Summary
אנו מציגים מערכת קאמרית היפוקרטית חדש לשימוש עם אורגניזמים ימיים כגון צפרדע ועופות דג הזברה. המערכת שלנו היא פשוטה, חזקים, חסכונית ומאפשר אינדוקציה וקיימות של היפוקסיה in vivo ועד 48 שעות. אנו מציגים 2 שיטות לשחזור כדי לפקח על היעילות של היפוקסיה.
Abstract
כאן, אנו מציגים מערכת חדשנית לאינדוקציה היפוקסיה, אשר פיתחנו כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה באורגניזמים ימיים כגון צפרדע ועופות דג הזברה. המערכת שלנו כוללת חדר שמציעה התקנה פשוטה, כי הוא חזק בכל זאת כדי לשמר ולשמור על ריכוז חמצן מסוים הטמפרטורה בכל פתרון ניסיוני של בחירה. המערכת המוצגת היא מאוד חסכונית אבל פונקציונלי מאוד, זה מאפשר אינדוקציה וקיימות של היפוקסיה עבור ניסויים ישיר vivo ו לתקופות זמן שונות עד 48 שעות.
כדי לבחון ולחקור את ההשפעות של היפוקסיה, השתמשנו בשתי שיטות - מדידת רמות של גורם היפוקסיה-גורם להופעת אלפא (HIF-1α) בעוברים שלמים או רקמות ספציפיות וקביעת התאמת תאי גזע ברשתית באמצעות 5-ethynyl-2'- Deoxyuridine (Edu) שילוב לתוך ה- DNA. רמות HIF-1α יכולות לשמש סמן היפוקסיה כללי בכל העובר או הרקמותשל בחירה, כאן רשתית עובריים. שילוב EDU לתוך תאים מתרבים של הרשתית עובריים הוא פלט מסוים של אינדוקציה היפוקסיה. לכן, הראינו כי אבות הרשתית היפוקסי ירידה התפשטות תוך 1 שעה של הדגירה תחת 5% חמצן של עוברי הצפרדע וגם דג הזברה.
לאחר השתלבותנו, ניתן להשתמש בהתקנה שלנו לשימוש עם אורגניזמים קטנים של מודלים ימיים, בניסויים ישירים של vivo , בכל תקופת זמן נתונה ובתת-חמצן נורמלי, היפוקסי או היפר-חמצני או תחת כל תערובת גז נתונה אחרת.
Introduction
מחקר Hypoxia יש יישומים רבים. אלה כוללים לחקור את הפתוגנזה ולפתח טיפולים למצבים רפואיים המאופיינים בהיפוקסיה 1 ומחלת גבהים גבוהה 2 . מתח היפוקסי גורם לשינויים מטבוליים משמעותיים בכל האורגניזמים הדורשים חמצן. הלחץ ההיפוקסי משפיע גם על התפתחות העובר ועל התפתחות המחלה ועל מספר מחלות אנושיות, כולל הגבלת צמיחה תוך רחמית. מתח היפוסי אינו יכול רק לגרום לירידה במשקל הלידה, לתמותה בעובר ולילוד, אלא גם לגרום לסיבוכים רבים בחיים הבוגרים, כגון מחלות לב וכלי דם, סוכרת מסוג 2, השמנת יתר ויתר לחץ דם 4 . לחץ היפוקסי הוא גם נצפה לעתים קרובות במהלך התפתחות הגידול מוצק, כאשר רקמת הגידול מתגבר אספקת הדם שלה. לכן חיוני כדי להיות מסוגל ללמוד את ההשפעות של היפוקסיה in vivo ו ישירות במהלך embr יונית פיתוח.
בין השיטות הידועות ביותר אשר הועסקו במחקר ההשפעות של היפוקסיה במהלך הפיתוח הוא השימוש של כלור קובלט במדיום הצמיחה או הדגירה של האורגניזם בחדר היפוקסי. קובלט כלוריד גורם באופן מלאכותי תגובה היפוקסית תחת ריכוז החמצן הרגיל, בשל תפקידה בייצוב של גורם היפוקסיה גורם 1 אלפא (HIF-1α) על ידי מניעת השפלה פרוטאוזומלית שלה 5 , 6 , 7 . עם זאת, להיות שיטה נוחה 8 , את השימוש של כלוריד קובלט, כמו גם אחרים דומים היפוקסיה כימית mimetics יכול להיות השפעה מזיקה unspecific על תאים ורקמות, למשל , אפופטוזיס 9 . לכן, תאים hypoxic הם שיטה טובה יותר עבור אינדוקציה של "היפוקסיה טבעית" באורגניזמים חיים במהלך ההתפתחות הרגילה.
"אנחנו מתמקדים בפיתוח מערכת לאינדוקציה של היפוקסיה בעוברי בעלי חיים ימיים, הן צפרדעים והן דג הזברה הפכו כעת לאורגניזמים של מודל חוליות אינפורמטיבי למחקרים על תהליכים ביולוגיים רבים, כמו גם מודלים למחלות שונות של בני אדם.צפרדעים ועופות דג הזברה מתפתחת חיצונית ומבטלת את הסיבוך של הפיצוי האימהי.כמובן, מסלול מהיר של פיתוח מאפשר לתמרן גורמים סביבתיים ולבחון את השינויים פנוטיפי של היווצרות איברים בזמן אמת.בנוסף, מרכיבים רבים של מסלולי התמרת האות העיקריים נשמרים מאוד ב אלה אורגניזמים מודל מאופיינים בפירוט על ידי גוף גדול של הספרות.היתרון העיקרי באמצעות צפרדעים ועובדי דג הזברה ללמוד את ההשפעות של היפוקסיה על התפתחות החולייתנים היא שכל התהליכים ניתן לפקח ישירות, שכן החמצן חודר במהירות העוברים. לפיכך, צפרדעים דג הזברה, בניגוד אורגניזמים מודל אחרים כגוןעכברים העכבר, ההשפעה של ריכוז חמצן מסוים ניתן ללמוד רקמות של עניין, מבלי לקחת בחשבון את נוכחות או חוסר של כלי הדם תפקודית.רוב setups זמין מסחרית עבור הדגירה hypoxic יש את החיסרון להיות גדול יחסית ויש עלויות ריצה גבוהות בהתאמה. מלבד העלות הראשונית הגבוהה שלהם וצריכת הגז, שיווי משקל ותחזוקה של תאי היפוקסיה נפוצים מחייבת שמירה על אווירה היפוקסית מתמדת כנגד התדרדרות הגז המתרחשת באופן טבעי בתאי אלה בגלל הגודל הגדול יותר ו / או הנשימה של האורגניזם. זה דורש תעסוקה של מאווררי גז ומערכת קירור, אשר מגדיל את כמות הציוד הדרוש נוסף, מעכב את המיומנות של החוקר הכוללת מקטין את הפשטות של הליך ניסיוני. לעומת זאת, את ההתקנה אנו מציגים כאן הוא חזק יחסית, אבל מאוד חסכונית, קטן, קל להקים ומאפשר fאסט גזיזת גז, אווירה hypoxic יציב חילופי פשוט של חומרים ופתרונות בתוך החדר. המערכת שלנו יכול להיות מועסק לשימוש עם כל אורגניזם מודל ימיים של עניין.
בנינו תא hypoxic כי הוא קטן בנוחות ולכן ניתן להציב בתוך חממה משותפת, אשר בקלות מאפשר הליכים ניסיוניים בכל טמפרטורה מסוימת. מתן שליטה נוחה בטמפרטורה כמו גם ריכוז החמצן במדיום, היתרון של המערכת שלנו נגד חממות היפוקסיה זמין מסחרית טמון בגודלו הקטן ויעילות העלות. לפיכך, ההתקנה שלנו ניתן להקים באמצעות ציוד מעבדה כללית זמין עבור רוב המעבדות מחקר אינו דורש שום חומרים יקרים. בנוסף, ההתקנה שלנו אינה מייצרת חום, בניגוד החסרונות זמינים מסחרית היפוקסיה, ומאפשר להשתמש בטמפרטורות נמוכות יותר בטמפרטורת החדר להיות ממוקם באינקובטור. להSt הוא קריטי במיוחד עבור העבודה עם אורגניזמים קר דם כגון צפרדעים ודגים שבו שיעורי התפתחותיים מטבוליים תלויים מאוד בטמפרטורה.
להיות מאוד חסכונית ובנו בקלות, החדר הדגירה שלנו הוא עדיין תכליתי מאוד בהקמת שונים hypoxic או hyperoxic התנאים, כמו גם המאפשר מהיר וקל הממשל של מדיה שונים ופתרונות עבור מספר עצום של תנאי הניסוי. בנוסף, באמצעות צלחת 24-היטב במקום מנות נפוץ או טנקים מעבדה 10 , 11 , 12 , המערכת שלנו מאפשרת תצפית וטיפול ניסיוני של כמה תנאים מוטציה בבת אחת.
כדי לשלוט על אינדוקציה נכונה של היפוקסיה, יש לנו פיקוח על רמות של חלבון HIF-1α על ידי זיהוי כתם המערבי. בנוסף, מספר תאים מתרבים לפני ואחרי incubatioN בחדר היפוקסי ניתן להשתמש כדי לקבוע אם היפוקסיה כבר המושרה ברקמה. שיטה זו מבוססת על התוצאות שפורסמו בעבר 13 שלנו , מראה כי התפשטות עובריים בגזע נישה בתאי ניוון פוחתת על אינדוקציה של היפוקסיה. לכן, יש לנו פיקוח על רמת התפשטות תא גזע הרשתית על ידי הוספת 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) למדיום העובר ומדידת שילובו לתוך ה- DNA של תאים חדשים התפשטות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה עוקב אחר הנחיות טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת קיימברידג '.
1. אחזקת בעלי חיים
- עוברים צפרדע
הערה: עוברים ניתן להעלות ומתוחזק על פי החיה מתקן מעבדה. הנה, דוגמה של אחזקת בעלי חיים מתואר.- הכן פתרון של 0.1x מארת שינוי (MBS): 0.88 mM NaCl, 10 מיקרומטר KCl, 24 מיקרומטר NaHCO 3 , 100 מיקרומטר HEPES, 8.2 מיקרומטר MgSO 4 , 3.3 מיקרומטר Ca (NO 3 ) 2 , ו 4.1 מיקרומטר CaCl 2 , pH 7.6 .
- השג עוברי זנופוס לאביס על ידי הפריה חוץ גופית.
- לעורר ביוץ ב נקבה צפרדע צפרדע מבוגר נקבה ( Xenopus laevis) על ידי הזרקה עם סוסה בהריון gonadotropin בסרום שבוע אחד (60 IU) ו 12 שעות (500 IU) לפני הנחת ביצה.
- איסוף ביציות להפרות אותם במבחנה עם testis זכר homogenized.
- ראיעוברי SE ב 0.1x MBS ב 16 - 18 ° C. שלב העוברים על פי טבלה רגילה של Xenopus laevis 14 . הקפד בבחירת עוברי כל חי עבור הניסוי.
- דג הזברה
הערה: עוברים ניתן להעלות ומתוחזק על פי החיה מתקן מעבדה. הנה, דוגמה של אחזקת בעלי חיים מתואר.- הכן בינוני העובר: 5 מ"מ NaCl, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 מ"מ CaCl 2 , 0.33 מ"מ MgSO 4 , ו 0.00001% methylene כחול.
- לשמור ולגדול WT AB זן דניו rerio ב 26.5 ° C.
- איסוף העוברים בבוקר ההפריה, להעלות עד 4 ד הפוסט פוסט (dpf) ב 28 ° C בינוני העובר מוכן כמתואר לעיל, בחר בשלב כפי שתואר לעיל 15 .
2. אינדוקציה של היפוקסיה בשנת Vivo
- השתמש טנק מימיים רבייה ( איור 1 א ) המשמש בדרך כלל במתקן דגים לבנייה קאמרית היפוקסית. טנק זה צריך להתאים צלחת 24-היטב.
- הכן צלחת 24-היטב למטה רשת כפי שמתואר באיור 1 . הסר את הפלסטיק התחתון של צלחת 24 גם ( איור 1B ), למשל , באמצעות מכונת כרסום למטרה זו.
- ממלאים את החלל בין הפלסטיק של הבארות ואת הקירות של הצלחת עם שרף אפוקסי. צרף כל מסנן ניילון ( איור 1 ג ) עם קוטר רשת של 0.1-0.2 מ"מ על פלסטיק מצופה שרף ולאפשר את הצלחת להיות יבש לחלוטין.
- לאחר יבש, לקדוח שלוש או ארבע מנהרות ( איור 1D ) של 10 מ"מ אורך ו 5 מ"מ קוטר לתוך הצלחת שרף ו-צלחת קירות. צרף פלסטיק או מוטות טפלון( איור 1E ) של קוטר המתאים אורך 30 מ"מ למנהרות ומניחים את הצלחת לתוך הטנק של בחירה.
- מניחים את צלחת 24-היטב למטה רשת לתוך מיכל מים של בחירה. באמצעות צינור סיליקון ( איור 1F ), לצרף טנק גז ( איור 1G ) עם תערובת O 2 / N 2 הרצוי או תערובת גז אחרת של בחירה כדי שסתום מפיץ ( איור 1H ) באמצעות הרגולטור הגז המתאים (I) (BOC 200 בָּר). כאן, להשתמש במיכלי גז המכילים תערובת של 5% חמצן 95% N 2 בניסויים היפוקסיה המוצגת כאן.
- התאם את קצב זרימת החמצן בתא הקאמרי ל 0.0017-0.0019 מ"ק לשנייה. תחת זה קצב זרימת הגז, אין הפרעה של המדיום יש לראות את הבארות של הצלחת.
- השתמש טוהר גבוהה דו שלבי הגז בשלב זה למטרה זו. הגדר את הרגולטור כדי להפחית את הלחץ הפנימי של הטנק גז (1000 - 2500 PSI) ללחץ אספקה של 10 PSI לאורך כל הניסוי. לפיכך, בהתאם למפרטים של הרגולטור הגז, שיעור הזרימה של 0.00189 מטר מעוקב לשנייה הושג לאורך הניסוי.
- חבר את צינורות סיליקון ואת שסתום מפיץ כדי מפזר דיסק קרמי ( איור 1J ) בתוך מיכל המים. סגור את מיכל המים בזהירות לאטום את המכסה, ציפוי זה עם שמן סיליקון ( איור 1K ) (להשוות עם איור 1 ). אם טמפרטורה מסוימת לא החדר נדרש, מניחים את החדר hypoxic לתוך חממה מעבדה של טמפרטורה הנדרשת.
- בהתאם לסוג העוברים המשמשים בניסוי, למלא את הטנק קאמרית היפוקסית עם המדיום העובר המתאים ולהתחיל diffusing תערובת הגז דרך מפזר דיסק קרמי. לאזן עבור 10-15 דקות.
- לאחר איזון עם thE תערובת חמצן, למדוד את ריכוז החמצן במים באמצעות oxymeter או בדיקה חמצן. כאן, להשתמש אוקסימטר עם סיבים אופטיים מומס חמצן חיישן טמפרטורה למטרה זו.
- בזהירות לבחור את העוברים עבור הניסוי, להשתמש בעוברים שלמים וחי על הדגירה היפוקסיה. הנה, אנחנו עוברים צפרדע של שלב 38 או עוברי דג הזברה 4 dpf בניסויים המוצגים כאן.
- מניחים את העובר מנות לתוך האינקובטור ( איור 1K ) המכיל את החדר הדגירה גז ולתת להם לאזן את הטמפרטורה של החממה.
- בזהירות להעביר את העוברים לתוך הבארות של צלחת 24 צלחת היטב ( איור 1B ) של החדר דגירה גז, באמצעות פיפטה פלסטיק. השתמש תמיד פיפטה פלסטיק להעברת העובר לאורך הפרוטוקול.
הערה: כל טוב של צלחת זו יכולה להכילעד 5 עוברי צפרדע של שלב 38 או עד 7 עוברי דג הזברה של 4 dpf. תווית את הבארות בזהירות אם באמצעות גנוטיפים שונים. - שמור על תא הדגירה גז תחת עירוי קבוע עם תערובת הגז של בחירה במשך 5 שעות או במשך זמן רב יותר שמתאים לניסוי. השתמש תערובת של 5% O 2 ו - 95% N 2 כאן.
- בזהירות להעביר את העוברים מן החדר דגירה גז בחזרה בינוני נורמקסית המתאימים סוג העובר ומיד להמשיך עם השלבים 3 או 4.
- אם נדרש טיפול נורמקסיק נוסף, העבר בזהירות את העוברים בחזרה אל המדיום הנורמטיבי המתאים לסוג העובר.
3. שליטה על אינדוקציה מוצלחת היפוקסיה על ידי ניטור HIF-1α רמות
- הכנות
- הכן 0.4 מ"ג / מ"ל MS222 פתרון 0.1x MBS.
- הכן חיץ homogenization: רכישת חיץ Assay Radioimmunoprecipitation (RIPA בUffer) עבור homogenization של רקמות להשלים את כמות המאגר הכרחי עבור הניסוי שלך עם מעכב Protease לריכוז סופי 1: 100 v / v.
- הכן פתרונות לכתם המערבי.
- הכנה 4x Laemmli חיץ טוען ג 'ל: 425 מ"מ טריס pH 8.0, 40% v / v גליצרול, 8% v / V SDS, 4% v / v ביתא-mercaptoethanol, 0.5% w / v Bromophenol כחול, 10 מ"ל נפח כולל ddH 2 O.
- הכן 5x חיץ פועל: 15 גרם בסיס טריזמה, 72 גרם גליצין, 5 גרם SDS, 1 L נפח כולל ddH 2 O.
- הכנת מאגר חיץ: 2.66 גרם בסיס טריזמה, 14.4 גרם גליצין, 200 מ"ל מתנול 100%, 1 L נפח כולל ddH 2 O.
- הכן 10x TBST: 5 מ"ל 1 M טריס pH 8.0, 30 מ"ל 5M NaCl, 2.5 מ"ל Tween 20, 1 L נפח כולל H 2 O.
- הכן פתרון חסימה: 4% w / V אבקת חלב רזה 1x TBST.
- אוסף של רקמות
- להרדים את העוברים על ידי רחצה בפתרון 0.4 מ"ג / מ"ל MS22216 , 17 ולהעביר אותם לתוך צינור תגובה פלסטיק מלא חיץ homogenization באמצעות פיפטה פלסטיק. השתמש 20 חיץ μL לכל עובר. שים לב כי לפחות 5 עוברי צפרדע של שלב 38 או 7 עוברי דג הזברה של 4 dpf נדרשים כדי לקבוע שינוי משמעותי ברמות חלבון HIF1α.
- Homogenize הרקמה באמצעות homogenizer רקמות מתאים או sonicator. הסר את פסולת על ידי צנטריפוגה (15 דקות, 13,000 xg, 4 ° C).
- לחלופין, לנתח את הרשתיות של עוברי הצפרדע הרדים 17 ו homogenize כנ"ל. השתמש 20 μL למאגר homogenization לכל 10 retinas.
- קח את supernatant באמצעות פיפטה, להכניע ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ותוספת עם חיץ לטעון Laemmli ג'ל לריכוז סופי של 1x v / v ( למשל , להוסיף 5 μL של חיץ Laemmli 4x כדי homogenate 15 μL). השתמש supernatant זה עבור Wesטטרן כתם או להקפיא את דגימות ב -20 מעלות צלזיוס.
- כתם המערבי
- טען את הדגימות מוכן כמתואר בשלב 3.2 על ג'ל Precast 12% במערכת אלקטרופורזה באמצעות 1x v / v ריצה חיץ. השתמש סולם חלבון להגדרת גודל חלבון. מעבירים את החלבונים על קרום nitrocellulose (0.45 מיקרומטר קרום) במאגר העברת במשך 1 שעות ארוז על הקרח ב 4 ° C, לפי פרוטוקול היצרן.
- בלוק לא מחייב אתרי דוגרים את הממברנה במאגר חסימת עבור 60 דקות. בצע עם 3 x 10 דקות שוטף 1x TBST.
- דגירה של הממברנה בפתרון של נוגדנים נגד ארנב HIF-1α ואת העכבר נגד α-tubulin מדולל 1: 100 v / v ו 1: 5000 v / v, בהתאמה, בפתרון חסימה, עבור 2.5 שעות ב RT. בצע עם 3 x 10 דקות שוטף 1x TBST.
- לזיהוי, לדגור ב ארנב נגד עז עיזים נגד העכבר HRP נוגדנים מצומדות בדילול 1: 1000 v / v ב חסימת פתרון עבור 1 ח '.בצע עם 3 x 10 דקות שוטף 1x TBST לדמיין את מכתים HRP באמצעות ערכת מסחרית מכונת מפתח של בחירה.
- לכמת את כמות חלבון HIF1α באמצעות כימות דיגיטלי.
4. מעקב אחר התפשטות תאים בהיפוקסיה
- הכנות
- הכן 5 מ"מ פתרון EMU במדיום העובר של בחירה. הפתרון ניתן להשתמש באופן מיידי או aliquoted ומאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
- הכן פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) או לרכוש PBS ממשאבים מסחריים. החיטוי במשך 10 דקות על 115 מעלות צלזיוס.
- הכן פתרונות לאיתור שילוב של EDU.
- הכן פתרון קיבעון: 4% V / V של 16% פורמלדהיד פתרון המניות PBS.
- הכן פתרון סוכרוז: 30% w / סוכרוז V ב PBS.
- הכן PBST: 0.1% V / V טריטון X-100 ב PBS.
- הכן פתרון חסימה: 10% v / v חום- Inactivated סרום עז (HIGS) ב PBST.
- הכן פתרון DAPI: 1: 1000 v / v 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ב PBST.
- דגירה של עוברי היפוקסיה עבור שילוב של EDU
- ממלאים את תא הדגירה גז עם 400-500 מ"ל של פתרון 5 מ"מ EDU בתוספת 1% V / V DMSO. מראש equilibrate הפתרון עם תערובת גז זהה המשמש בניסוי במשך 15 דקות לפני הניסוי. שים לב כי נפח הפתרון הדגירה יכול להיות ממוזער על ידי צירוף מוטות קצרים יותר ( איור 1E ) לצלחת התחתונה רשת.
- חבר את צינור הגז על גליל הגז המכיל תערובת גז של 5% O 2 ו - 95% N 2 . דגירה הפתרון במשך 15 דקות.
- מעבירים את העוברים לתא היפוקסי, הפצת אותם באופן שווה בין הבארות ו דגירה של 2 ח. כל טוב יכול להתאים עד 5 עוברים צפרדע של שלב 38 או עד 7 עוברי דג הזברה 4 dpf.
- לנתח את העוברS עבור שילוב של EDU.
- זמן הקורס של הדגירה עוברי היפוקסיה ו Edu Incorporation
- ממלאים את תא הדגירה גז עם 500 מ"ל של המדיום העובר של בחירה. חבר את צינורות הגז על גליל הגז המכיל תערובת גז של 5% O 2 ו 95% N 2 ו לאזן את המדיום עם תערובת הגז במשך 15 דקות.
- מעבירים את העוברים לתא היפוקסי, הפצת אותם באופן שווה בין הבארות ו דגירה עבור פרק הזמן הרצוי עד 48 שעות. במשך 1 h האחרון, תחליף את המדיום העובר עם 5 מ"מ פתרון EDU בתוספת 1% V / V DMSO.
- מעבירים את העוברים בחזרה לצלחת normoxic ולנתח עבור שילוב EDU.
- זיהוי וניתוח של אדו
- להרדים את העוברים על ידי רחצה בפתרון 0.4 מ"ג / מ"ל MS222.
- מעבירים את העוברים בקבוקון זכוכית המתאים לתקן על ידי דוגרים פתרון קיבוע עבור 2 חהT RT או O / N ב 4 ° C. בצע עם 3 x 10 דקות שוטף PBS. בזהירות להעביר את העוברים לפתרון סוכרוז עבור cryoprotection רקמות. דגירה במשך 4 שעות או עד עוברים לשקוע לתחתית בקבוקון זכוכית.
- שבץ את העוברים במדיום הטבעה (מתחם הטמפרטורה חיתוך אופטימלי). Cryosection בלוקים עם עוברים מיד או לאחסן עד 14 ד ב -80 ° C.
- Cryosection בלוקים המכילים עוברי באמצעות cryostat. איסוף סעיפים של 12 מיקרומטר (עוברי דג הזברה) או עובי 16 מיקרומטר (עוברי צפרדע) על שקופיות מיקרוסקופ ולתת להתייבש. תהליך cryosections מיד או לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים.
- זיהוי שילוב EDU על ידי מכתים immunofluorescent באמצעות ערכת כימיה מסחרי. הכן את כמות מיקס התגובה של EDU הכרחי עבור מספר cryosections בניסוי, כפי שתואר על ידי היצרן.
- במשך 500 μL של מיקס התגובה של EDU, השתמש 430 μL של חיץ התגובה 1X EDU, 20 μL של CuSO 4 , 1.2 μL של AZide פלואוריד Alexa, 50 μL של 1X Edu חיץ תוסף.
- שטפו את cryosections פעם אחת עם PBS כדי להסיר את המדידה הטבעה 3 x 5 דקות עם PBST כדי permeabilize את הרקמה. דגירה cryosections ב חסימה פתרון למשך 30 דקות.
- דגירה cryosections עם תערובת תגובה EDU עבור 1 שעות ואחריו 3 x 10 דקות שוטף PBST. Costain את cryosections עם פתרון DAPI במשך 15 דקות, ואחריו 3 x 10 דקות שוטף PBST. הר שקופיות עם cryosections מוכתם בינוני גובר, לכסות עם coverslips ולהשאיר להתייבש לפני ניתוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי או אחסון ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 1 שנה.
- לנתח את cryosections עם מכתים אנטי EDU תחת מיקרוסקופ confocal הפוך confocal ולקבוע את מספר תאים חיוביים EDU באמצעות כימות דיגיטלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
להעסיק את מערכת קאמרית hypoxic שאנו מציגים כאן מאפשר ללמוד את ההשפעות של היפוקסיה באופן אינדיבידואלי in vivo חיות חיים שלם. היפוקסיה יכול להיגרם על ידי הנחת צפרדע או עוברי דג הזברה כולו בתא היפוקסי ( איור 1 ), ולהיות מבוצע על שילובים שונים של תנאים. תמונה של ההתקנה שלנו קאמרית הגז הושלמה מוצג באיור 2 . יש לנו פיקוח ריכוז החמצן במדיום הדגירה באמצעות חיישן חמצן סיבים אופטיים (2.1.9) בנקודות זמן שונות במהלך הניסוי. נתונים אלה מצביעים על כך שאנו גרמו היפוקסיה יציבה (6-6.5% חמצן מומס) במהלך הניסויים שלנו ( טבלה 1 ).
ראשית, הערכנו רמות בכל מקום כמו גם הרשתית של HIF-1α ב normoxia ו היפוקסיה כפי המושרה בחדר היפוקסית שלנו. HIF-1αהוא חלבון מיוצב תחת ריכוזי חמצן נמוכה. מדדנו רמות HIF-1α בכל liesates העובר צפרדע כל הזמן תחת ריכוז החמצן הרגיל או נתון היפוקסיה 5%, ו lysates של הרשתית מבודד שלהם. כפי שמוצג בתרשים 3 , HIF-1α הוא התייצב תחת היפוקסיה בשני עוברים שלמים וברטינות. ייצוב של HIF-1α מושגת בארות שונות של צלחת הדגירה התחתונה רשת ( איור S1 ).
כפי שהראינו בעבר, היפוקסיה משפיעה על התפשטות של אבות תא גזע הרשתית באזור השוליים המילירי (CMZ) של הרשתית 13 . לפיכך, מעקב אחר התפשטות ב CMZ באמצעות שילוב EDU הוא סמן טוב להשראה מוצלחת של היפוקסיה. אנחנו מודגרות עוברים בתא היפוקסי מתוחזק ב 5% חמצן והערכת התפשטות הרשתית כמתואר שלב 4.2. כצפויאד, רטינות שליטה נורמקסית הראה מכתים אדירים ב- CMZ, שבו אבות מתרבים מתגוררים בשני צפרדע ( איורים 4B ו 4 D ) ועוברי דג הזברה ( איורים 5A ו 5 C ). לאחר מחסור בחמצן בתא היפוקסית, ירידה חזקה של התפשטות אב CMZ נצפתה גם צפרדע ( דמויות 4C-4D ) ועובדי דג הזברה (תרשימים 5B, 5C). כדי לקבוע את מידת ההשפעה, ביצענו זמן קורס, דוגרים את העוברים בתא hypoxic לתקופות ארוכות יותר של עד 24 שעות, ניטור השגשוג על ידי שילוב EDU כמתואר בשלב 4.3. אנו יכולים להראות כי הירידה בשגשוג אב רשתית היה חריף ביותר בתוך 2 שעות, והתמיד במשך שעות רבות ( איור 4D ), בעוד העוברים התפתחו בדרך כלל על פי שלב ההתפתחות שלהם. תוצאה זו מצביעה על כך שהמערכת שלנו יכולה לגרום ביעילות להיפוקסיה במטרהSsue של עניין, על זמני הדגירה קצר כמו גם לקיים תנאים אלה לתקופות ארוכות יותר תוך תמיכה בהתפתחות העובר נורמלי.
איור 1: ייצוג סכמטי של הניסוי הגז קאמרית ההתקנה. ( A ) ריבוי מיכל מימי (22) אורך 10 x 10.5 (רוחב) x 10.5 ס"מ (גובה)) ( B ) צלחת 24 התחתונה היטב (12.8 x 8.6 x1.7 x 1.5 ס"מ קוטר) מסנן עם קוטר רשת של 0.1-0.2 מ"מ ( D ) מנהרות של 10 (אורך) x 5 מ"מ (קוטר) ( E ) טפלון או PVC מוטות בקוטר המתאים 30 מ"מ אורך ( F ) סיליקון צינורות ( G ) עם מיכל גז את שסתום המיזוג ( I ) שסתום הגז ( I )מפזר דיסק אמיק ( K ) מכסה טנק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תמונה של הגדרת הגז הניסויי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1: מדידת ריכוז החמצן על זמני דגירה שונים בתא הגז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של F זה צורה.
איור 3: HIF-1α רמות להגדיל על אינדוקציה היפוקסיה ב Xenopus עוברי הרשתיות שלהם. כתמים מערביים של lysates חלבון מעוברים שלמים ( A ) או מן הרשתית עובריים בודדים ( B ) שמר תחת ריכוזי חמצן נורמלי או היפוקסיה. כתמים נבדקו עבור HIF-1α תת יחידה ו α-tubulin. לפחות 5 עוברי או 22 retinas נלקחו עבור כל תנאי ( n = 5) ( C, D ) כימות של כתם המערבי המבוצעת ( A, B ), בהתאמה. רמות החלבון של HIF-1α מנורמל לרמות החלבון של α-tubulin. ברים שגיאה מייצגות סטיות תקן בין ניסויים. * P -value <0.05, *** p -value <0.001; N = 5.D / 55710 / 55710fig3large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: היפוקסיה מפחית התפשטות של אבות בתאי גזע גזעית הרשתית של עוברים צפרדע. ( א ) ייצוג סכמטי של חתך רוחב דרך הרשתית Xnopus 38 שלב, המציין את המיקום של השוליים האזורי השוליים (CMZ) ( B , C ) שילוב EDU נמדד לאחר 2 הדופק EDU ברטינות מוכתמות DAPI מ 38 הבמה עוברים צפרדע נשמר תחת normoxia ( B ) או בתא hypoxic ( C ). מגנטה = כתם DAPI; גריי = כתם EDU. סולם ברים = 50 מיקרומטר ( D ) כימות הניסוי שבוצע ב B ו - C. ברים שגיאה מייצגים סטיות תקן. ***
איור 5: היפוקסיה הפחתת התפשטות של אבות בתאי גזע גזעית ברשתית של 4 עוברי דג הזברה dpf. שילוב EDU נמדד לאחר 2 שעה הדופק EDU ב DAPI מוכתמות retinaas מ 4 dpf הישן עוברי דג הזברה נשאר undEr normoxia ( A ) או בחדר היפוקסי ( B ). מגנטה: כתם DAPI; אפור: כתם Edu. סולם ברים = 50 מיקרומטר ( ג ) כימות של הניסוי שבוצע B ו- C. ברים שגיאה מייצגים סטיות תקן. *** p -value <0.001; N = 7. עבור כל מצב 10-15 retinas היו לכמת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 1: רמות HIF-1α עלייה בהשראה היפוקסיה בעקביות בבארות שונות של הלוח ובין ניסויים שונים. כתמים מערביים של lysates חלבון מעובדי Xenopus כולו שמר תחת ריכוזי חמצן נורמלי אובשתי בארות שונות של החדר היפוקסי תחת אינדוקציה של היפוקסיה במשך 2 שעות בניסוי 1 ( א ) או בניסוי 2 ( ב ). כתמים נבדקו עבור HIF-1α תת יחידה ו α-tubulin. 5 עוברים צפרדע של שלב 38 נלקחו עבור כל תנאי. ניסוי 1 ו -2 הם משכפלים ביולוגיים עצמאיים ( C, D ) כימות של כתמים המערבי שבוצעו ( A, B ), בהתאמה. רמות החלבון של HIF-1α מנורמל לרמות החלבון של α-tubulin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן הצגנו שיטה חדשה אך קלה וחדשה לגרום היפוקסיה המותאמת לשימוש עם עופות צפרדע דג הזברה אבל יכול גם להיות מתאים לאורגניזמים מימיים אחרים. היתרון העיקרי של שיטה זו טמון בפשטות שלה ואת עלות העלות. עם זאת, התוצאות שהושגו בשיטה זו הן חזקות מאוד. הראינו כי היפוקסיה ניתן המושרה ביעילות בחדר הן עוברי כולו, כמו גם רקמות ספציפיות - כאן, retinas. כדי לקבוע את היעילות של אינדוקציה היפוקסיה, יש לנו פיקוח על רמות של חלבון HIF-1α בעובר שלם lysates הרשתית. על פי התוצאות שלנו, אינדוקציה היפוקסיה ניתן לראות מוצלח, אם עלייה של רמות HIF-1α ניתן לראות על 1 שעות בחדר היפוקסי לעומת שליטה נורמקסית מנורמל לרמות חלבון העולמי, למשל , באמצעות רמות α-tubulin כמו שליטה. אישרנו את הפעילות של היפוקסיה ברקמה על ידי ניטור תא גזע proliferAtion ב retinas על ידי שילוב EDU, והוא יכול להראות, בהתאם לתוצאות שפורסמו בעבר 13 שלנו , כי היפוקסיה המושרה באמצעות ההתקנה המוצגת כאן מוביל לירידה של התפשטות תאי גזע רשתית גם צפרדע וגם עוברי דג הזברה.
אחד הצעדים הקריטיים של פרוטוקול זה היא להבטיח כי החדר היפוקסי אטום כראוי. זה נעשה באמצעות החותם המתאים על מכסה המיכל, אשר היה שמן סיליקון במקרה שלנו. בנוסף, מיקום בתוך חממה יסייע למנוע דליפה של חמצן אטמוספרי לתוך החדר, על ידי מתן מחסום נוסף. מדידת ריכוז החמצן בעזרת בדיקה או אלקטרודה מתאימים מבטיחה גם שרמת החמצן היפוקסית נשמרת יציבה וללא תנודות. בנוסף, יש לנקוט בזהירות כדי למנוע פתיחה קאמרית לתקופות זמן ארוכות תוך החלפת פתרונות או דגימות בין ניסויים.
בהתחשב במהירות שווהפעמים של 10-15 דקות להקמת היפוקסיה, רק כמות קטנה של תערובת הגז ואת זרימת גז נמוכה הדולר נדרשים כדי לקיים את המערכת אפילו לתקופות זמן ארוך יותר המתואר בתוצאות נציג (24 שעות). הפתרונות המשמשים את הניסוי צריך להיות מראש equilibrated להשיג היפוקסיה במשך 15 דקות לפני הדגירה בחדר (כמתואר 4.2.1). השתמשנו בחדר hypoxic על פני תקופה של 48 שעות של היפוקסיה מתמדת ללא טעויות כלשהן כפי שניתן לראות ממדידות ריכוז החמצן שלנו ( טבלה 1 ). יש לציין כי דיפוזיה נכונה גז חייב להיות נשלט במהלך דגירה פעמים יותר. לבסוף, יש לקחת את הטיפול בעת הצבת העוברים לתוך הבארות (שלב 2.2.1). כדי למנוע ערבוב של עוברי מ חיות שונות מוטציות / תנאי הניסוי. זה די פשוט להשיג בהתחשב קירות גבוהים יחסית של בארות יחיד של הצלחת.
למרות היותו פשוט אך יעילואת מערכת חזקים אינדוקציה היפוקסיה, השימוש בחדר המתואר כאן יש חסרון אחד עבור ניסויים הדורשים שימוש של דגירה יקר פתרונות התקשורת. נפח מינימלי של התקשורת במיכל החדר לא צריך ליפול מתחת 400 מ"ל. עם זאת, התאמות יכול להתבצע כדי להתאים כרכים נמוכים יותר: הצלחנו להתאים את אורך המוטות ( איור 1E ) המצורפת הצלחת (2.1.4 ו 4.2.1), כך היינו דורשים רק 50 מ"ל של מדיה / פתרון . אמנם לא אידיאלי עבור דגירה פעמים יותר, התקנה זו יכולה להתאים את צינורות הגז זהה יכול להיות אטום כראוי כדי להבטיח מספיק hypoxia עד 8 שעות.
יחדיו, הגדרת תא הגזים שלנו יכול להיות מועסק לשימוש עם כל האורגניזם מודל ימיים מוגדר בנפרד דומה מערכות אחרות זמינים מסחרית על ידי הפשטות שלה, עלות וחוסן. פעם שולט, זה יכול לשמש עבור ניסויים vivo ישיר, כל פרק זמן נתון תחת כל רצוןD כולל היפוקסיה, היפרוקסיה או תערובות גז אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תמיכה מ Wellcome Trust SIA פרס 100329 / Z / 12 / Z ל WAH ואת מלגת DFG KH 376 / 1-1 הוענק HK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl/0.1x MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3/0.1x MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1x MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca(NO3)2/0.1x MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | CG10 | Frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | Gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | Aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | Gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | Hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | Hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | Hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | For embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | Embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | Tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | Tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4x Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4x Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4x Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10x TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | Tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | Tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Oxoid | BR0014G | 1x |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) | Sigma | G6767-100ml | Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | Embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | Mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
- Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
- Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude? Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
- Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
- Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
- Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
- Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
- Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
- Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
- Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
- Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
- Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Nieuwkoop, D. P., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
- McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).
