸素雰囲気およびチャンバ内の材料および溶液の簡単な交換を可能にする。我々のシステムは、関心のある任意の水生生物に使用することができます。
私たちは、好都合に小さく、従って任意の特定の温度で実験手順を容易に可能にする共通の実験室インキュベータ内に置くことができる低酸素室を構築した。培地中の酸素濃度と同様に温度の便利な制御を提供することにより、市販の低酸素インキュベーターに対する我々のシステムの利点は、小型でコスト効率にある。したがって、大部分の研究室で利用可能な一般的な研究室用品を使用して設定することができ、高価な材料を必要としません。さらに、市販の低酸素インキュベーターとは異なり、我々のセットアップでは熱が発生せず、インキュベーターに入れた室温より低い温度での使用が可能です。ラ発生および代謝速度が温度に大きく依存するカエルおよび魚のような冷血生物の研究にとって特に重要である。
それにもかかわらず、当社のガスインキュベーションチャンバーは、非常に費用対効果が高く簡単に構築できるため、様々な低酸素状態または高酸素状態を確立する上で非常に用途が広く、膨大な数の実験条件に対して様々な培地および溶液を迅速かつ容易に投与できます。さらに、一般的に使用される皿または実験室用タンク10,11,12の代わりに24ウェルプレートを使用することにより、本発明者らのシステムはいくつかの変異体条件の観察および実験的処理を一度に可能にする。
低酸素症の正確な誘導を制御するために、我々はウエスタンブロット検出によってHIF-1αタンパク質のレベルをモニターした。さらに、インキュベーション前後の増殖細胞の数nは、低酸素症が組織に誘導されているかどうかを判定するために使用することができる。この方法は、胚性網膜幹細胞ニッチにおける増殖が低酸素症の誘発時に減少することを示す以前に発表された結果13に基づいている。したがって、本発明者らは、5-エチニル-2'-デオキシウリジン（EdU）を胚培地に添加し、新たに増殖する細胞のDNAへの取り込みを測定することによって、網膜幹細胞増殖のレベルをモニターした。
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Protocol
このプロトコールは、ケンブリッジ大学の動物保護ガイドラインに従う。
1.動物のメンテナンス
- カエルの胚
注：胚は、動物および実験施設によって飼育および維持することができます。ここでは、動物の維持管理の例を説明します。- 0.88mMのNaCl、10μMのKCl、24μMのNaHCO 3、100μMのHEPES、8.2μMのMgSO4,3.3μMのCa（NO 3 ） 2 、および4.1μMのCaCl 2 （pH7.6）を含む0.1x修飾バース溶液（MBS）溶液を調製する。 。
- 体外受精によりアフリカツメガエルの胚を得る。
- 産卵前に妊娠牝血清の性腺刺激ホルモンを1週間（60 IU）および12時間（500 IU）注射して、成体の女性アフリカツメガエル（ Xenopus laevis）で排卵を誘導する。
- ホモジナイズした男性精巣で卵母細胞を採取し、in vitroで受精させる。
- ライ16〜18℃で0.1x MBS中の胚を播種した。 Xenopus laevis 14の正常表に従って胚を準備する 。実験のために全体の生きている胚を選択することに注意してください。
- ゼブラフィッシュ胚
注：胚は、動物および実験施設によって飼育および維持することができます。ここでは、動物の維持管理の例を説明します。- 胚培地：5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl 2、0.33mM MgSO 4および0.00001％メチレンブルーを調製する。
- 26.5℃でWT AB株Danio rerioを維持し、繁殖させる。
- 受精の朝に胚を収集し、上記のように調製した胚培地で28℃で4日間の受精後（dpf）まで飼育し、先に記載したように選択して飼育する15 。
インビボでの低酸素の誘発
- 低酸素室の建設のために魚施設で通常使用される繁殖用水槽（ 図1A ）を使用する。このタンクは24穴プレートに適合している必要があります。
- 図1に示すように、メッシュボトム24ウェルプレートを準備する。この目的のためにフライス盤を使用して、 例えば 24ウェルプレート（ 図1B ）のプラスチック底面を取り外す。
- ウェルのプラスチックとプレートの壁との間の空間にエポキシ樹脂を充填する。メッシュ径0.1〜0.2mmのナイロンフィルター（ 図1C ）を樹脂被覆プラスチックに取り付け、プレートを完全に乾燥させます。
- 乾燥したら、長さ10mm、直径5mmのトンネルを3本または4本（ 図1D ）、樹脂およびメッシュでコーティングしたプレートの壁面に掘ります。プラスチック製またはテフロン製ロッドを取り付ける適切な直径および30mmの長さのトンネル（ 図1E ）をトンネルに入れ、選択したタンクにプレートを置きます。
- メッシュ底24ウェルプレートを選択した水槽に置きます。シリコーンチューブ（ 図1F ）を使用して、適切なガスレギュレータ（I）（BOC 200）を使用して、所望のO 2 / N 2混合物または選択された別のガス混合物をガスタンク（ 図1G ）バー）。ここで紹介する低酸素実験では、5％の酸素と95％のN 2の混合ガスを含むガスタンクを使用します。
- チャンバ媒体の酸素流量を毎秒0.0017-0.0019立方メートルに調整する。このガス流速下では、培地の擾乱はプレートのウェルには見られない。
- この目的のために高純度二段ガスレギュレータを使用してください。レギュレータを設定して内圧を下げるeガスタンク（1000~2500PSI）を、実験を通して、10psiの送達圧力に調整した。従って、このガス調整器の仕様によれば、実験を通じて0.00189立方メートル/秒の流量が達成された。
- シリコーンチューブとディストリビューターバルブを水槽内のセラミックディスクディフューザ（ 図1J ）に接続します。水槽を閉め、シリコングリース（ 図1K ）を塗って蓋を慎重に閉めます（ 図1と比較してください）。特定の室温以外の温度が必要な場合は、必要な温度の実験室インキュベーターに低酸素チャンバーを置きます。
- 実験で使用された胚のタイプに応じて、低酸素チャンバータンクに適切な胚培地を充填し、セラミックディスクディフューザを通してガス混合物を拡散させ始める。 10-15分平衡化する。
- thと平衡化した後所望の酸素混合物を測定し、オキシメーターまたは酸素プローブを用いて水中の酸素濃度を測定する。ここでは、この目的のために光ファイバーに酸素と温度センサーを溶存させたオキシメーターを使用します。
- 慎重に実験のための胚を選択し、低酸素インキュベーションのために全体と生きている胚を使用してください。ここでは、ステージ38のカエルまたはゼブラフィッシュの胚4 dpfをここに示した実験でカエルします。
- ガスインキュベーションチャンバーを含むインキュベーター（ 図1K ）に胚の皿を置き、インキュベーターの温度に平衡させます。
- 慎重に、プラスチックピペットを使用して、ガスインキュベーションチャンバーのメッシュの24ウェルプレート（ 図1B ）のウェルに胚を移す。プロトコール全体を通して、常に胚移植のためにプラスチックピペットを使用してください。
注：このプレートの各ウェルには、ステージ38の5匹のカエル胚または4dpfの7ゼブラフィッシュ胚まで。異なる遺伝子型を使用する場合は、ウェルに慎重にラベルを付けます。 - ガスインキュベーションチャンバーは、5時間または実験に合った長い時間、選択した混合ガスを用いて一定の注入を維持する。ここで5％O 2と95％N 2の混合物を使用してください。
- 胚をガスインキュベーションチャンバーから胚型に対応する酸素正常培地に注意深く移し、直ちにステップ3または4に進む。
- さらに正常酸素処理が必要な場合は、胚を胚の種類に対応する酸素正常培地に注意深く移す。
3. HIF-1αレベルのモニタリングによる低酸素誘導の制御
- 準備
- 0.1x MBS中の0.4mg / mL MS222溶液を調製する。
- ホモジナイズバッファーの調製：ラジオイムノ沈降アッセイバッファー（RIPA buffer）を使用し、プロテアーゼインヒビターでの実験に必要な緩衝液の量を最終濃度1：100 v / vに補う。
- ウエスタンブロットのための溶液を調製する。
- 425mMトリスpH8.0,40％v / vグリセロール、8％v / v SDS、4％v / vベータメルカプトエタノール、0.5％w / vブロモフェノールブルー、10mL総容量ddH 2 O.
- ランニングバッファー5倍を調製する：トリズマ塩基15g、グリシン72g、SDS5g、総容量1dH 2 O。
- トランスファーバッファーの調製：トリスア塩基2.66g、グリシン14.4g、100％メタノール200mL、総容量1dH 2 O。
- 10×TBST：5mL 1MトリスpH8.0,30mL 5M NaCl、2.5mLツイーン20,1L全容量H 2 Oを調製する。
- ブロッキング溶液：4％w / v脱脂粉乳を1x TBSTで調製する。
- 組織の収集
- 0.4mg / mLのMS222溶液で入浴することにより胚を麻酔するプラスチックピペットを用いてホモジナイゼーションバッファーを充填したプラスチック反応管に移す。胚あたり20μLのバッファーを使用してください。 HIF1αタンパク質レベルの有意な変化を決定するためには、ステージ38の少なくとも5匹のカエル胚または4dpfの7ゼブラフィッシュ胚が必要であることに留意されたい。
- 適切な組織ホモジナイザーまたは超音波処理装置を使用して組織を均質化する。遠心分離（15分; 13,000×g; 4℃）により残渣を除去する。
- あるいは、麻酔したカエル胚17から網膜を切開し、上記のようにホモジナイズする。 10個の網膜ごとに20μLのホモジナイゼーションバッファーを使用する。
- ピペットを用いて上清を取り、85℃で5分間変性させ、Laemmliゲルローディングバッファーを補充して1x v / vの最終濃度にします（ 例えば 、15μLのホモジネートに4倍のLaemmliバッファーを5μL添加する）。 Wesにこの上清を使用する-20℃でサンプルをブロットまたは凍結する。
- ウエスタンブロット
- ステップ3.2に記載のように調製した試料を、1x v / v泳動緩衝液を用いた電気泳動システム中のプレキャスト12％ゲルにロードする。タンパク質サイズ測定にはタンパク質ラダーを使用します。 1時間、トランスファーバッファー中のニトロセルロースメンブレン（0.45μm膜）にタンパク質を移し、4℃で氷上でパックします。
- ブロッキング緩衝液中で膜を60分間インキュベートする非特異的結合部位をブロックする。 1x TBSTで3回、10分間洗浄する。
- ウサギ抗HIF-1α抗体およびマウス抗α-チューブリンの1：100v / vおよび1：5000v / vに希釈した溶液中の膜を、ブロッキング溶液中、室温で2.5時間インキュベートする。 1x TBSTで3回、10分間洗浄する。
- 検出のために、ブロッキング溶液中で1：1000v / vに希釈したヤギ抗ウサギおよびヤギ抗マウスHRP結合抗体を1時間インキュベートする。1×TBSTで3×10分の洗浄を行い、市販のキットおよび選択した現像機を使用してHRP染色を視覚化する。
- デジタル定量化を用いてHIF1αタンパク質の量を定量する。
4.低酸素状態における細胞増殖のモニタリング
- 準備
- 選択した胚培地で5 mM EDU溶液を調製する。この溶液は直ちに使用するか、またはアリコートに分けて-20℃で6ヶ月間保存することができます。
- リン酸緩衝食塩水（PBS）を調製するか、PBSを商業的資源から購入する。 115℃で10分間オートクレーブする。
- EdUの組み込みの検出のための解決策を準備する。
- 固定溶液：PBS中の16％ホルムアルデヒドストック溶液4％v / vを調製する。
- スクロース溶液：PBS中30％w / vスクロースを調製する。
- PBST：PBS中の0.1％v / v Triton X-100を調製する。
- ブロッキング溶液の調製：10％v / v熱不活性化ヤギ血清（HIGS）をPBSTに入れた。
- DAPI溶液：PBST中の1：1000v / v 4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を調製する。
- EdU取り込みのための低酸素状態における胚の培養
- ガスインキュベーションチャンバーに、1％v / v DMSOを補充した5mM EdU溶液400〜500mLを充填する。実験の15分前に、実験で使用したのと同じガス混合物で溶液を予め平衡化する。インキュベーション溶液の体積は、より短いロッド（ 図1E ）をメッシュ底プレートに取り付けることによって最小限に抑えることができることに留意されたい。
- 5％O 2と95％N 2の混合ガスを含むガスボンベにガス配管を接続します。溶液を15分間インキュベートする。
- 胚を低酸素チャンバーに移し、それらをウェルの間に均等に分配し、2時間インキュベートする。各ウェルは、ステージ38の5匹のカエル胚または7ゼブラフィッシュ胚4 dpfまで適合することができる。
- 胚を分析するEdUの設立について
- 低酸素症およびEdU取り込みにおける胚インキュベーションの時間経過
- ガスインキュベーションチャンバーを、選択した胚培地500mLで満たす。 5％O 2と95％N 2の混合ガスを含むガスボンベにガス配管を接続し、15分間混合物で媒体を平衡化する。
- 胚を低酸素チャンバーに移し、それらをウェル間に均等に分配し、48時間まで所望の時間インキュベートする。最後の1時間、1％v / v DMSOを補充した5mM EdU溶液で胚培地を置換する。
- 胚を酸素正常な皿に戻し、EdUの取り込みを分析する。
- EdU組込みの検出と分析
- 0.4 mg / mLのMS222溶液で入浴することにより胚を麻酔する。
- 胚を適切なガラスバイアルに移し、固定溶液中で2ヘクタールt RTまたは4℃でO / N。 PBSで3回洗浄してください。組織の凍結保護のために胚を慎重にスクロース溶液に移す。胚がガラスバイアルの底に沈むまで、または4時間インキュベートする。
- 埋め込み培地（最適切断温度化合物）に胚を埋め込む。凍結切片は直ちに胚をブロックするか、-80℃で最大14日間保存する。
- クライオスタットを用いて胚を含むブロックを凍結切除する。顕微鏡スライド上に12μm（ゼブラフィッシュ胚）または16μm（カエル胚）の切片を集め、乾燥させる。即座に凍結切片を処理するか、-20℃で最大3ヶ月間保存する。
- 市販の化学キットを使用して免疫蛍光染色によりEdU取り込みを検出する。製造元の指示に従って、実験における凍結切片の数に必要な量のEdU反応混合物を調製する。
- 500μLのEdU反応混合物に対して、430μLの1X EdU反応緩衝液、20μLのCuSO 4、1.2μLのAlexa Fluorアジド、50μLの1×EdU緩衝液添加剤。
- cryosectionsを一度PBSで洗浄して包埋培地を除去し、PBSTで3×5分洗浄して組織を透過させる。ブロッキング溶液中の凍結切片を30分間インキュベートする。
- 凍結切片をEdU反応混合物と共に1時間インキュベートし、続いてPBST中で3×10分間洗浄する。凍結切片をDAPI溶液で15分間維持し、続いてPBST中で3×10分間洗浄する。スライドガラスを染色した凍結切片でマウント培地に載せ、カバーガラスで覆い、乾燥させてから蛍光顕微鏡下で分析するか、または4℃で最大1年間保存する。
- 凍結切片を倒立共焦点走査顕微鏡下で抗EdU染色で分析し、デジタル定量化を用いてEdU陽性細胞の数を決定する。
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Representative Results
ここに示す低酸素チャンバーシステムを採用することで、生きている動物全体で 、低酸素の影響を個々に、そしてインビボで調べることができます。低酸素症は、低酸素室（ 図1 ）にカエルまたはゼブラフィッシュの胚全体を置くことによって誘導することができ、異なる条件の組み合わせで行うことができます。完成したガスチャンバーのセットアップのイメージを図2に示します 。我々は、実験中の異なる時点で、光ファイバー酸素センサー（2.1.9）を用いてインキュベーション培地中の酸素濃度をモニターした。これらのデータは、本発明者らの実験を通して、安定した低酸素（6〜6.5％の溶存酸素）を誘導したことを示している（ 表1 ）。
まず、低酸素室で誘導される正常酸素状態および低酸素状態におけるHIF-1αの遍在性および網膜レベルを評価した。 HIF-1α低酸素濃度下で安定化されるタンパク質である。我々は、正常酸素濃度または5％低酸素状態に保たれたカエル胚溶解物全体およびそれらの孤立した網膜の溶解物中のHIF-1αレベルを測定した。 図3に示すように、HIF-1αは全胚および網膜の両方の低酸素下で安定化される。 HIF-1αの安定化は、メッシュ底部インキュベーションプレート（ 図S1 ）の異なるウェルで達成される。
我々が以前に示したように、低酸素症は、網膜13の毛様体縁領域（CMZ）における網膜幹細胞前駆体の増殖に影響を及ぼす。したがって、EdU取り込みによるCMZの増殖をモニタリングすることは、低酸素症をうまく誘導するための良いマーカーである。我々は、5％酸素で維持した低酸素室に胚をインキュベートし、ステップ4.2に記載のように網膜増殖を評価した。期待通り正常酸素対照の網膜は、増殖する前駆細胞がカエル（ 図4Bおよび4D ）およびゼブラフィッシュ胚（ 図5Aおよび5C ）の両方に存在するCMZにおいて強いEdU染色を示した。低酸素室における酸素欠乏後、カエル（ 図 4C〜4D）およびゼブラフィッシュ胚（図5B、5C）の両方でCMZ前駆細胞増殖の強力な減少が観察された。効果の程度を決定するために、我々は時間経過を実行し、低酸素室中の胚を最長24時間の長期間インキュベートし、ステップ4.3で述べたようにEdU取り込みによる増殖をモニターした。我々は、網膜前駆細胞増殖の減少が2時間以内に急性および最大であり、胚が発達段階に応じて正常に発達している間、数時間持続したことを示すことができた（ 図4D ）。この結果は、我々のシステムが標的tiにおいて低酸素を効率的に誘導できることを示唆している短期間のインキュベーション時間に加えて、正常な胚発生を支持しながら、これらの状態を長期間維持することができる。
図1：実験室のセットアップの概略図。 （ B ）メッシュボトム24ウェルプレート（12.8×8.6×1.7×1.5cmウェル径）（ C ）ナイロン（ A ）飼育水槽（縦22×横10×高さ10.5） （ E ）テフロン（登録商標）又は適切な直径及び30mmの長さのPVCロッド（ F ）シリコーンチューブ（ G ）ガスタンクを有する、0.1〜0.2mmのメッシュ直径（ D ）のトンネル所望の酸素/ CO 2混合物（ H ）分配弁（ I ）ガス弁（ J ）アミックディスクディフューザー（ K ）タンク蓋。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：実験室のセットアップ。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
表1： ガスチャンバーにおける異なるインキュベーション時間における酸素濃度の 測定 。 このfのより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください igure。
図3： アフリカツメガエル胚およびそれらの網膜における低酸素誘導時に増加するHIF-1αレベル。正常な酸素濃度または低酸素状態に保たれた全胚（ A ）または単離した胚性網膜（ B ）からのタンパク質溶解物のウェスタンブロット。ブロットをHIF-1αサブユニットおよびα-チューブリンについてプローブした。各条件（ n = 5）について、少なくとも5つの胚または22の網膜を採取した（ C、D ）（ A、B ）で行ったウエスタンブロットの定量。 HIF-1αのタンパク質レベルを、α-チューブリンのタンパク質レベルに対して正規化した。エラーバーは、実験間の標準偏差を表す。 * p値<0.05、*** p値<0.001; n = 5である。d / 55710 / 55710fig3large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：低酸素は、カエルの胚の網膜幹細胞ニッチにおける前駆細胞の増殖を減少させる。 （ A ）毛様体周辺ゾーン（CMZ）（ B 、 C ）の位置を示す、38ステージのXenopus網膜を通る断面の略図38ステージからDAPI染色された網膜における2時間のEdUパルス後に測定されたEdU取り込み（ B ）または低酸素室（ C ）に保たれたカエルの胚。マゼンタ= DAPI染色;グレー= EdU染色。スケールバー=50μm（ D ） BおよびCで行った実験の定量。エラーバーは標準偏差を表す。 ***
図5：低酸素症は、4 dpfゼブラフィッシュ胚の網膜幹細胞ニッチにおける前駆細胞の増殖を減少させる。 4 dpfのWTeゼブラフィッシュ胚からのDAPI染色された網膜における2時間のEdUパルス後に測定されたEdU取り込み（ A ）または低酸素室（ B ）にある。 マゼンタ：DAPI染色;灰色：EdU染色。スケールバー=50μm（ C ） BおよびCで行った実験の定量。エラーバーは標準偏差を表す。 *** p値<0.001; n = 7。各条件について、10〜15個の網膜を定量化した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
補足図1：HIF-1αレベルは、プレートの異なるウェルおよび異なる実験間で一貫して低酸素誘導に増加する。正常な酸素濃度で維持されたゼノプス胚全体からのタンパク質溶解物のウェスタンブロットまたは実験1（ A ）または実験2（ B ）において低酸素症の誘導下で2時間、低酸素室の2つの異なるウェルに投与した。ブロットをHIF-1αサブユニットおよびα-チューブリンについてプローブした。ステージ38の5匹のカエル胚を各条件について採取した。実験1および2は、それぞれ（ A、B ）で行ったウエスタンブロットの独立した生物学的複製（ C、D ）定量である。 HIF-1αのタンパク質レベルを、α-チューブリンのタンパク質レベルに対して正規化した。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、カエルやゼブラフィッシュの胚に使用するために調整された低酸素を誘発する簡単ではあるが堅牢な新しい方法を紹介しましたが、他の水生生物にも適しています。この方法の大きな利点は、その単純さとコスト効率にあります。それにもかかわらず、この方法で達成される結果は非常に頑強である。本発明者らは、全胚および特定の組織（ここでは網膜）において、低酸素がチャンバー内で効率的に誘導され得ることを示した。低酸素誘導の有効性を決定するために、我々は全胚および網膜溶解物中のHIF-1αタンパク質のレベルをモニターした。我々の結果によれば、HIF-1αレベルの上昇が正常酸素対照と比較して低酸素室で1時間に観察され、α-チューブリンレベルを用いて、 例えば全タンパク質レベルに標準化された場合、低酸素誘導が成功したと見ることができるコントロールとして。本発明者らは、幹細胞増殖因子をモニターすることにより、組織における低酸素症の活性を確認した我々の以前の公表された結果13に従って、ここに提示された設定を用いて誘発された低酸素症が、カエルおよびゼブラフィッシュの胚の両方で網膜幹細胞増殖の減少をもたらすことを示すことができた。
このプロトコルの重要なステップの1つは、低酸素チャンバーが適切にシールされていることを確認することです。このケースでは、シリコングリースであったタンク蓋に適切なシールを使用して行います。さらに、インキュベーター内に配置することで、追加の障壁を設けることによって、大気中の酸素がチャンバー内に漏れないようにすることができます。適切なプローブまたは電極を用いて酸素濃度を測定することにより、低酸素酸素レベルが安定しかつ変動なく維持されることも保証される。さらに、実験と実験の間で溶液やサンプルを交換しながら、チャンバーを長時間にわたって開かないように注意する必要があります。
速い平等低酸素発生のための10〜15分の校正時間は、代表的な結果（24時間）に記載されている時間よりも長い時間でもシステムを維持するために少量の混合ガスと低ガス流量が必要です。実験に使用した溶液は、チャンバ内でのインキュベーションの前に15分間低酸素状態を達成するように予め平衡化しておく必要があります（4.2.1項を参照）。我々は、酸素濃度の測定値からわかるように、一定の低酸素状態の48時間の期間にわたって低酸素室を使用しました（ 表1 ）。より長いインキュベーション時間の間、正しいガス拡散を制御しなければならないことに留意すべきである。最後に、異なる突然変異動物/実験条件からの胚の混合を避けるために、胚をウェルに置く間に注意を払うべきである（ステップ2.2.1）。これは、プレートの単一のウェルの比較的高い壁を考慮すると、達成するのが非常に簡単である。
シンプルだが効果的であるにもかかわらず低酸素誘導のための強力なシステムであるが、ここに記載されたチャンバーの使用は、高価なインキュベーション溶液および培地の使用を必要とする実験の欠点を有する。チャンバータンク内の培地の最小量は400 mLを下回るべきではありません。しかし、プレートに取り付けられたロッド（ 図1E ）の長さ（2.1.4および4.2.1）を調節することに成功し、培地/溶液の50mLのみを必要とするようにした。インキュベーション時間を長くするのに理想的ではありませんが、この設定は同じガス配管に適合し、適切に密封して8時間まで十分な低酸素を確保することができます。
まとめると、当社のガスチャンバーのセットアップは、あらゆる水生生物に使用することができ、そのシンプルさ、費用対効果および堅牢性によって、他の同様の市販のシステムとは区別されます。いったんマスターされると、それは直接のインビボ実験、任意の所与の期間および任意の欲求の下で使用することができる低酸素、高酸素または他のガス混合物を含むdガス雰囲気である。
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Disclosures
著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。
Acknowledgments
この作業はウェルカム・トラストSIA賞100329 / Z / 12 / ZからWAHへの支援とHKに授与されたDFGフェローシップKH 376 / 1-1
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl/0.1x MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3/0.1x MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1x MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca(NO3)2/0.1x MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | CG10 | Frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | Gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | Aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | Gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | Hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | Hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | Hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | For embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | Embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | Tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | Tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4x Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4x Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4x Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10x TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | Tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | Tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Oxoid | BR0014G | 1x |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) | Sigma | G6767-100ml | Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | Embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | Mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
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