Summary
Kurbağa ve zebra balığı embriyoları gibi suda yaşayan organizmalar için yeni bir hipoksik oda sistemi sunuyoruz. Sistemimiz basit, sağlam, düşük maliyetlidir ve in vivo ve 48 saate kadar hipoksinin indüklenmesine ve sürülmesine izin verir. Hipoksinin etkinliğini izlemek için tekrarlanabilir 2 yöntem sunmaktayız.
Abstract
Burada, kurbağa ve zebra balığı embriyoları gibi su organizmalarında hipoksinin etkilerini incelemek için geliştirdiğimiz hipoksi indüksiyonu için yeni bir sistem sunuyoruz. Sistemimiz, seçime bağlı herhangi bir deneysel solüsyonda spesifik bir oksijen konsantrasyonunu ve sıcaklığını sağlamak ve korumak için sağlam olan basit bir düzen içeren bir hazneyi içermektedir. Sunulan sistem çok uygun fakat son derece fonksiyoneldir, in vivo doğrudan deneyler için ve 48 saate kadar çeşitli zaman periyodlarında indüksiyon ve hipoksinin sürdürülmesine izin verir.
Hipoksinin etkilerini izlemek ve incelemek için iki yöntem kullandık - tüm embriyolar veya spesifik dokularda hipoksi ile uyarılabilir faktör 1alfa (HIF-1α) seviyelerinin ölçülmesi ve retinal kök hücre çoğalmasının belirlenmesinde 5-etinil-2'- Deoksiuridin (EdU) DNA'ya dahil edilmesi. HIF-1α seviyeleri tüm embriyo veya dokuda genel hipoksi belirteci olarak görev yapabilirBurada, embriyonik retina seçimi. Embriyonik retinanın çoğalan hücrelerine EdU'nun dahil edilmesi hipoksi indüksiyonunun spesifik bir çıktısıdır. Böylece, hipoksik embriyonik retinal progenitörlerin hem kurbağa hem de zebra balığı embriyolarının% 5'inin oksijen altında inkübasyonun 1 saat içinde proliferasyonu azalttığını gösterdik.
Hakim olduktan sonra, kurulumumuz, doğrudan in vivo deneyler için, herhangi bir belirli periyot için ve normal, hipoksik veya hiperoksit oksijen konsantrasyonu altında veya herhangi bir diğer verilen gaz karışımında, küçük su ürünleri model organizmaları ile birlikte kullanılmak üzere kullanılabilir.
Introduction
Hypoxia araştırması çok sayıda uygulamaya sahiptir. Bunlar, hipoksi 1 ve akut yüksek rakım hastalığı 2 ile karakterize edilen tıbbi koşullar için patogenezi araştırmak ve tedavileri geliştirmektir. Hipoksik stres, oksijen gerektiren tüm organizmalarda önemli metabolik değişikliklere neden olur. Hipoksik stres ayrıca fetusun büyümesini ve gelişimini ve intrauterin büyüme kısıtlamasını da içeren çeşitli insan hastalıklarının patogenezini etkiler. Hipoksik stres, doğum kilosunun, fetal ve neonatal mortalitenin azalmasına neden olmakla kalmaz, aynı zamanda kardiyovasküler hastalık, tip-2 diyabet, obezite ve hipertansiyon 4 gibi yetişkinlikte birçok komplikasyona neden olabilir. Hipoksik stres, sıklıkla tümörün gelişimi sırasında, tümör dokusu kan dolaşımını zorlaştıracağında da görülür. Bu nedenle , in vivo ve doğrudan embr sırasında hipoksi etkilerini incelemek mümkün önemlidir Yonic gelişme.
Gelişme sırasında hipoksi etkilerini incelemek için kullanılan en iyi bilinen yöntemler arasında, büyüme ortamında kobalt klorür kullanılması veya organizmanın hipoksit bir bölgede kuluçkalanması bulunur. Kobalt klorür, proteozomal bozunmayı önleyerek hipoksi-indüklenebilir faktör-1 alfa (HIF-1α) 'nın stabilizasyonundaki rolü nedeniyle yapay olarak normal oksijen konsantrasyonu altında hipoksik bir tepki uyandırır 5 , 6 , 7 . Bununla birlikte, uygun bir yöntem olan 8 , kobalt klorür ve diğer benzer kimyasal hipoksi mimetiklerinin kullanımı, hücreler ve dokular üzerinde spesifik olmayan zararlı etkilere, örneğin apoptoz 9'a neden olabilir . Dolayısıyla, hipoksik odalar normal gelişim sürecinde canlılardaki "doğal hipoksi" oluşumunda daha iyi bir yöntemdir.
Ntent "> Suda yaşayan hayvan embriyolarında hipoksi teşvik sistemi geliştirmeye odaklandık Hem kurbağalar hem de zebra balığı birçok biyolojik sürecin yanı sıra çeşitli insan hastalıkları modelleri için omurgalı model organizmalar haline geldi Frog ve zebra balığı embriyoları Maternal tazminatın komplikasyonunu ortadan kaldırarak harici olarak gelişir.Ayrıca, hızlı bir gelişim seyri, çevresel faktörleri manipüle etmeyi ve organ oluşumundaki fenotipik değişiklikleri gerçek zamanlı olarak gözlemlemeyi mümkün kılar.Ayrıca, büyük sinyal iletim yollarının birçok bileşeni, Bu model organizmalar ve geniş bir literatür tarafından detaylandırılmışlardır Kurbağalar ve zebra balığı embriyolarının hipoksinin omurgalıların gelişimi üzerindeki etkilerini incelemekteki ana avantajı oksijenin embriyolara çabucak nüfuz etmesi nedeniyle tüm proseslerin doğrudan izlenebilmesidir. Böylece kurbağalar ve zebra balığı gibi, diğer model organizmaların aksineFare embriyolarında, spesifik bir oksijen konsantrasyonunun etkisi, işlevsel vaskülatürün varlığını veya eksikliğini göz önüne almadan, ilgi dokusunda incelenebilir.Piyasada bulunan hipoksik inkübasyonun çoğu kurulumu, karşılaştırılabilir büyüklükte ve buna bağlı olarak yüksek işletme maliyetlerine sahip olma dezavantajına sahiptir. Yüksek başlangıç maliyeti ve gaz tüketiminin yanı sıra, ortak hipoksi odalarının dengelenmesi ve bakımı, daha büyük boyut ve / veya organizma solunumundan dolayı doğal olarak bu odacıklarda oluşan gaz gradyanına karşı sabit hipoksik atmosferin sürdürülmesini gerektirir. Bu, gaz fanlarının ve soğutma sisteminin kullanılmasını gerektirir; bu soğutma sistemi, gerekli ek donanım miktarını arttırır, araştırmacının becerisini engeller ve genel olarak deneysel prosedürün basitliğini azaltır. Buna karşın, burada sunduğumuz kurulum, karşılaştırılabilir sağlam ancak çok düşük maliyetli, küçük, kurulması kolay ve fAst gazı dengelemesi, dengeli hipoksik atmosfer ve odacık içindeki malzeme ve solüsyonların basit bir şekilde değiş tokuşu. Sistemimiz, herhangi bir suda yaşayan herhangi bir organizma organizmasıyla kullanılmak üzere istihdam edilebilir.
Elverişli olarak küçük olan ve dolayısıyla herhangi bir sıcaklıkta deneysel prosedürlere kolayca izin veren ortak bir laboratuvar inkübatörüne yerleştirilebilen bir hipoksik oda oluşturduk. Ortamda oksijen konsantrasyonunun yanı sıra sıcaklığın uygun bir şekilde kontrol edilmesini sağlayarak, sistemimizin piyasada bulunan hipoksi inkübatörlerine karşı avantajı küçük boyut ve maliyet etkinliğidir. Dolayısıyla, kurulumumuz, araştırma laboratuvarlarının çoğunluğu için mevcut olan genel laboratuar malzemeleri kullanılarak kurulabilir ve pahalı malzemeler gerektirmez. Ek olarak, kurulumumuz piyasada bulunan hipoksi inkübatörlerinin aksine ısı üretmez ve oda sıcaklığının altındaki sıcaklıklarda inkübatöre konulmasını sağlar. LaSt özellikle gelişimsel ve metabolik oranlara sıcaklığa bağlı olan kurbağalar ve balık gibi soğuk kanlı organizmalar ile çalışmak için kritik önem taşır.
Çok düşük maliyetli ve kolayca kurulabilen gaz kuluçka haznemiz, çeşitli hipoksik veya hiperoksik koşulların oluşturulmasında çok yönlüdür ve geniş bir deney koşulları için farklı ortam ve solüsyonların hızlı ve kolay uygulanmasını sağlar. Buna ek olarak, yaygın olarak kullanılan tabaklar veya laboratuvar tankları yerine 10'luk , 11'inci , 12'li olmak üzere 24'lü bir plak kullanan sistemimiz, aynı anda birkaç mutant koşulun gözlemlenmesine ve deneysel olarak işlemesine izin verir.
Doğru hipoksinin indüksiyonunu kontrol etmek için Western blot tespiti ile HIF-1α protein seviyelerini izledik. Buna ek olarak, inkübasyondan önce ve sonra çoğalan hücrelerin sayısıHipoksik odadaki n, dokuda hipoksi oluştuğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu yöntem, hipoksi öncesi embriyonik retinal kök hücre nişinde çoğalmanın azaldığını gösteren daha önce yayınlanmış sonuçlarımıza 13 dayanır. Bu nedenle, embriyo ortamına 5-etinil-2'-deoksiuridin (EdU) ekleyerek ve yeni çoğalmakta olan hücrelerin DNA'sına dahil edilmesini ölçerek retinal kök hücre çoğalmasının seviyesini izledik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Cambridge Üniversitesi hayvan bakım kılavuzlarına uygundur.
1. Hayvan Bakımı
- Kurbağa embriyoları
NOT: Embriyolar hayvan ve laboratuar tesislerine göre yükseltilebilir ve bakımı yapılabilir. Burada, hayvan bakımı örneği açıklanmaktadır.- 0.88 mM NaCl, 10 uM KCI, 24 uM NaHC03, 100 uM HEPES, 8.2 uM MgS04, 3.3 uM Ca (NO3) 2 ve 4.1 uM CaCl2, pH 7.6'dan oluşan 0.1x Modifiye Barth's Solution (MBS) çözeltisini hazırlayın. .
- Xenopus laevis embriyolarını in vitro fertilizasyon yoluyla elde edin.
- Yetişkin dişi Afrika pençe kurbağalarında ( Xenopus laevis) yumurta dökmeden önce bir hafta (60 IU) gonadotropin ve 12 saat (500 IU) gonadotropik gonadotropin enjeksiyonu ile yumurtlamaya neden olun.
- Oositleri toplayın ve homojenize edilmiş erkek testis ile in vitro döllerler.
- Rai16 - 18 ° C'de 0.1x MBS'de embriyolar yapın. Xenopus laevis'in Normal tablosuna göre embriyoları sahneleyin 14 . Deney için canlı ve canlı tüm embriyolar seçerken dikkatli olun.
- Zebra balığı embriyoları
NOT: Embriyolar hayvan ve laboratuar tesislerine göre yükseltilebilir ve bakımı yapılabilir. Burada, hayvan bakımı örneği açıklanmaktadır.- Embriyo ortamı hazırlayın: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgS04 ve% 0.00001 metilen mavisi.
- 26.5 ° C'de WT AB suşu Danio rerio'nun muhafaza edilmesi ve yetiştirilmesi.
- Dölleme sabahı embriyonları toplayın, döllenmeden 4 gün sonra (28 ° C) yukarıdaki gibi hazırlanan embriyo ortamında yükseltin, daha önce tarif edildiği gibi 15'i seçin .
2. İnvivo Hipoksinin İndüklenmesi
- Normal olarak balık tesislerinde hipoksik oda yapımı için kullanılan su ıslahı tankını kullanın ( Şekil 1A ). Bu depo 24 delikli bir plakaya uymalıdır.
- Şekil 1'de tasvir edildiği gibi, örgülü 24 gözlü bir plaka hazırlayın. Bu amaç için bir frezeleme makinesi kullanarak, 24 delikli plakanın plastik tabanını ( Şekil 1B ) çıkarın.
- Kuyuların plakaları ile plakanın duvarları arasındaki boşluğu epoksi reçine ile doldurun. Reçine ile kaplanmış plastik üzerine 0,1-0,2 mm'lik bir ağ çapı olan herhangi bir naylon filtreyi ( Şekil 1C ) takın ve plakanın tamamen kurumasına izin verin.
- Kuruduktan sonra, reçine ve ağla kaplı plaka duvarlarına 10 mm uzunluğunda ve 5 mm çaplı üç veya dört tünel açın ( Şekil 1D ). Plastik veya Teflon çubukları takın( Şekil 1E ) uygun tüplere ve 30 mm uzunluğa yerleştirin ve plakayı tercih edilen tanka yerleştirin.
- Ağ altı 24 oyuklu plakayı seçilecek su makinesine yerleştirin. Silikon boru kullanarak ( Şekil 1F ) uygun bir gaz regülatörü (I) (BOC 200) kullanarak bir distribütör valfine ( Şekil İH ) istenen O 2 / N 2 karışımı veya başka bir gaz karışımı ile bir gaz tankı ( Şekil 1G ) takın bar). Burada, burada sunulan hipoksi deneylerinde% 5 oksijen ve% 95 N 2 karışımını içeren gaz tanklarını kullanın.
- Oda ortamındaki oksijen akış oranını saniyede 0.0017-0.0019 metreküpye ayarlayın. Bu gaz akış hızı altında, levhanın oyuklarında ortamın herhangi bir rahatsızlığı görülmemelidir.
- Bu amaç için yüksek saflıkta iki kademeli gaz regülatörünü kullanın. Regülatörü, hava basıncını düşürmek için ayarlayın.E gaz tankına (1000-2500 PSI), deney boyunca 10 PSI'lik bir besleme basıncına getirin. Bu nedenle, bu gaz regülatörünün spesifikasyonlarına uygun olarak, deney boyunca saniye başına 0.00189 m3'lük bir akış hızı elde edilmiştir.
- Silikon boru ve dağıtıcı valfi, su deposu içindeki bir seramik disk difüzörüne ( Şekil 1J ) bağlayın. Sulu tankı kapatın ve silikon yağı ile kaplayarak ( Şekil 1K ) kapağı dikkatlice kapatın ( Şekil 1 ile karşılaştırın). Belli bir oda sıcaklığının olmaması durumunda, hipoksik bölmeyi gereken sıcaklıktaki bir laboratuvar inkübatörüne yerleştirin.
- Deneyde kullanılan embriyoların türüne bağlı olarak, uygun embriyo ortamı ile hipoksik bölme deposunu doldurun ve gaz karışımını seramik disk difüzöründen difüze etmeye başlayın. 10-15 dakika dengelenir.
- Dengeleme yapıldıktan sonraİstenen oksijen karışımını, bir oksimetre veya oksijen sondası kullanarak sudaki oksijen konsantrasyonunu ölçün. Burada, bu amaçla fiber optik çözünmüş oksijen ve sıcaklık sensörü ile bir oksimetre kullanın.
- Deney için embriyoları dikkatli bir şekilde seçin, hipoksi inkübasyonu için canlı ve canlı tüm embriyolar kullanın. Burada, burada sahnenin 38 veya zebra balığı embriyolarının kurbağa embriyolarının 4 dpf deneyleri sunuldu.
- Embriyonik yemekleri gaz inkübasyon odası içeren inkübatöre ( Şekil 1K ) yerleştirin ve inkübatör sıcaklığına kadar dengeye getirmelerine izin verin.
- Embriyoları, plastik bir pipet kullanarak, gaz inkübasyon odasının örgülü 24 delikli plakanın ( Şekil 1B ) oyuklarına dikkatle aktarın. Protokoldeki embriyo transferi için daima bir plastik pipet kullanın.
NOT: Bu plakanın her kuyusu,Evre 38'in 5 kurbağa embriyosuna veya 4 dpf'ye kadar 7 zebra balığı embriyosuna. Farklı genotipler kullanıyorsanız, kuyuları dikkatle etiketleyin. - Gaz inkübasyon odasını, seçilen gaz karışımı ile 5 saat süreyle veya deneye uyan daha uzun bir süreyle sabit bir infüzyon altında tutun. Burada% 5 O 2 ve% 95 N 2 karışımını kullanın.
- Embriyonları gaz inkübasyon odasından özenle embriyo tipine uygun normoksik ortama aktarın ve hemen Adım 3 veya 4'e geçin.
- Daha normoksik bir tedavi gerekiyorsa, embriyoları embriyo tipine uygun normoksik ortama dikkatlice aktarın.
3. HIF-1α Düzeylerini İzleyerek Başarılı Hipoksi İndüksiyonunun Kontrolü
- hazırlıklar
- 0.1x MBS'de 0.4 mg / mL MS222 solüsyonu hazırlayın.
- Homojenleştirme tamponunu hazırlayın: Radyoimmünopresipitasyon Testi tamponu (RIPA bUffer) ekleyin ve Proteaz İnhibitörü ile deneyiniz için gerekli tampon miktarını 1: 100 v / v nihai bir konsantrasyonda tamamlayın.
- Western blot için çözümler hazırlayın.
- 4x Laemmli jel yükleme tamponu hazırlayın: 425 mM Tris pH 8.0,% 40 v / v Gliserol,% 8 v / v SDS,% 4 v / v beta-merkaptoetanol,% 0.5 a / a Bromofenol Mavi, 10 mL toplam hacim ddH2 O.
- 5x koşu tamponu hazırlayın: 15 g Trizma baz, 72 g Glisin, 5 g SDS, 1 L toplam hacim ddH20.
- Transferi tamponunu hazırlayın: 2.66 g Trizma baz, 14.4 g glisin, 200 mL% 100 metanol, 1 L toplam hacim ddH20.
- 10x TBST hazırlayın: 5 mL 1 M Tris pH 8.0, 30 mL 5M NaCl, 2.5 mL Tween 20, 1 L toplam hacim H20.
- Engelleme çözeltisi hazırlayın: 1% TBST içinde yağsız süt tozu ile% 4 w / v.
- Doku toplanması
- 0.4 mg / mL MS222 solüsyonu ile banyo yapılarak embriyoları anestezi edin16 , 17 ve plastik bir pipet kullanarak homojenleştirme tamponu ile doldurulmuş bir plastik reaksiyon tüpüne aktarın. Embriyo başına 20 mcL tampon kullanın. HIF1α protein seviyelerinde önemli bir değişiklik belirlemek için, 4 dpf safha 38 veya 7 zebra balığı embriyolarının en az 5 kurbağası embriyosuna ihtiyaç duyulduğunu unutmayın.
- Dokuyu uygun bir doku homojenleştirici veya sonikatör kullanarak homojenize edin. Enkayı santrifüjle (15 dakika; 13.000 xg; 4 ° C) çıkarın.
- Alternatif olarak, anestezi edilmiş kurbağa embriyolarından 17 retinaları ayırın ve yukarıdaki gibi homojenleştirin. 10 retinada 20 μL homojenleştirme tamponu kullanın.
- Bir pipet kullanarak süpernatantı alın, 85 ° C'de 5 dakika denatürasyon yapın ve 1x v / v'lik bir nihai konsantrasyona kadar Laemmli jel yükleme tamponu ile takviye edin ( örn. , 15 uL homojenata 4x Laemmli tamponu 5 uL ekleyin.). Bu süpernatanı Wes için kullanınÖrnekler -20 ° C'de lekelenir veya dondurulur.
- Western Blot
- Adım 3.2'de açıklandığı gibi hazırlanan numuneleri 1x v / v Koşu tamponu kullanarak bir elektroforez sisteminde prekast 12% jel üzerine yükleyin. Protein ebadı tayini için bir protein merdiveni kullanın. Proteinleri, üreticinin protokolüne göre buz üzerinde 4 ° C'de paketlenmiş 1 saat süreyle transfer tamponu içinde bir nitroselüloz zara (0.45 um membran) aktarın.
- Membranı engelleme tamponunda 60 dakika inkübe eden spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin. 1x TBST içinde 3 x 10 dakika yıkama ile izleyin.
- Membranı, RT'de 2.5 saat seyreltik tavşan anti-HIF-1α antikoru ve fare anti-α-tubulin solüsyonlarına sırasıyla 1: 100 v / v ve 1: 5000 v / v damıtana kadar inkübe edin. 1x TBST içinde 3 x 10 dakika yıkama ile izleyin.
- Algılama için, keçi anti-tavşan ve keçi anti-fare HRP-konjüge antikorlarda, 1 saat boyunca 1: 1000 v / v seyreltilmiş Blocking çözeltisi içerisinde inkübe edin.1x TBST'de 3 x 10 dakika yıkama yapın ve ticari bir kit ve seçilen bir geliştirici makine kullanarak HRP boyasını görselleştirin.
- Dijital niceleme kullanarak HIF1α protein miktarını ölçün.
4. Hipokside Hücre çoğalmasının izlenmesi
- hazırlıklar
- Seçilen embriyo ortamında 5 mM EDU solüsyonu hazırlayın. Solüsyon derhal veya bölünebilir ve -20 ° C'de 6 aya kadar depolanabilir.
- Fosfat Tamponlu Salin (PBS) hazırlayın veya ticari kaynaklardan PBS satın alın. 115 ° C'de 10 dakika süreyle otoklavda tutun.
- EdU birleşmesinin saptanması için çözümler hazırlayın.
- Sabitleme çözeltisi hazırlayın: PBS içinde% 4'lük v / v'lik% 16'lık Formaldehit stok solüsyonu hazırlayın.
- Sakaroz çözeltisi hazırlayın: PBS içinde% 30 w / v sükroz.
- PBST'yi hazırlayın: PBS içinde% 0.1 v / v Triton X-100.
- Engelleme solüsyonu hazırlayın:% 10 v / v Isıyla inaktive Keçi Serumu (HIGS) PBST'de.
- PBST içinde DAPI çözeltisi hazırlayın: 1: 1000 v / v 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).
- Embriyoların, EdU birleşmesi için hipokside inkübe edilmesi
- % 1 v / v DMSO ile takviye edilmiş 400-500 mL 5 mM Edu solüsyonu ile gaz inkübasyon odasını doldurun. Çözeltiyi deneyden önce kullanılan 15 dakika boyunca aynı gaz karışımı ile önceden dengeleyin. Kuluçka çözeltisinin hacminin kısa çubukları ( Şekil 1E ) örgü alt plakaya tutturarak en aza indirebileceğini unutmayın.
- Gaz borusunu,% 5 O 2 ve% 95 N 2 gaz karışımı içeren gaz silindirine bağlayın. Çözeltiyi 15 dakika inkübe edin.
- Embriyoları hipoksik bölmeye aktarın, bunları eşit olarak kuyular arasında dağıtın ve 2 saat inkübe edin. Her kuyu 38 evreye kadar 5 kurbağa embriyosuna veya 7 zebra balığı embriyosuna kadar 4 dpf kadar yerleştirebilir.
- Embriyoyu analiz edinEd U kuruluşu için.
- Hipoksi ve EdU birleşmesinde embriyo kuluçka süresinin zamanı
- Seçiminizdeki 500 mL embriyo ortamı ile gaz inkübasyon odasını doldurun. Gaz tüpünü,% 5 O 2 ve% 95 N 2 gaz karışımı içeren gaz silindirine bağlayın ve ortamı gaz karışımı ile 15 dakika dengeleyin.
- Embriyoları hipoksik bölmeye aktarın, bunları eşit olarak kuyular arasında dağıtın ve 48 saate kadar istenen zaman periyodu boyunca inkübe edin. Son 1 saat boyunca, embriyo ortamını,% 1 v / v DMSO ile takviye edilmiş 5 mM EDU çözeltisi ile değiştirin.
- Embriyoları normoksik çanağa geri aktarın ve EdU'ya katılmayı analiz edin.
- EdU dahil etme algılama ve analizi
- 0.4 mg / mL MS222 solüsyonu ile banyo yapılarak embriyoları anestezikleyin.
- Embriyoları uygun bir cam şişeye aktarın ve 2 ha için fiksasyon çözeltisi içinde inkübe ederek düzeltinT RT veya O / N 4 ° C'de. PBS'de 3 x 10 dakika yıkamayla izleyin. Doku soğuk koruması için embriyoları sakaroz çözeltisine dikkatli bir şekilde aktarın. Embriyolar cam flakona altına batmayana kadar 4 saat inkübe edin.
- Embriyoları gömme ortamına yerleştirin (optimum kesme sıcaklığı bileşiği). Cryosection, embriyolarla derhal bloke eder veya -80 ° C'de 14 d'ye kadar depolayabilir.
- Bir kriyostat kullanarak embriyolar içeren blokların kriyoteksiyonu. Mikroskop lamları üzerinde 12 μm (zebra balığı embriyoları) veya 16 μm (kurbağa embriyoları) kalınlıkları toplayın ve kurumaya bırakın. Dondurma bölmelerini derhal işleyin veya -20 ° C'de 3 aya kadar saklayın.
- EdU birleşmesini, ticari bir kimya kiti kullanarak immünofloresan boyayla tespit edin. Üreticinin tanımladığı şekilde deneydeki kriyoteksiyon sayısı için gerekli olan EdU Reaksiyon Karışımı miktarını hazırlayın.
- 500 uL Edsu Reaksiyon Karışımı için, 430 uL 1X EdU reaksiyon tamponu, 20 uL CuS04, 1.2 uL Alexa Fluor azid, 50 uL 1X EdU tampon katkı maddesi.
- Cryosections bir kez PBMT ile permeabilize gömülü ortam ve 3 x 5 dakika kaldırmak için PBS ile yıkayın. Dondurma bölmelerini Bloke etme çözümünde 30 dakika inkübe edin.
- Cryosections Edu Reaksiyon Karışımı ile 1 saat süreyle inkübe edin ve ardından PBST'de 3 x 10 dakika yıkayın. Kriyoseksiyonları 15 dakika boyunca DAPI çözeltisi ile, ardından PBST'de 3 x 10 dakika yıkayın. Mount orta lekeli cryosections ile slaytlar monte lamelleri ile kapak ve bir floresan mikroskop altında analiz veya 1 yıl kadar 4 ° C'de saklanmadan önce kurumaya bırakın.
- Ters çevrilmiş konfokal tarama mikroskopu altında anti-EdU boyama ile cryosections analiz ve dijital kantifikasyon kullanarak EdU-pozitif hücrelerin sayısını belirlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunduğumuz hipoksik odacık sisteminin kullanılması, hipoksinin tek tek ve canlı tüm canlı hayvanlar üzerindeki etkilerinin incelenmesine olanak tanır. Hipoksi, tüm kurbağa veya zebra balığı embriyolarını hipoksik bölmeye ( Şekil 1 ) yerleştirerek indükleyebilir ve koşulların farklı kombinasyonları üzerinde üstlenilebilir. Tamamlanmış gaz odası yerleşiminin bir görüntüsü Şekil 2'de gösterilmektedir. Deney sırasında farklı zaman noktalarında bir fiber optik oksijen sensörü (2.1.9) kullanarak inkübasyon ortamındaki oksijen konsantrasyonunu izledik. Bu veriler, deneylerimiz boyunca kararlı hipoksi (% 6-6.5 çözünmüş oksijen) indüklediğimizi göstermektedir ( Tablo 1 ).
İlk olarak hipoksit odamızda indüklenen normoksi ve hipokside HIF-1α'nın her yerde ve aynı zamanda retinal düzeylerini değerlendirdik. HIF-1αDüşük oksijen konsantrasyonları altında stabilize edilmiş bir proteindir. Normal oksijen konsantrasyonu altında tutulan veya% 5'lik hipoksiye tabi tutulan bütün kurbağa embriyo lisatlarında ve izole retinaların lizatlarında HIF-1α düzeylerini ölçtük. Şekil 3'te gösterildiği gibi, HIF-1α, hem tüm embriyolar hem de retinalarda hipoksi altında stabilize edilir. HIF-1α'nın stabilize edilmesi, gözenekli taban inkübasyon plakasının farklı oyuklarında elde edilir ( Şekil S1 ).
Daha önce de gösterdiğimiz gibi, hipoksi, retina 13'ün Silier Marjinal Bölgesindeki (CMZ) retina kök hücre öncüllerinin proliferasyonunu etkiler. Bu nedenle, EdU birleşmesiyle CMZ'deki çoğalmayı izlemek, başarılı bir şekilde hipoksi indüksiyonu için iyi bir belirteçtir. Embriyoları% 5 oksijen muhafaza eden bir hipoksik bölgede kuluçkaya yatırdık ve adım 4.2'de anlatıldığı gibi retinal proliferasyonu değerlendirdik. Beklediği gibiÇoğaltılmış öncülerin hem kurbağa ( Şekil 4B ve 4D ) hem de zebrafish embriyolarında ( Şekil 5A ve 5C ) bulunduğu yoğun CMU'da EdU lekelenmesi gösterdi. Hipoksik bölmedeki oksijen yoksunluğundan sonra hem kurbağa ( Şekil 4C-4D ) hem de zebrabakoz embriyolarında (Şekil 5B, 5C) CMZ progenitör proliferasyonunda güçlü bir azalma gözlemlendi. Etkinin boyutunu belirlemek için embriyoları hipoksik bölmedeki 24 saatlik daha uzun süre inkübe ederek adım 4.3'te anlatıldığı gibi EdU birleşmesiyle proliferasyonu izleyerek bir zaman periyodu uyguladık. Retinal progenitör proliferasyonundaki azalmanın 2 saat içinde akut ve en fazla olduğunu ve birçok saat boyunca devam ettiğini gösterebiliriz ( Şekil 4D ), embriyolar gelişim evrelerine göre normal geliştiler. Bu sonuç, sistemimizin bir hedef ti içinde etkili bir şekilde hipoksiyi indükleyebildiğini düşündürmektedirKısa kuluçka süreleri üzerine, normal embriyo gelişimini desteklerken bu koşulları daha uzun süre sürdürmek gibi.
Şekil 1: Deneysel Gaz Odası Kurulumunun Şematik Gösterimi. ( A ) yetiştirme suyu deposu (22 (uzunluk) x 10.5 (genişlik) x 10.5 cm (yükseklik)) ( B ) ağ altı 24 delikli plaka (12.8 x 8.6 x1.7 x 1.5 cm kuyu çapı) ( C ) naylon Uygun çapta ve 30 mm uzunluğunda ( F ) silikon boru ( G ) gaz tankında 10 (uzunluk) x 5 mm (çap) ( E ) Teflon veya PVC çubukların 0.1-0.2 mm ( D ) tünelleri ile bir örgü çapı olan filtre Arzulanan oksijen / CO 2 karışımı ( H ) dağıtıcı valf ( I ) gaz valfı ( J ) cerAmik disk difüzör ( K ) depo kapağı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Deneysel Gaz Odası Kurulumunun Bir Görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 1: Gaz Odasındaki Farklı Kuluçka Sürelerine Göre Oksijen Konsantrasyonunun Ölçümü . Bu f daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız ŞEKIL.
Şekil 3: Xenopus Embriyolarında ve Retinalarında Hipoksi İndüksiyonunda HIF-1α Seviyeleri Artmaktadır. Tam embriyolardan ( A ) veya normal oksijen konsantrasyonlarında veya hipokside muhafaza edilen izole embriyonik retinalardan ( B ) gelen protein lizatlarının Western lekeleri. Bloklar, HIF-1α altbirimi ve α-tubulin için araştırıldı. Her durum için sırasıyla en az 5 embriyo veya 22 retinanın ( n = 5) alındığı ( C, D ) sırasıyla ( A, B ) 'de yapılan Western lekesinin nicelendirilmesi. HIF-1α'nın protein seviyeleri α-tubulin protein seviyeleri için normalize edildi. Hata çubukları deneyler arasındaki standart sapmaları temsil eder. * P- değeri <0.05, *** p- değeri <0.001; N = 5.D / 55710 / 55710fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Hipoksi, Kurbağa Embriyolarının Retinal Kök Hücre Nişinde Progenitörlerin Proliferasyonunu Azaltır. ( A ) 38 aşamalı Xenopus retinası üzerinden kesitin şematik gösterimi, siliyer marjinal bölgenin (CMZ) ( B , C ) pozisyonunu belirtir. EdU katılımı, 38 aşamadan DAPI ile lekelenmiş retinardaki 2 saatlik bir EdU nabızından sonra ölçülmüştür Kurbağa embriyoları normoksiya ( B ) veya hipoksik bölgede ( C ) tutulur. Macenta = DAPI lekesi; Gri = Edu lekesi. Ölçek çubukları = 50 μm ( D ) Deneyin B ve C'de nicelendirilmesi. Hata çubukları standart sapmaları temsil eder. ***
Şekil 5: Hipoksi, 4 dpf Zebra bağı Embriyolarının Retinal Kök Hücre Niche'sinde Progenitörlerin Proliferasyonunu Azaltır. EdU birleşmesi, 4 dpf eski WTe zebra balığı embriyolarından DAPI ile lekelenmiş retinada 2 saatlik bir EdU darbesinden sonra ölçülmüştürEr normoksi ( A ) veya hipoksik bölgede ( B ). Macenta: DAPI lekesi; Gri: EdU lekesi. Ölçek çubukları = 50 μm ( C ) Deneyin B ve C'de nicelendirilmesi. Hata çubukları standart sapmaları temsil eder. *** p- değeri <0.001; N = 7. Her koşul için 10-15 retinanın miktarı belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 1: HIF-1α Düzeyleri, Farklı Plakların Farklı Kuyularında ve Farklı Deneyler Arasında Hipoksi İndüksiyonunda Sürekli Artış Yapmaktadır. Normal Xenopus embriyolarından protein lizatlarının Western lekeleri normal oksijen konsantrasyonları altında tutulur veyaDeney 1 ( A ) ya da deney 2 ( B ) 'de hipoksi indüksiyonu altında 2 saat süreyle hipoksik bölmenin iki farklı kuyucuğunda gerçekleştirildi. Bloklar, HIF-1α altbirimi ve α-tubulin için araştırıldı. Her durum için 38. evre 5 kurbağa embriyosu alındı. Deney 1 ve 2 bağımsız biyolojik çoğaltır ( C, D ) sırasıyla ( A, B ) gerçekleştirilen Western lekelerinin nicelendirilmesi. HIF-1α'nın protein seviyeleri α-tubulin protein seviyeleri için normalize edildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, kurbağa ve zebra balığı embriyolarıyla kullanılmak üzere ayarlanmış, ancak diğer su organizmaları için de uygun olan hipoksiyi indüklemek için kolay ama sağlam yeni bir yöntem sunduk. Bu yöntemin en büyük avantajı basitliği ve maliyet etkinliğidir. Bununla birlikte, bu yöntemle elde edilen sonuçlar çok sağlamdır. Hipoksinin odadaki hem tüm embriyolar hem de spesifik doku - burada retinalar - içinde etkili bir şekilde indükte edilebileceğini gösterdik. Hipoksi indüksiyonunun etkililiğini belirlemek için, tüm embriyo ve retinal lizatlarda HIF-1α protein seviyelerini izledik. Sonuçlarımıza göre hipoksik indüksiyon, normoksik kontrol ile karşılaştırıldığında hipoksik bölgede 1 saat süreyle HIF-1α düzeylerinde bir artış gözlenebiliyor ve global protein seviyelerine normalize edilmişse, örneğin α-tubulin düzeylerini kullanarak başarılı olarak görülebilir Kontrol olarak. Kök hücre proliferini izleyerek dokudaki hipoksi aktivitesini doğruladıkDaha önce yayınlanan sonuçlarımıza 13 uygun olarak , burada sunulan düzenek kullanılarak başlatılan hipoksinin hem kurbağa hem de zebra bağı embriyolarında retinal kök hücre çoğalmasının azalmasına yol açtığını gösterebilir.
Bu protokolün kritik adımlarından biri, hipoksik bölmenin düzgün şekilde mühürlenmesini sağlamaktır. Durumumuzda silikon yağ olan depo kapağında uygun bir conta kullanılarak gerçekleştirilir. Buna ek olarak, bir inkübatöre yerleştirme ek bir bariyer sağlayarak odaya atmosferik oksijen sızmasını önlemeye yardımcı olacaktır. Uygun bir prob veya elektrot ile oksijen konsantrasyonunun bir ölçümü aynı zamanda hipoksik oksijen seviyelerinin dengeli ve dalgalanmadan tutulmasını sağlar. Buna ek olarak, deneyler arasında çözümler veya numuneler değiş tokuş ederken uzun süre oda açıklığından kaçınmaya özen gösterilmelidir.
Hızlı denge göz önüne alındığındaHipoksi oluşumu için 10-15 dakika süresince, gaz karışımının az bir miktarı ve düşük bir gaz debisi, temsilci sonuçlarında (24 saat) açıklanan süreden daha uzun süre bile sistemi sürdürmek için gereklidir. Deneyde kullanılan solüsyonlar, bölmedeki inkübasyondan önce 15 dakika boyunca hipoksiyi elde etmek için önceden dengelenmelidir (4.2.1'de açıklandığı gibi). Hipoksik bölmeyi, oksijen konsantrasyon ölçümlerimizden görüldüğü gibi, sabit hipoksi olmadan 48 saat boyunca herhangi bir hata yapmadan kullandık ( Tablo 1 ). Doğru gaz difüzyonunun daha uzun kuluçka süresi boyunca kontrol edilmesi gerektiği unutulmamalıdır. Nihayet, mutasyona uğramış hayvanlardan / deneysel koşullardan embriyoların karışmasını önlemek için, embriyoların kuyulara yerleştirilmesi sırasında dikkat edilmelidir (Adım 2.2.1.). Tabağın tek kuyruklarının nispeten yüksek duvarları göz önüne alındığında, bu elde etmek oldukça kolaydır.
Basit olmasına rağmen etkiliVe hipoksi indüksiyonu için sağlam sistem, burada açıklanan oda kullanımı pahalı inkübasyon çözümleri ve medya kullanımı gerektiren deneyler için bir dezavantajı vardır. Bölme tankındaki minimum ortam hacmi 400 mL'nin altına düşmemelidir. Bununla birlikte, daha düşük hacimlere uyacak şekilde ayarlamalar yapılabilir: Plakaya (2.1.4 ve 4.2.1) bağlanan çubukların uzunluğunu ( Şekil 1E ) ayarlamayı başardık, böylece yalnızca 50 mL medya / solüsyon gerektirecekti. . Daha uzun inkübasyon süreleri için ideal olmasa da, bu kurulum aynı gaz tüpüne uyabilir ve 8 saate kadar yeterli hipoksi sağlamak için uygun şekilde kapatılabilir.
Birlikte ele alırsak, gaz odamızın kurulumu, herhangi bir suda yaşayan model organizması ile kullanılmak üzere kullanılabilir ve piyasada bulunan diğer benzer sistemlerin sadeliği, maliyet etkinliği ve sağlamlığı dışında bırakılmıştır. Bir kez hakim olunca, doğrudan in vivo deneyler için, herhangi bir zaman periyodunda ve herhangi bir istekte kullanılabilirD gaz atmosferi, hipoksi, hiperoksi veya diğer gaz karışımlarını içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.
Acknowledgments
Bu çalışma Wellcome Trust SIA Ödülü 100329 / Z / 12 / Z'den WAH'ya ve DFG bursu KH 376 / 1-1'e Destek ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl/0.1x MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3/0.1x MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1x MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca(NO3)2/0.1x MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | CG10 | Frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | Gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | Aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | Gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | Hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | Hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | Hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | For embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | Embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | Tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | Tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4x Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4x Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4x Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10x TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | Tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | Tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Oxoid | BR0014G | 1x |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) | Sigma | G6767-100ml | Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | Embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | Mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
- Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
- Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude? Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
- Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
- Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
- Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
- Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
- Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
- Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
- Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
- Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
- Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Nieuwkoop, D. P., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
- McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).
