Summary
Wir stellen ein neuartiges hypoxisches Kammersystem für die Verwendung mit Wasserorganismen wie Frosch und Zebrafisch-Embryonen vor. Unser System ist einfach, robust, kostengünstig und ermöglicht die Induktion und Aufrechterhaltung der Hypoxie in vivo und für bis zu 48 h. Wir präsentieren 2 reproduzierbare Methoden zur Überwachung der Wirksamkeit der Hypoxie.
Abstract
Hier stellen wir ein neuartiges System zur Hypoxie-Induktion vor, das wir entwickelt haben, um die Auswirkungen von Hypoxie in Wasserorganismen wie Frosch und Zebrafisch-Embryonen zu untersuchen. Unser System besteht aus einer Kammer mit einem einfachen Aufbau, der dennoch robust ist, um eine spezifische Sauerstoffkonzentration und Temperatur in jeder experimentellen Lösung der Wahl zu induzieren und aufrechtzuerhalten. Das dargestellte System ist sehr kostengünstig, aber hochfunktionell, ermöglicht die Induktion und Erhaltung von Hypoxie für direkte Experimente in vivo und für verschiedene Zeiträume bis zu 48 h.
Um die Wirkungen von Hypoxie zu überwachen und zu untersuchen, haben wir zwei Methoden angewendet - die Messung der Ebenen des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1alpha (HIF-1α) in ganzen Embryonen oder spezifischen Geweben und die Bestimmung der retinalen Stammzellproliferation durch 5-Ethinyl-2'- Desoxyuridin (EdU) Einarbeitung in die DNA. HIF-1α-Spiegel können als allgemeiner Hypoxie-Marker im ganzen Embryo oder Gewebe dienenDer Wahl, hier embryonale Netzhaut. EdU-Inkorporation in die proliferierenden Zellen der embryonalen Retina ist eine spezifische Ausgabe der Hypoxie-Induktion. So haben wir gezeigt, dass hypoxische embryonale Netzhautvorläufer die Proliferation innerhalb von 1 h der Inkubation unter 5% Sauerstoff sowohl von Frosch als auch von Zebrafischembryonen verringern.
Einmal gemeistert, kann unser Setup für die Verwendung mit kleinen aquatischen Modellorganismen, für direkte in vivo Experimente, jede gegebene Zeitspanne und unter normaler, hypoxischer oder hyperoxischer Sauerstoffkonzentration oder unter irgendeinem anderen Gasgemisch eingesetzt werden.
Introduction
Hypoxie-Forschung hat zahlreiche Anwendungen. Dazu gehören die Untersuchung der Pathogenese und die Entwicklung von Behandlungen für medizinische Zustände, die durch Hypoxie 1 und akute Höhenkrankheit gekennzeichnet sind 2 . Hypoxischer Stress verursacht große metabolische Veränderungen in allen Organismen, die Sauerstoff benötigen. Hypoxischer Stress beeinflusst auch das fetale Wachstum und die Entwicklung und die Pathogenese mehrerer menschlicher Krankheiten, einschließlich der intrauterinen Wachstumsbeschränkung 3 . Hypoxischer Stress kann nicht nur zu reduziertem Geburtsgewicht, fetaler und neonataler Mortalität führen, sondern kann auch zu vielen Komplikationen im Erwachsenenleben führen, wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-2-Diabetes, Fettleibigkeit und Hypertonie 4 . Ein hypoxischer Stress wird auch häufig während der soliden Tumorentwicklung beobachtet, wenn das Tumorgewebe seine Blutversorgung erweitert. Es ist daher entscheidend, die Auswirkungen von Hypoxie in vivo und direkt während der Embr Yonische Entwicklung.
Unter den bekanntesten Methoden, die zur Untersuchung von Wirkungen von Hypoxie während der Entwicklung angewendet wurden, ist die Verwendung von Kobaltchlorid im Wachstumsmedium oder die Inkubation des Organismus in einer hypoxischen Kammer. Kobaltchlorid induziert aufgrund seiner Rolle bei der Stabilisierung von hypoxieinduzierbarem Faktor-1 alpha (HIF-1α) durch die Verhinderung seines proteosomalen Abbaus 5 , 6 , 7 künstlich eine hypoxische Reaktion unter normaler Sauerstoffkonzentration. Allerdings kann die Verwendung von Cobaltchlorid sowie anderer ähnlicher chemischer Hypoxie-Mimetika eine unspezifische schädliche Wirkung auf Zellen und Gewebe, z . B. Apoptose 9, aufweisen . Daher sind hypoxische Kammern eine bessere Methode zur Induktion von "natürlicher Hypoxie" in lebenden Organismen durch den Verlauf der normalen Entwicklung.
Wir haben uns auf die Entwicklung eines Systems zur Induktion von Hypoxie in Wassertierembryonen konzentriert. Beide Frösche und Zebrafisch sind mittlerweile zu informativen Wirbeltiermodellorganismen für Studien zahlreicher biologischer Prozesse sowie zu Modellen für verschiedene menschliche Krankheiten geworden. Frosch- und Zebrafisch-Embryonen Entwickeln sich nach außen, eliminieren die Komplikation der mütterlichen Kompensation, und ein schneller Entwicklungsverlauf ermöglicht es, Umweltfaktoren zu manipulieren und die phänotypischen Veränderungen der Organbildung in Echtzeit zu beobachten. Darüber hinaus sind viele Komponenten großer Signaltransduktionswege in hohem Maße konserviert Diese Modellorganismen sind im Detail durch eine große Anzahl von Literatur charakterisiert worden. Der Hauptvorteil bei der Verwendung von Fröschen und Zebrafisch-Embryonen, um die Auswirkungen von Hypoxie auf die Wirbeltierentwicklung zu untersuchen, ist, dass alle Prozesse direkt überwacht werden können, da Sauerstoff schnell die Embryonen durchdringt. So, bei Fröschen und Zebrafisch, wie im Gegensatz zu anderen Modellorganismen wieMaus-Embryonen, kann der Einfluss einer spezifischen Sauerstoffkonzentration im interessierenden Gewebe untersucht werden, ohne die Anwesenheit oder den Mangel an funktionellem Gefäß zu berücksichtigen.Die meisten handelsüblichen Aufbauten für die hypoxische Inkubation haben den Nachteil, dass sie vergleichsweise groß sind und entsprechend hohe Betriebskosten aufweisen. Abgesehen von ihrem hohen anfänglichen Kosten- und Gasverbrauch erfordert die Äquilibrierung und die Aufrechterhaltung gemeinsamer Hypoxie-Kammern die Aufrechterhaltung einer konstanten hypoxischen Atmosphäre gegen den Gasgradienten, der in diesen Kammern aufgrund ihrer größeren und / oder organischen Atmung natürlich vorkommt. Dies erfordert die Verwendung von Gasventilatoren und ein Kühlsystem, das die Menge an zusätzlichen notwendigen Geräten erhöht, die Geschicklichkeit des Forschers beeinträchtigt und insgesamt die Einfachheit des experimentellen Verfahrens verringert. Im Gegensatz dazu ist das hier präsentierte Setup vergleichsweise robust, aber sehr kostengünstig, klein, einfach zu ermitteln und erlaubt fAst Gas-Äquilibrierung, stabile hypoxische Atmosphäre und einfacher Austausch von Materialien und Lösungen in der Kammer. Unser System kann für den Einsatz mit jedem aquatischen Modell Organismus von Interesse eingesetzt werden.
Wir haben eine hypoxische Kammer konstruiert, die bequem klein ist und daher in einem gemeinsamen Laborinkubator platziert werden kann, was leicht experimentelle Eingriffe bei einer bestimmten Temperatur ermöglicht. Durch die bequeme Kontrolle der Temperatur sowie der Sauerstoffkonzentration im Medium liegt der Vorteil unseres Systems gegenüber den handelsüblichen Hypoxieinkubatoren in seiner geringen Größe und Kosteneffizienz. So kann unser Setup mit Hilfe von Laboratorien für die meisten Laboratorien eingerichtet werden und erfordert keine teuren Materialien. Darüber hinaus erzeugt unser Setup keine Hitze, im Gegensatz zu den handelsüblichen Hypoxie-Inkubatoren und ermöglicht die Verwendung bei Temperaturen unterhalb der Raumtemperatur in einem Inkubator. Das laSt ist besonders kritisch für die Arbeit mit kaltblütigen Organismen wie Frösche und Fische, wo Entwicklungs- und Stoffwechselraten stark temperaturabhängig sind.
Als sehr kostengünstig und leicht zu bauen ist unsere Gasinkubationskammer dennoch sehr vielseitig einsetzbar, um verschiedene hypoxische oder hyperoxische Zustände zu etablieren und eine schnelle und einfache Verabreichung unterschiedlicher Medien und Lösungen für eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht unser System die Verwendung einer 24-Well-Platte anstelle von üblicherweise verwendeten Speisen oder Labortanks 10 , 11 , 12. Unser System ermöglicht die Beobachtung und experimentelle Behandlung von mehreren Mutantenbedingungen auf einmal.
Um die korrekte Induktion der Hypoxie zu kontrollieren, haben wir die Niveaus des HIF-1α-Proteins durch Western-Blot-Detektion überwacht. Darüber hinaus ist die Anzahl der proliferierenden Zellen vor und nach der InkubationN in der hypoxischen Kammer kann verwendet werden, um festzustellen, ob Hypoxie im Gewebe induziert worden ist. Diese Methode basiert auf unseren bisher veröffentlichten Ergebnissen 13 , die zeigen, dass die Proliferation in der embryonalen retinalen Stammzellnische bei der Induktion der Hypoxie abnimmt. So haben wir das Niveau der Retinal-Stammzell-Proliferation durch Zugabe von 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU) zum Embryonemedium überwacht und deren Einarbeitung in die DNA von neu proliferierenden Zellen gemessen.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt den Tierschutzrichtlinien der Universität von Cambridge.
1. Tierpflege
- Frosch-Embryonen
ANMERKUNG: Embryonen können entsprechend der Tier- und Laboreinrichtung angehoben und gepflegt werden. Hier wird ein Beispiel für die Tierpflege beschrieben.- Vorbereitung der 0,1x modifizierten Barth-Lösung (MBS): 0,88 mM NaCl, 10 μM KCl, 24 μM NaHCO 3 , 100 μM HEPES, 8,2 μM MgSO 4 , 3,3 μM Ca (NO 3 ) 2 und 4,1 μM CaCl 2 , pH 7,6 .
- Erhält Xenopus laevis embryos durch In-vitro- Fertilisation.
- Den Eisprung in erwachsenen weiblichen afrikanischen Krallenfröschen ( Xenopus laevis) durch Injektion mit schwangerem Stutenserum Gonadotropin eine Woche (60 IE) und 12 h (500 IE) vor der Ei verlegen.
- Sammeln Sie Oozyten und befruchten sie in vitro mit homogenisiertem männlichen Hoden.
- RaiSe Embryonen in 0,1x MBS bei 16 - 18 ° C. Bühne die Embryonen nach der Normaltabelle von Xenopus laevis 14 . Achten Sie darauf, ganze und lebendige Embryonen für das Experiment auszuwählen.
- Zebrafisch-Embryonen
ANMERKUNG: Embryonen können entsprechend der Tier- und Laboreinrichtung angehoben und gepflegt werden. Hier wird ein Beispiel für die Tierpflege beschrieben.- Bereiten Sie Embryo-Medium vor: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 , 0,33 mM MgSO 4 und 0,00001% Methylenblau.
- Pflegen und züchten WT AB-Stamm Danio rerio bei 26,5 ° C.
- Sammeln Sie die Embryonen am Morgen der Befruchtung, erhöhen Sie bis 4 d Nachdüngung (dpf) bei 28 ° C in Embryo-Medium, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, wählen Sie und stufen Sie, wie zuvor beschrieben 15 .
2. Induktion von Hypoxie in vivo
- Verwenden Sie einen Zucht-Wassertank ( Abb. 1A ), der normalerweise in der Fischanlage für den hypoxischen Kammerbau verwendet wird. Dieser Tank sollte eine 24-Well-Platte passen.
- Bereiten Sie eine Maschen-Boden-24-Well-Platte vor, wie in Abbildung 1 dargestellt . Entfernen Sie den Kunststoffboden der 24-Well-Platte ( Abbildung 1B ), z . B. mit einer Fräsmaschine zu diesem Zweck.
- Füllen Sie den Raum zwischen dem Kunststoff der Brunnen und den Wänden der Platte mit Epoxidharz. Befestigen Sie jeden Nylonfilter ( Bild 1C ) mit einem Maschendurchmesser von 0,1-0,2 mm zum harzbeschichteten Kunststoff und lassen Sie die Platte vollständig trocken sein.
- Nach dem Trocknen bohren Sie drei oder vier Tunnel ( Abb. 1D ) von 10 mm Länge und 5 mm Durchmesser in die harz- und mesh-beschichteten Plattenwände. Kunststoff- oder Teflonstäbe anbringen( Abbildung 1E ) von geeigneter Durchmesser und 30 mm Länge zu den Tunneln und legen Sie die Platte in den Tank der Wahl.
- Legen Sie die Mesh-Boden 24-Well-Platte in den Wassertank der Wahl. Bei Verwendung eines Silikonschlauches ( Abbildung 1F ) einen Gasbehälter ( Bild 1G ) mit dem gewünschten O 2 / N 2 -Mischung oder einem anderen Gasgemisch der Wahl zu einem Verteilerventil ( Bild 1H ) unter Verwendung eines geeigneten Gasreglers (I) (BOC 200 Bar). Hier verwenden wir in den hier vorgestellten Hypoxie-Experimenten Gasbehälter mit einer Mischung aus 5% Sauerstoff und 95% N 2 .
- Stellen Sie den Sauerstoffdurchsatz im Kammermedium auf 0,0017-0.0019 Kubikmeter pro Sekunde ein. Unter dieser Gasströmungsrate sollte keine Störung des Mediums in den Wells der Platte gesehen werden.
- Verwenden Sie dazu den hochreinen zweistufigen Gasregler. Stellen Sie den Regler ein, um den Innendruck von th zu reduzierenE Gasbehälter (1000 - 2500 PSI) bis zu einem Förderdruck von 10 PSI während des gesamten Experiments. Somit wurde in Übereinstimmung mit den Spezifikationen dieses Gasreglers eine Durchflussrate von 0,00189 Kubikmetern pro Sekunde während des gesamten Experiments erreicht.
- Verbinden Sie den Silikonschlauch und das Verteilerventil mit einem Keramikscheiben-Diffusor ( Abbildung 1J ) im Inneren des Wassertanks. Schließen Sie den Wassertank und verschließen Sie den Deckel vorsichtig und beschichten Sie ihn mit Silikonfett ( Abbildung 1K ) (siehe Abbildung 1 ). Wenn eine bestimmte Nicht-Raumtemperatur erforderlich ist, legen Sie die Hypoxikammer in einen Laborinkubator der erforderlichen Temperatur.
- Abhängig von der Art der Embryonen, die in dem Experiment verwendet werden, füllen Sie den hypoxischen Kammerbehälter mit dem geeigneten Embryonemedium und beginnen, das Gasgemisch durch den keramischen Scheibendiffusor zu diffundieren. Äquilibrieren für 10-15 min.
- Nach dem Äquilibrieren mit thE gewünschte Sauerstoffmischung, Messung der Sauerstoffkonzentration im Wasser unter Verwendung eines Oxymeters oder einer Sauerstoffsonde. Hier verwenden Sie hierzu einen Oxymeter mit dem faseroptischen gelösten Sauerstoff- und Temperatursensor.
- Vorsichtig wählen Sie die Embryonen für das Experiment, verwenden Sie ganze und lebendige Embryonen für die Hypoxie Inkubation. Hier sind uns Frosch-Embryonen der Stufe 38 oder Zebrafisch-Embryonen 4 dpf in den hier vorgestellten Experimenten.
- Legen Sie die Embryo-Schalen in den Inkubator ( Abbildung 1K ), der die Gas-Inkubationskammer enthält, und lassen Sie sie sich auf die Temperatur des Inkubators ausgleichen.
- Sorgfältig die Embryonen in die Vertiefungen der Maschen 24-Well-Platte ( Abbildung 1B ) der Gasinkubationskammer unter Verwendung einer Plastikpipette überführen. Verwenden Sie immer eine Plastikpipette für den Embryotransfer während des gesamten Protokolls.
HINWEIS: Jeder Brunnen dieser Platte kann aufnehmenBis 5 Frosch-Embryonen der Stufe 38 oder bis zu 7 Zebrafisch-Embryonen von 4 dpf. Beschriften Sie die Brunnen sorgfältig, wenn Sie verschiedene Genotypen verwenden. - Halten Sie die Gasinkubationskammer unter einer konstanten Infusion mit dem Gasgemisch der Wahl für 5 h oder für eine längere Zeit, die dem Experiment entspricht. Verwenden Sie hier eine Mischung aus 5% O 2 und 95% N 2 .
- Sorgfältig die Embryonen aus der Gasinkubationskammer zurück in das dem Embryotyp entsprechende normoxische Medium übertragen und sofort mit den Schritten 3 oder 4 fortfahren.
- Wenn eine weitere normoxische Behandlung erforderlich ist, überträgt man die Embryos vorsichtig auf das dem Embryotyp entsprechende normoxische Medium.
3. Kontrolle der erfolgreichen Hypoxie-Induktion durch Überwachung von HIF-1α-Stufen
- Vorbereitungen
- 0,4 mg / ml MS222-Lösung in 0,1x MBS vorbereiten.
- Hygienepuffer vorbereiten: Radioimmunpräzipitationstestpuffer (RIPA bUffer) zur Homogenisierung des Gewebes und ergänzen die für den Versuch mit Protease Inhibitor notwendige Puffermenge auf eine Endkonzentration von 1: 100 V / V.
- Vorbereitung von Lösungen für Western Blot.
- 4x Laemmli-Gel-Beladungspuffer vorbereiten: 425 mM Tris pH 8,0, 40% v / v Glycerin, 8% v / v SDS, 4% v / v beta-Mercaptoethanol, 0,5% w / v Bromphenolblau, 10 mL Gesamtvolumen ddH 2 O.
- 5x Laufpuffer vorbereiten: 15 g Trizma-Base, 72 g Glycin, 5 g SDS, 1 l Gesamtvolumen ddH 2 O.
- Vorbereiten des Transferpuffers: 2,66 g Trizma-Base, 14,4 g Glycin, 200 ml 100% Methanol, 1 l Gesamtvolumen ddH 2 O.
- Vorbereitung 10x TBST: 5 ml 1 M Tris pH 8,0, 30 ml 5M NaCl, 2,5 ml Tween 20, 1 L Gesamtvolumen H 2 O.
- Vorbereiten der Sperrlösung: 4% w / v Magermilchpulver in 1x TBST.
- Sammlung von Gewebe
- Anästhesieren Sie die Embryonen durch Baden in 0,4 mg / ml MS222-Lösung16 , 17 und überführen sie in ein mit Homogenisierungspuffer gefülltes Plastikreaktionsrohr unter Verwendung einer Plastikpipette. 20 μl Puffer pro Embryo verwenden. Beachten Sie, dass mindestens 5 Frosch-Embryonen der Stufe 38 oder 7 Zebrafisch-Embryonen von 4 dpf erforderlich sind, um eine signifikante Veränderung der HIF1α-Proteingehalte zu bestimmen.
- Homogenisieren des Gewebes mit einem geeigneten Gewebehomogenisator oder einem Ultraschallgerät. Entfernen Sie den Schmutz durch Zentrifugation (15 min, 13.000 xg, 4 ° C).
- Alternativ zerlegen Sie die Retinas aus den anästhesierten Froschembryonen 17 und homogenisieren wie oben. 20 μl Homogenisierungspuffer pro 10 Retinas verwenden.
- Nehmen Sie den Überstand mit einer Pipette, denaturieren bei 85 ° C für 5 min und ergänzen mit Laemmli Gelbeladungspuffer auf eine Endkonzentration von 1x v / v ( z. B. fügen Sie 5 μl 4x Laemmli-Puffer zu 15 μl Homogenat hinzu). Benutze diesen Überstand für die WesTern blot oder einfrieren die Proben bei -20 ° C.
- Westlicher Fleck
- Laden Sie die in Schritt 3.2 hergestellten Proben auf einem vorgefertigten 12% Gel in einem Elektrophoresesystem unter Verwendung von 1x V / V Laufpuffer. Verwenden Sie eine Proteinleiter zur Bestimmung der Proteingröße. Übertragen Sie die Proteine auf eine Nitrozellulosemembran (0,45 μm Membran) in Transferpuffer für 1 h, gepackt auf Eis bei 4 ° C, nach Herstellerprotokoll.
- Block unspezifische Bindungsstellen, die die Membran in Blocking Puffer für 60 min inkubieren. Folge mit 3 x 10 min wäscht in 1x TBST.
- Inkubieren der Membran in Lösungen von Kaninchen-Anti-HIF-1α-Antikörper und Maus-anti-α-Tubulin, verdünnt 1: 100 v / v bzw. 1: 5000 v / v in Blockierungslösung für 2,5 h bei RT. Folge mit 3 x 10 min wäscht in 1x TBST.
- Zur Detektion inkubieren in Ziegen-Anti-Kaninchen und Ziegen-anti-Maus HRP-konjugierte Antikörper 1: 1000 v / v in Blockierungslösung für 1 h verdünnt.Folgen Sie mit 3 x 10 min Wäschen in 1x TBST und visualisieren Sie die HRP-Färbung mit einem kommerziellen Kit und einer Entwickler-Maschine der Wahl.
- Quantifizierung der Menge an HIF1α-Protein mittels digitaler Quantifizierung.
4. Überwachung der Zellproliferation bei Hypoxie
- Vorbereitungen
- Bereiten Sie 5 mM EdU-Lösung im Embryo-Medium der Wahl vor. Die Lösung kann sofort oder aliquotiert und bei -20 ° C für bis zu 6 Monate gelagert werden.
- Phosphat-gepufferte Saline (PBS) vorbereiten oder PBS aus kommerziellen Ressourcen kaufen. Autoklav für 10 min bei 115 ° C.
- Vorbereitung von Lösungen für den Nachweis der EdU-Inkorporation.
- Fixierungslösung vorbereiten: 4% v / v von 16% Formaldehyd-Stammlösung in PBS.
- Saccharose-Lösung vorbereiten: 30% w / v Saccharose in PBS.
- Vorbereitung PBST: 0,1% v / v Triton X-100 in PBS.
- Vorbereiten Blockierungslösung: 10% v / v Hitze-inaktiviertes Ziegenserum (H.IGS) in PBST.
- DAPI-Lösung vorbereiten: 1: 1000 v / v 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) in PBST.
- Inkubation von Embryonen in Hypoxie für EdU-Inkorporation
- Füllen Sie die Gasinkubationskammer mit 400-500 ml 5 mM EdU-Lösung, ergänzt mit 1% V / V DMSO. Vor-equilibrieren der Lösung mit dem gleichen Gasgemisch, das in dem Experiment für 15 min vor dem Experiment verwendet wurde. Beachten Sie, dass das Volumen der Inkubationslösung minimiert werden kann, indem kürzere Stäbe ( Abbildung 1E ) an der Maschenbodenplatte befestigt werden.
- Verbinden Sie den Gasschlauch mit der Gasflasche, die ein Gasgemisch aus 5% O 2 und 95% N 2 enthält . Inkubieren Sie die Lösung für 15 min.
- Übertragen Sie die Embryos in die hypoxische Kammer, verteilen sie gleichmäßig zwischen den Brunnen und inkubieren für 2 h. Jeder Brunnen kann bis zu 5 Frosch-Embryonen der Stufe 38 oder bis zu 7 Zebrafisch-Embryonen 4 dpf.
- Analysiere den EmbryoS für EdU Eingliederung.
- Zeitverlauf der Embryo-Inkubation bei Hypoxie und EdU-Inkorporation
- Füllen Sie die Gas-Inkubationskammer mit 500 ml Embryo-Medium der Wahl. Verbinden Sie den Gasschlauch mit der Gasflasche, die ein Gasgemisch aus 5% O 2 und 95% N 2 enthält, und das Medium mit dem Gasgemisch für 15 min ausgleichen.
- Übertragen Sie die Embryos in die hypoxische Kammer und verteilen sie gleichmäßig zwischen die Vertiefungen und inkubieren für die gewünschte Zeitspanne bis zu 48 h. Für die letzten 1 h, ersetzen Sie das Embryo-Medium mit 5 mM EdU-Lösung, ergänzt mit 1% v / v DMSO.
- Übertragen Sie die Embryonen wieder auf die normoxische Schale und analysieren Sie für die EdU-Inkorporation.
- EdU-Inkorporationserkennung und -analyse
- Anästhesieren Sie die Embryonen durch Baden in 0,4 mg / ml MS222-Lösung.
- Die Embryonen in eine geeignete Glasampulle überführen und durch Inkubieren in Fixierlösung für 2 ha fixierenT RT oder O / N bei 4 ° C. Folgen Sie mit 3 x 10 min Waschungen in PBS. Sorgfältig die Embryonen auf die Saccharose-Lösung für die Gewebekryoprotektion übertragen. Inkubieren für 4 h oder bis die Embryonen auf den Boden der Glasampulle sinken.
- Einbetten der Embryonen in Einbettmedium (optimale Schneidtemperatur-Verbindung). Kryoseblöcke mit Embryonen sofort oder bis zu 14 d bei -80 ° C aufbewahren.
- Kryosektion der Blöcke mit Embryonen unter Verwendung eines Kryostaten. Sammeln Sie Abschnitte von 12 μm (Zebrafisch-Embryonen) oder 16 μm (Frosch-Embryos) Dicke auf Mikroskop-Objektträger und lassen Sie trocken. Kryosektionen sofort verarbeiten oder bei -20 ° C für bis zu 3 Monate lagern.
- Nachweis der EdU-Inkorporierung durch Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung eines handelsüblichen Chemiekits. Bereiten Sie die Menge an EdU Reaction Mix vor, die für die Anzahl der Kryosorten im Experiment notwendig ist, wie vom Hersteller beschrieben.
- Für 500 μl EdU-Reaktionsmischung 430 μl 1X EdU-Reaktionspuffer verwenden, 20 & mgr; l CuSO 4 , 1,2 & mgr; l Alexa Fluorazid, 50 & mgr; l 1X EdU-Pufferadditiv.
- Die Kryosorten einmal mit PBS waschen, um das Einbettungsmedium zu entfernen, und 3 x 5 min mit PBST, um das Gewebe zu permeabilisieren. Inkubieren Sie die Kryosorten in Blockierlösung für 30 min.
- Inkubieren Sie die Cryose mit dem EdU Reaction Mix für 1 h und gefolgt von 3 x 10 min Waschungen in PBST. Die Kryosektionen mit DAPI-Lösung für 15 min kochen lassen, gefolgt von 3 x 10 min Waschungen in PBST. Montieren Sie die Folien mit gefärbten Kryosorten in Montagemedium, decken Sie mit Deckgläschen ab und lassen Sie sie vor dem Analysieren unter einem Leuchtstoffmikroskop trocknen oder bei 4 ° C bis zu 1 Jahr aufbewahren.
- Analysieren Sie die Kryosorten mit Anti-EdU-Färbung unter einem invertierten konfokalen Rastermikroskop und bestimmen Sie die Anzahl der EdU-positiven Zellen mit digitaler Quantifizierung.
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Representative Results
Der Einsatz des hypoxischen Kammersystems, das wir hier vorstellen, erlaubt die Untersuchung der Wirkungen von Hypoxie einzeln und in vivo bei ganzen lebenden Tieren. Hypoxie kann durch die Platzierung von ganzen Frosch- oder Zebrafisch-Embryonen in die hypoxische Kammer induziert werden ( Abbildung 1 ) und wird bei verschiedenen Kombinationen von Bedingungen durchgeführt. Ein Bild unseres fertiggestellten Gaskammer-Aufbaus ist in Abbildung 2 dargestellt . Wir haben die Sauerstoffkonzentration im Inkubationsmedium unter Verwendung eines faseroptischen Sauerstoffsensors (2.1.9) zu verschiedenen Zeitpunkten während des Experiments überwacht. Diese Daten zeigen, dass wir während unserer Experimente eine stabile Hypoxie (6-6,5% aufgelöster Sauerstoff) induziert haben ( Tabelle 1 ).
Zuerst beurteilten wir sowohl allgegenwärtige als auch retinale Niveaus von HIF-1α in der Normoxie und in der Hypoxie, wie sie in unserer hypoxischen Kammer induziert wurden. HIF-1 & alpha;Ist ein Protein, das unter niedrigen Sauerstoffkonzentrationen stabilisiert wird. Wir messen HIF-1α-Spiegel in ganzen Frosch-Embryo-Lysaten, die unter normaler Sauerstoffkonzentration gehalten wurden oder einer 5% Hypoxie unterworfen wurden, und bei Lysaten ihrer isolierten Retinas. Wie in Abbildung 3 gezeigt , wird HIF-1α unter Hypoxie sowohl in ganzen Embryonen als auch in Retinas stabilisiert. Die Stabilisierung von HIF-1α wird in verschiedenen Vertiefungen der Inkubationsplatte des Mesh-Bodens erreicht ( Abbildung S1 ).
Wie wir bereits gezeigt haben, beeinflusst die Hypoxie die Proliferation von Stammzellen-Stammzellen-Vorläufern in der Ciliary Marginal Zone (CMZ) der Netzhaut 13 . So ist die Überwachung der Proliferation im CMZ mittels EdU-Inkorporation ein guter Marker für eine erfolgreiche Induktion von Hypoxie. Wir haben Embryonen in einer hypoxischen Kammer inkubiert, die bei 5% Sauerstoff gehalten wurde, und beurteilte die Netzhautproliferation, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Wie erwartetDie normoxischen Kontroll-Retinas zeigten eine intensive EdU-Färbung im CMZ, wo sich proliferierende Vorläufer sowohl im Frosch ( Fig. 4B und 4D ) als auch in den Zebrafisch-Embryonen befinden ( Fig. 5A und 5C ). Nach der Sauerstoffentzug in der hypoxischen Kammer wurde eine starke Abnahme der CMZ-Progenitor-Proliferation sowohl bei Frosch ( Fig. 4C-4D ) als auch bei Zebrafisch-Embryonen beobachtet (Fig. 5B, 5C). Um das Ausmaß der Wirkung zu bestimmen, führten wir einen Zeitverlauf durch, wobei die Embryonen in einer hypoxischen Kammer für längere Zeiträume von bis zu 24 Stunden inkubiert wurden, wobei die Proliferation durch EdU-Inkorporation, wie in Schritt 4.3 beschrieben, beobachtet wurde. Wir konnten zeigen, dass die Abnahme der Proliferation des Netzhautvorläufers innerhalb von 2 h akut und am stärksten war und für viele Stunden bestand ( Abbildung 4D ), während sich die Embryonen nach ihrer Entwicklungsstufe normal entwickelten. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass unser System effizient Hypoxie in einem Ziel ti induzieren kannSsue of interest, nach kurzen Inkubationszeiten sowie unterhalten diese Bedingungen für längere Zeiträume während der Unterstützung der normalen Embryo-Entwicklung.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der experimentellen Gaskammer-Einstellung. ( A ) Zucht-Wassertank (22 (Länge) x 10,5 (Breite) x 10,5 cm (Höhe)) ( B ) Mesh-Boden 24-Well-Platte (12,8 x 8,6 x 1,7 x 1,5 cm Bohrlochdurchmesser) ( C ) Nylon Filter mit einem Maschendurchmesser von 0,1-0,2 mm ( D ) Tunnel von 10 (Länge) x 5 mm (Durchmesser) ( E ) Teflon- oder PVC-Stäbe mit entsprechendem Durchmesser und 30 mm Länge ( F ) Silikonschlauch ( G ) Gasbehälter mit Das gewünschte Sauerstoff / CO 2 -Mischung ( H ) Verteilerventil ( I ) Gasventil ( J ) cerDichtung ( K ) Tankdeckel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Ein Bild des experimentellen Gaskammer-Setups. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: Messung der Sauerstoffkonzentration bei verschiedenen Inkubationszeiten in der Gaskammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen. F Igure
Abbildung 3: HIF-1α Ebenen Erhöhung der Hypoxie Induktion in Xenopus Embryonen und ihre Retinas. Western-Blots von Protein-Lysaten aus ganzen Embryonen ( A ) oder aus isolierten embryonalen Retinas ( B ) unter normalen Sauerstoffkonzentrationen oder in Hypoxie gehalten. Blots wurden für HIF-1 & agr; -Untereinheit und & agr; -Tubulin untersucht. Mindestens 5 Embryonen oder 22 Retinas wurden für jede Bedingung ( n = 5) ( C, D ) Quantifizierung des Western-Blots, der in ( A, B ) durchgeführt wurde, genommen. Die Proteingehalte von HIF-1 & agr; wurden auf die Proteingehalte von & agr; -Tubulin normalisiert. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen zwischen Experimenten dar. * P- Wert <0,05, *** p- Wert <0,001; N = 5D / 55710 / 55710fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Hypoxie verringert die Proliferation von Progenitoren in der Netzhaut-Stammzell-Nische von Frosch-Embryonen. ( A ) Schematische Darstellung eines Querschnitts durch eine 38-stufige Xenopus- Retina, die die Position der Ciliary-Randzone (CMZ) ( B , C ) EdU-Inkorporation anzeigt, gemessen nach einem 2 h EdU-Puls in DAPI-gefärbten Retinas ab 38 Stadium Frosch-Embryonen, die unter Normoxie ( B ) oder in der hypoxischen Kammer ( C ) gehalten werden. Magenta = DAPI-Fleck; Grau = EdU Fleck Maßstäbe = 50 μm ( D ) Quantifizierung des in B und C durchgeführten Experiments Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. ***
Abbildung 5: Hypoxie verringert die Proliferation von Progenitoren in der Netzhaut-Stammzell-Nische von 4 dpf Zebrafisch-Embryonen. EdU-Inkorporation gemessen nach einem 2 h EdU-Puls in DAPI-gefärbten Retinas von 4 dpf alten WTe Zebrafisch Embryonen gehalten undEr normoxia ( A ) oder in der hypoxischen Kammer ( B ). Magenta: DAPI-Fleck; Grau: EdU Fleck Skalenstäbe = 50 μm ( C ) Quantifizierung des in B und C durchgeführten Experiments Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. P- Wert <0,001; N = 7. Für jede Bedingung wurden 10-15 Retinas quantifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ergänzung Abbildung 1: HIF-1α Ebenen Erhöhung der Hypoxie Induktion konsequent in verschiedenen Brunnen der Platte und zwischen verschiedenen Experimenten. Western-Blots von Protein-Lysaten aus ganzen Xenopus- Embryonen unter normalen Sauerstoffkonzentrationen oderIn zwei verschiedenen Vertiefungen der hypoxischen Kammer unter Induktion von Hypoxie für 2 Stunden in Experiment 1 ( A ) oder in Experiment 2 ( B ). Blots wurden für HIF-1 & agr; -Untereinheit und & agr; -Tubulin untersucht. 5 Frosch-Embryonen der Stufe 38 wurden für jede Bedingung genommen. Experiment 1 und 2 sind unabhängige biologische Replikate ( C, D ) Quantifizierung der in ( A, B ) durchgeführten Western-Blots. Die Proteingehalte von HIF-1 & agr; wurden auf die Proteingehalte von & agr; -Tubulin normalisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier haben wir eine einfache, aber robuste neue Methode vorgestellt, um eine Hypoxie zu induzieren, die für den Einsatz mit Frosch- und Zebrafisch-Embryonen angepasst ist, aber auch für andere Wasserorganismen geeignet ist. Der wesentliche Vorteil dieser Methode liegt in ihrer Einfachheit und Kosteneffizienz. Dennoch sind die mit dieser Methode erzielten Ergebnisse sehr robust. Wir haben gezeigt, dass Hypoxie in der Kammer sowohl in ganzen Embryonen als auch in spezifischem Gewebe effizient induziert werden kann - hier, Retinas. Um die Wirksamkeit der Hypoxie-Induktion zu bestimmen, haben wir die Niveaus des HIF-1α-Proteins im ganzen Embryo und retinalen Lysaten überwacht. Nach unseren Ergebnissen kann die Hypoxie-Induktion als erfolgreich angesehen werden, wenn eine Erhöhung der HIF-1α-Spiegel bei 1 h in der hypoxischen Kammer im Vergleich zur normoxischen Kontrolle beobachtet und auf globale Proteinspiegel normiert werden kann, z . B. unter Verwendung von α-Tubulinspiegel Als Kontrolle. Wir bestätigten die Aktivität der Hypoxie im Gewebe durch die Überwachung der Stammzell-ProliferAtion in retinas durch EdU-Inkorporation und konnte in Übereinstimmung mit unseren bisher veröffentlichten Ergebnissen 13 zeigen , dass Hypoxie, die mit dem hier vorgestellten Setup induziert wird, zu einer Abnahme der Retinal-Stammzellproliferation sowohl bei Frosch- als auch bei Zebrafisch-Embryonen führt.
Einer der kritischen Schritte dieses Protokolls ist, um sicherzustellen, dass die hypoxische Kammer richtig versiegelt ist. Es wird durch die Verwendung einer geeigneten Dichtung auf dem Tankdeckel, die Silikonfett in unserem Fall war, erreicht. Darüber hinaus wird die Platzierung innerhalb eines Inkubators dazu beitragen, das Austreten von Luftsauerstoff in die Kammer zu vermeiden, indem eine zusätzliche Barriere bereitgestellt wird. Eine Messung der Sauerstoffkonzentration mit einer geeigneten Sonde oder Elektrode sorgt auch dafür, dass die hypoxischen Sauerstoffgehalte stabil und ohne Schwankungen gehalten werden. Darüber hinaus sollte darauf geachtet werden, dass die Kammeröffnung für lange Zeiträume beim Austausch von Lösungen oder Proben zwischen den Experimenten vermieden wird.
Gegebenes schnelles GleichgewichtIbrationszeiten von 10 - 15 min für die Hypoxie-Etablierung ist nur eine geringe Menge an Gasgemisch und ein geringer Gasdurchsatz erforderlich, um das System auch für längere Zeiträume zu erhalten, als in den repräsentativen Ergebnissen (24 h) beschrieben. Die in dem Experiment verwendeten Lösungen sollten vor der Inkubation in der Kammer (wie in 4.2.1 beschrieben) vorab äquilibriert werden, um eine Hypoxie für 15 Minuten zu erreichen. Wir haben die hypoxische Kammer über den Zeitraum von 48 h konstanter Hypoxie ohne Fehler aus unseren Sauerstoffkonzentrationsmessungen verwendet ( Tabelle 1 ). Es ist zu beachten, dass eine korrekte Gasdiffusion während längerer Inkubationszeiten kontrolliert werden muss. Schließlich ist darauf zu achten, dass die Embryonen in die Brunnen gelegt werden (Schritt 2.2.1), um das Mischen von Embryonen aus verschiedenen mutierten Tieren / experimentellen Bedingungen zu vermeiden. Dies ist durch die relativ hohen Wände der einzelnen Wannen der Platte ganz einfach zu erreichen.
Trotz einer einfachen, aber effektivenUnd robustes System für die Hypoxie-Induktion, die Verwendung der hier beschriebenen Kammer hat einen Nachteil für Experimente, die die Verwendung von teuren Inkubationslösungen und Medien erfordern. Das minimale Medienvolumen im Kammerbehälter sollte nicht unter 400 ml fallen. Anpassungen können jedoch auf geringere Volumina vorgenommen werden: Es ist uns gelungen, die Länge der Stäbe ( Abbildung 1E ) an der Platte (2.1.4 und 4.2.1) anzupassen, so dass wir nur 50 mL Medium / Lösung benötigen würden . Obwohl es nicht ideal für längere Inkubationszeiten ist, kann dieses Setup den gleichen Gasschlauch passen und kann entsprechend versiegelt werden, um eine ausreichende Hypoxie für bis zu 8 h zu gewährleisten.
Zusammengenommen kann unser Gaskammer-Setup für den Einsatz mit jedem aquatischen Modell-Organismus eingesetzt werden und wird von anderen ähnlichen kommerziell verfügbaren Systemen durch seine Einfachheit, Wirtschaftlichkeit und Robustheit getrennt. Einmal gemeistert, kann es für direkte in vivo Experimente, jede gegebene Zeit und unter jedem Wunsch verwendet werdenD Gasatmosphäre einschließlich Hypoxie, Hyperoxie oder andere Gasgemische.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Unterstützung von Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z an WAH und dem DFG-Stipendium KH 376 / 1-1 an HK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl/0.1x MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3/0.1x MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1x MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca(NO3)2/0.1x MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | CG10 | Frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | Gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | Aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | Gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | Hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | Hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | Hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | For embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | Embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | Tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | Tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4x Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4x Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4x Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10x TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | Tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | Tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Oxoid | BR0014G | 1x |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) | Sigma | G6767-100ml | Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | Embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | Mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
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