Summary
Vi introduserer et nytt hypokalsystem for bruk med vannlevende organismer som frosk og sebrafiskembryoer. Vårt system er enkelt, robust, kostnadseffektivt og muliggjør induksjon og opprettholdelse av hypoksi in vivo og i opptil 48 timer. Vi presenterer 2 reproduserbare metoder for å overvåke effekten av hypoksi.
Abstract
Her introduserer vi et nytt system for hypoksi-induksjon, som vi utviklet for å studere effekten av hypoksi i akvatiske organismer som frosk og sebrafiskembryoer. Vårt system består av et kammer som har et enkelt oppsett som likevel er robust til å indusere og opprettholde en bestemt oksygenkonsentrasjon og temperatur i en hvilken som helst eksperimentell løsning. Det presenterte systemet er svært kostnadseffektivt men svært funksjonelt, det tillater induksjon og opprettholdelse av hypoksi for direkte eksperimenter in vivo og i ulike tidsperioder opptil 48 timer.
For å overvåke og studere effekten av hypoksi har vi benyttet to metoder - måling av nivåer av hypoksi-inducerbar faktor 1alpha (HIF-1α) i hele embryoer eller spesifikke vev og bestemmelse av retinalt stamcelleproliferasjon med 5-etynyl-2'- Deoxyuridin (EdU) inkorporering i DNA. HIF-1α nivåer kan tjene som en generell hypoksi markør i hele embryoet eller vevetAv valg, her embryonalt nese. EdU-inkorporering i de prolifererende celler av embryonalt retina er en spesifikk utgang av hypoksi-induksjon. Dermed har vi vist at hypoksiske embryonale retinale progenitorer reduserer proliferasjon innen 1 time inkubering under 5% oksygen av både frosk og zebrafiskembryoer.
Når vi har mestret, kan vårt oppsett brukes til bruk med små organismer av vannmodell, for direkte in vivo eksperimenter, i en gitt tidsperiode og under normal, hypoksisk eller hyperoksisk oksygenkonsentrasjon eller under en hvilken som helst annen gitt gassblanding.
Introduction
Hypoksiforskning har mange anvendelser. Disse inkluderer undersøkelse av patogenesen og utvikling av behandlinger for medisinske tilstander preget av hypoksi 1 og akutt høyhøye sykdom 2 . Hypoksisk stress forårsaker store metabolske forandringer i alle organismer som krever oksygen. Hypoksisk stress påvirker også føtal vekst og utvikling og patogenesen av flere humane sykdommer, inkludert intrauterin vekstrestriksjon 3 . Hypoksisk stress kan ikke bare føre til redusert fødselsvekt, føtal og nyfødt dødelighet, men kan også resultere i mange komplikasjoner i voksenlivet, for eksempel kardiovaskulær sykdom, type 2 diabetes, fedme og hypertensjon 4 . Hypoksisk stress blir også ofte observert under solid tumorutvikling, når svulstvevet vokser ut blodtilførselen. Det er derfor viktig å kunne studere effekten av hypoksi in vivo og direkte under embr Yonisk utvikling.
Blant de mest kjente metoder som har vært ansatt for å studere effekter av hypoksi under utvikling er bruken av koboltklorid i vekstmediet eller inkubasjon av organismen i et hypoksisk kammer. Kobolklorid fremkaller kunstig en hypoksisk respons under normal oksygenkonsentrasjon, på grunn av sin rolle i stabiliseringen av hypoksi-inducerbar faktor-1 alfa (HIF-1a) ved å forhindre dets proteosomale nedbrytning 5 , 6 , 7 . Imidlertid, som en praktisk metode 8 , kan bruken av koboltklorid samt andre lignende kjemiske hypoksymimetika ha uspesifisert skadelig virkning på celler og vev, for eksempel apoptose 9 . Derfor er hypoksiske kamre en bedre metode for induksjon av "naturlig hypoksi" i levende organismer i løpet av normal utvikling.
Ntent "> Vi har fokusert på å utvikle et system for induksjon av hypoksi i akvatiske embryoer. Både frosker og sebrafisk har nå blitt informative vertebratmodellorganismer for studier av mange biologiske prosesser, samt modeller for ulike menneskersykdommer. Frog- og sebrafiskembryoer Utvikle seg eksternt, eliminere komplikasjonen av maternell kompensasjon. Videre gjør et raskt utviklingsløp det mulig å manipulere miljøfaktorer og observere fenotypiske forandringer i organdannelsen i sanntid. I tillegg er mange komponenter i de store signaltransduksjonsbanene sterkt konserverte i Disse modellorganismer og har blitt karakterisert i detalj av en stor litteratur. Hovedfordelen ved bruk av frosker og zebrafiskembryoer for å studere effekten av hypoksi på vertebratutvikling er at alle prosesser kan overvåkes direkte, siden oksygen raskt trenger inn i embryoene. Dermed i frosker og sebrafisk, som i motsetning til andre modellorganismer somMusembryoer, kan påvirkning av en bestemt oksygenkonsentrasjon studeres i vev av interesse uten å ta hensyn til forekomsten eller mangelen på funksjonell vaskulatur.De fleste kommersielt tilgjengelige oppsett for hypoksisk inkubasjon har ulempen ved å være sammenlignbart store og har tilsvarende høye løpekostnader. Bortsett fra deres høye initialkostnad og gassforbruk krever ekvilibrering og vedlikehold av vanlige hypoksiekamre opprettholdelse av konstant hypoksisk atmosfære mot gassgradienten som naturlig forekommer i disse kamrene på grunn av deres større størrelse og / eller organisasjonsånding. Dette krever sysselsetting av gassfans og et kjølesystem, noe som øker mengden ekstra nødvendig utstyr, hindrer forskers fingerfylling og generelt reduserer enkelheten i eksperimentell prosedyre. I motsetning til dette er oppsettet vi presenterer her, sammenlignbart robust, men svært kostnadseffektivt, lite, lett å etablere og tillater fAst-gassekvilibrering, stabil hypoksisk atmosfære og enkel utveksling av materialer og løsninger i kammeret. Vårt system kan brukes til bruk med en vannmiljøorganisme av interesse.
Vi har konstruert et hypoksisk kammer som er bekvemt lite og kan derfor plasseres inne i en felles laboratorieinkubator, som lett tillater eksperimentelle prosedyrer ved en bestemt temperatur. For å gi praktisk kontroll over både temperatur og oksygenkonsentrasjon i mediet ligger fordelen av systemet vårt mot de kommersielt tilgjengelige hypoksi-inkubatorene i sin lille størrelse og kostnadseffektivitet. Dermed kan vårt oppsett etableres ved hjelp av generelle laboratorieforsyninger tilgjengelig for de fleste forskningslaboratorier og krever ikke dyre materialer. I tillegg genererer oppsettet ikke varme, i motsetning til kommersielt tilgjengelige hypoksi-inkubatorer, og tillater bruk ved temperaturer lavere enn romtemperaturen blir plassert i en inkubator. LaSt er spesielt kritisk for arbeidet med kaldblodige organismer som frosker og fisk der utviklings- og metabolskrate er sterkt temperaturavhengige.
Å være svært kostnadseffektiv og lett bygget, er vårt gassinkubasjonskammer likevel svært allsidig når det gjelder å etablere ulike hypoksiske eller hyperoksiske forhold, samt muliggjøre rask og enkel administrasjon av forskjellige medier og løsninger for et stort antall eksperimentelle forhold. I tillegg bruker vi en brønn på 24 brønner i stedet for vanlige retter eller laboratorietanker 10 , 11 , 12 , og lar oss observere og eksperimentelle behandling av flere mutantforhold samtidig.
For å kontrollere for korrekt induksjon av hypoksi, har vi overvåket nivåene av HIF-1a-proteinet ved Western blot-deteksjon. I tillegg er antallet prolifererende celler før og etter inkubasjonN i det hypoksiske kammeret kan brukes til å avgjøre om hypoksi har blitt indusert i vevet. Denne metoden er basert på våre tidligere publiserte resultater 13 , som viser at spredning i embryonal retinal stamcelle nisje reduseres ved induksjon av hypoksi. Dermed har vi overvåket nivået av retinalt stamcelleproliferasjon ved å tilsette 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) til embryo-mediumet og måle dets innlemmelse i DNA'et av nylig prolifererende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjer for dyrepleie ved Universitetet i Cambridge.
1. Dyrevedlikehold
- Froskembryoer
MERK: Embryoer kan heves og opprettholdes i henhold til dyre- og laboratorieanlegget. Her er et eksempel på vedlikehold av dyr beskrevet.- Klargjør 0.1x Modifisert Barths Solution (MBS) løsning: 0,88 mM NaCl, 10 μM KCl, 24 μM NaHC03, 100 μM HEPES, 8,2 μM MgS04, 3,3 μM Ca (NO3) 2 og 4,1 μM CaCl2, pH 7,6 .
- Skaff Xenopus laevis- embryoer ved in vitro befruktning.
- Fremkall eggløsning hos voksne, kvinnelige afrikanske klode frosker ( Xenopus laevis) ved injeksjon med gravid mare serumgonadotropin en uke (60 IE) og 12 timer (500 IE) før egglegging.
- Samle oocytter og befrukt dem in vitro med homogenisert mannlig testis.
- RaiSe embryoer i 0,1x MBS ved 16-18 ° C. Plasser embryoene i henhold til Normalbordet for Xenopus laevis 14 . Pass på å velge hele og levende embryoer for forsøket.
- Sebrafiskembryoer
MERK: Embryoer kan heves og opprettholdes i henhold til dyre- og laboratorieanlegget. Her er et eksempel på vedlikehold av dyr beskrevet.- Klargjør embryo-medium: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgS04 og 0,00001% metylenblå.
- Opprettholde og avle WT AB-stamme Danio rerio ved 26,5 ° C.
- Samle embryoene på morgenen av befruktning, øke til 4 d etter befruktning (dpf) ved 28 ° C i embryonmedium fremstilt som beskrevet ovenfor, velg og trinn som tidligere beskrevet 15 .
2. Induksjon av hypoksi in vivo
- Bruk en akvatisk akvatisk tank ( Figur 1A ) som normalt brukes i fiskeanlegget for hypoksisk kammerkonstruksjon. Denne tanken skal passe til en 24-brønn plate.
- Klargjør en 24-brønnplate med maskebunn som vist i Figur 1 . Fjern plastbunnen av 24-brønnplaten ( Figur 1B ), for eksempel ved å bruke en fresemaskin til dette formålet.
- Fyll mellomrommet mellom brønnens plast og veggene på platen med epoksyharpiks. Fest et nylonfilter ( Figur 1C ) med en maskediameter på 0,1-0,2 mm til den harpiksbelagte plasten og la platen være helt tørr.
- Når du har tørket, bor 3 eller 4 tunneler ( figur 1D ) med en lengde på 10 mm og en diameter på 5 mm i de plater som har resin- og maskerte plater. Fest plast eller Teflon stenger( Figur 1E ) med passende diameter og 30 mm lengde til tunneler og plasser platen i tanken som er valgt.
- Plasser nettbrettet 24-brønnplate i den valgte akvatiske tanken. Ved hjelp av silikonrør ( Figur 1F ), fest en bensintank ( figur 1G ) med den ønskede O2 / N2-blandingen eller en annen gassblanding til en fordelerventil ( Figur 1H ) ved hjelp av en passende gassregulator (I) (BOC 200 bar). Her bruker du gassbeholdere som inneholder en blanding av 5% oksygen og 95% N2 i hypoksieforsøkene som presenteres her.
- Juster oksygenstrømningshastigheten i kammermediet til 0,0017-0,0019 kubikkmeter per sekund. Under denne gasstrømningshastigheten bør ingen forstyrrelse av mediet ses i brønnene på platen.
- Bruk den høye renhetens to-trinns gassregulator til dette formålet. Still inn regulatoren for å redusere det indre trykketE gass tank (1000 - 2500 PSI) til et leveringstrykk på 10 PSI gjennom hele forsøket. I henhold til spesifikasjonene til denne gassregulatoren ble således en strømningshastighet på 0,00189 kubikkmeter per sekund oppnådd gjennom hele forsøket.
- Koble silikonrørene og fordelerventilen til en keramisk diskdiffusor ( Figur 1J ) inne i akvatisk tank. Lukk vannbeholderen og forsegl forsiktig lokket, beleg det med silikonfett ( figur 1K ) (sammenlignet med figur 1 ). Hvis det kreves en spesiell ikke-romtemperatur, plasserer du det hypokale kammeret i en laboratorieinkubator med ønsket temperatur.
- Avhengig av hvilken type embryoer som brukes i forsøket fyller du den hypoksiske kammertanken med riktig embryonmedium og begynner å diffundere gassblandingen gjennom den keramiske skive-diffusoren. Equilibrere i 10-15 min.
- Etter ekvilibrering med thE ønsket oksygenblanding, måle oksygenkonsentrasjon i vannet ved bruk av en oksymeter eller oksygenprobe. Bruk en oksymeter med fiberoptisk oppløst oksygen- og temperatursensor til dette formålet.
- Velg forsiktig embryoer for forsøket, bruk hele og levende embryoer til hypoksi inkubasjon. Her, våre froskembryoner av stadium 38 eller sebrafiskembryoer 4 dpf i forsøkene presentert her.
- Plasser embryotene i inkubatoren ( Figur 1K ) som inneholder gassinkubasjonskammeret og la dem balansere til temperaturen på inkubatoren.
- Overfør embryoene forsiktig inn i brønnene i den mesede 24-brønnplaten ( Figur 1B ) til gassinkubasjonskammeret ved hjelp av en plastpipette. Bruk alltid en plastpipette for embryooverføring gjennom protokollen.
MERK: Hver brønn på denne platen kan inneholde oppTil 5 froskembryoer fra stadium 38 eller opptil 7 sebrafiskembryoer på 4 dpf. Merk brønnene forsiktig hvis du bruker forskjellige genotyper. - Opprettholde gassinkubasjonskammeret under en konstant infusjon med gassblandingen av valg i 5 timer eller i lengre tid som passer til forsøket. Bruk en blanding av 5% O 2 og 95% N 2 her.
- Overfør embryoene forsiktig fra gassinkubasjonskammeret tilbake til det normoksiske medium som svarer til embryotypen, og fortsett umiddelbart med trinn 3 eller 4.
- Hvis det kreves ytterligere normoksisk behandling, overfør forsiktig embryoene tilbake til det normoksiske medium som svarer til embryotypen.
3. Kontroll av vellykket hypoxi-induksjon ved å overvåke HIF-1a-nivåer
- Forberedelser
- Klargjør 0,4 mg / ml MS222-oppløsning i 0,1x MBS.
- Klargjør homogeniseringsbuffer: Kjøp radioimmunprecipitasjonsanalysebuffer (RIPA bUffer) for homogenisering av vev og tilsett mengden buffer som er nødvendig for ditt forsøk med Protease Inhibitor til en endelig konsentrasjon 1: 100 v / v.
- Klargjør løsninger for Western blot.
- Forbered 4x Laemmli gelbelastningsbuffer: 425 mM Tris pH 8,0, 40% v / v glycerol, 8% v / v SDS, 4% v / v beta-merkaptoetanol, 0,5% v / v bromfenolblått, 10 ml totalt volum ddH 2 O.
- Forbered 5x løpebuffer: 15 g Trizma base, 72 g glycin, 5 g SDS, 1 liter totalt volum ddH 2 O.
- Forbered overføringsbuffer: 2,66 g Trizma base, 14,4 g glycin, 200 ml 100% metanol, 1 liter totalt volum ddH20.
- Forbered 10x TBST: 5 mL 1 M Tris pH 8,0, 30 mL 5M NaCl, 2,5 mL Tween 20, 1 L totalt volum H20.
- Klargjør blokkering: 4% v / v skummetmælkspulver i 1x TBST.
- Samling av vev
- Anesteser embryoene ved å bade i 0,4 mg / ml MS222-løsning16 , 17 og overføre dem til et plastreaksjonsrør fylt med homogeniseringsbuffer ved hjelp av en plastpipett. Bruk 20 μl buffer per embryo. Merk at minst 5 froskembryoer fra stadium 38 eller 7 sebrafiskembryoner på 4 dpf er påkrevet for å bestemme en signifikant endring i HIF1a-proteinnivåer.
- Homogeniser vevet ved hjelp av en egnet vevshomogenisator eller en sonikator. Fjern rusk ved sentrifugering (15 min, 13 000 xg; 4 ° C).
- Alternativt, dissekere retina fra de bedøvede froskembryoene 17 og homogenisere som ovenfor. Bruk 20 μl homogeniseringsbuffer pr. 10 retinas.
- Ta supernatanten ved hjelp av en pipette, denaturering ved 85 ° C i 5 minutter og supplement med Laemmli gelbelastningsbuffer til en sluttkonsentrasjon på 1x v / v ( f.eks . Tilsett 5 μl 4x Laemmli buffer til 15 μL homogenat). Bruk denne supernatanten til WesTern blot eller fryse prøvene ved -20 ° C.
- Western Blot
- Last opp prøvene fremstilt som beskrevet i trinn 3.2 på en forhåndsinnstilt 12% gel i et elektroforesystem ved bruk av 1x v / v løpebuffer. Bruk en proteinstige for bestemmelse av proteinstørrelse. Overfør proteinene på en nitrocellulosemembran (0,45 um membran) i overføringsbuffer i 1 time pakket på is ved 4 ° C, i henhold til produsentens protokoll.
- Blokker u spesifikke bindingssteder som inkuberer membranen i blokkeringsbuffer i 60 minutter. Følg med 3 x 10 min vasker i 1x TBST.
- Inkuber membranen i oppløsninger av kanin anti-HIF-1a antistoff og mus anti-a-tubulin fortynnet henholdsvis 1: 100 v / v og 1: 5000 v / v i Blokkoppløsning i 2,5 timer ved RT. Følg med 3 x 10 min vasker i 1x TBST.
- Til gjenkjenning inkuberes i geit-anti-kanin og geit-anti-mus HRP-konjugerte antistoffer fortynnet 1: 1000 volum / volum i blokkeringsoppløsning i 1 time.Følg med 3 x 10 min vasker i 1x TBST og visualiser HRP-fargingen ved hjelp av et kommersielt sett og en valgfri utviklingsmaskin.
- Kvantifiser mengden av HIF1a-protein ved å bruke digital kvantifisering.
4. Overvåkning av celleproliferasjon i hypoksi
- Forberedelser
- Forbered 5 mM EdU-oppløsning i det valgte embryo-medium. Løsningen kan brukes umiddelbart eller alikvotert og oppbevares ved -20 ° C i opptil 6 måneder.
- Forbered fosfatbuffert saltvann (PBS) eller kjøp PBS fra kommersielle ressurser. Autoklav i 10 minutter ved 115 ° C.
- Klargjør løsninger for påvisning av EdU-inkorporering.
- Forbered fikseringsløsning: 4% v / v 16% Formaldehydbestandsløsning i PBS.
- Tilbered sukroseoppløsning: 30% w / v sukrose i PBS.
- Klargjør PBST: 0,1% v / v Triton X-100 i PBS.
- Forbered Blokkoppløsning: 10% v / v Heat-inaktivert geiterum (HIGS) i PBST.
- Forbered DAPI-løsning: 1: 1000 v / v 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i PBST.
- Inkubasjon av embryoer i hypoksi for EdU-inkorporering
- Fyll gassinkubasjonskammeret med 400-500 ml 5 mM EdU-løsning tilsatt 1% v / v DMSO. Forekvilibrere løsningen med samme gassblanding som ble brukt i forsøket i 15 minutter før forsøket. Legg merke til at volumet av inkubasjonsløsningen kan minimeres ved å feste kortere stenger ( figur 1E ) på nettbunnplaten.
- Koble gassrøret til gassylinderen med en gassblanding på 5% O2 og 95% N2. Inkuber løsningen i 15 minutter.
- Overfør embryoene til det hypoksiske kammeret, fordel dem jevnt mellom brønnene og inkuber i 2 timer. Hver brønn kan passe opptil 5 froskembryoer fra stadium 38 eller opptil 7 sebrafiskembryoer 4 dpf.
- Analyser embryoetS for EdU inkorporering.
- Tidssyklus av embryoinkubering i hypoksi og EdU-inkorporering
- Fyll gas inkubasjonskammeret med 500 ml embryo medium av valg. Koble gassrøret til gassylinderen som inneholder en gassblanding på 5% 02 og 95% N2 og ekvilibrere mediet med gassblandingen i 15 minutter.
- Overfør embryoene til det hypoksiske kammeret, fordel dem jevnt mellom brønnene og inkuber for ønsket tidsperiode opptil 48 timer. I de siste 1 timene erstattes embryomediet med 5 mM EdU-løsning tilsatt 1% v / v DMSO.
- Overfør embryoerene tilbake til den normoksiske parabolen og analyser for EdU-inkorporering.
- EdU inkorporering gjenkjenning og analyse
- Anesteser embryoene ved å bade i 0,4 mg / ml MS222-løsning.
- Overfør embryonene til et passende glass hetteglass og fest ved inkubering i Fixeringsløsning for 2 haT RT eller O / N ved 4 ° C. Følg med 3 x 10 min vasker i PBS. Overfør embryoene forsiktig til sukroseoppløsningen for væskekryoproteksjon. Inkuber i 4 timer eller til embryoene synker til bunnen av glassflasken.
- Embed embryoene i innebygd medium (optimal skjæringstemperaturforbindelse). Kryoseksjon blokkeres med embryoer umiddelbart eller lagres i opptil 14 d ved -80 ° C.
- Kryoseksjon blokkene som inneholder embryoer ved hjelp av en kryostat. Samle seksjoner av 12 μm (sebrafiskembryoer) eller 16 μm (froskembryoer) tykkelse på mikroskopdyser og tørk. Behandle kryokoseksjoner umiddelbart eller lagre ved -20 ° C i opptil 3 måneder.
- Oppdag EdU-inkorporering ved immunfluorescerende farging ved bruk av et kommersielt kjemiutstyr. Forbered mengden EdU Reaction Mix nødvendig for antall kryoseksjoner i forsøket, som beskrevet av produsenten.
- For 500 μl EdU Reaction Mix, bruk 430 μL 1X EdU reaksjonsbuffer, 20 μl CuSO 4 , 1,2 μL Alexa Fluor azid, 50 μl 1X EdU buffer additiv.
- Vask kryoseksjonene en gang med PBS for å fjerne embeddingsmediet og 3 x 5 min med PBST for å permeabilisere vevet. Inkubér kryosektene i Blokkeringsløsning i 30 minutter.
- Inkubér kryosektene med EdU Reaction Mix i 1 time og etterfulgt av 3 x 10 minutter vasker i PBST. Costain cryosections med DAPI løsning i 15 min, etterfulgt av 3 x 10 min vasker i PBST. Monter lysbildene med fargede kryoseksjoner i monteringsmedium, deksel med deksel og la den tørke før du analyserer under et fluorescerende mikroskop eller lagrer ved 4 ° C i opptil 1 år.
- Analyser kryosektene med anti-EdU-farging under et invertert konfokalt skanningsmikroskop og bestem antall EdU-positive celler ved bruk av digital kvantifisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å bruke det hypoksiske kammersystemet som vi presenterer her, kan vi undersøke effekten av hypoksi enkeltvis og in vivo hos hele levende dyr. Hypoksi kan induseres ved å plassere hele frosk- eller sebrafiskembryoer i det hypoksiske kammeret ( Figur 1 ), og gjennomføres på forskjellige kombinasjoner av forhold. Et bilde av vårt gjennomførte gasskammeroppsett er vist på figur 2 . Vi har overvåket oksygenkonsentrasjonen i inkubasjonsmediet ved hjelp av en fiberoptisk oksygensensor (2.1.9) på forskjellige tidspunkter under forsøket. Disse dataene indikerer at vi har indusert stabil hypoksi (6-6,5% oppløst oksygen) gjennom alle forsøkene våre ( tabell 1 ).
Først vurderte vi allestedsnærværende samt retinale nivåer av HIF-1a i normoksi og i hypoksi som indusert i vårt hypoksiske kammer. HIF-1αEr et protein som er stabilisert under lave oksygenkonsentrasjoner. Vi målte HIF-1a nivåer i hele froskembryo lysater holdt under normal oksygenkonsentrasjon eller utsatt for 5% hypoksi og i lysater av deres isolerte retinas. Som vist i figur 3 stabiliseres HIF-1a under hypoksi i både hele embryoer og i retinaser. Stabiliseringen av HIF-1a oppnås i forskjellige brønner av inkubasjonsplaten med nettbunn ( figur S1 ).
Som vi tidligere har vist, påvirker hypoksi spredning av retinale stamcelleforløpere i ciliary marginalsone (CMZ) i netthinnen 13 . Således er overvåkning av proliferasjonen i CMZ ved hjelp av EdU-inkorporering en god markør for vellykket induksjon av hypoksi. Vi inkuberte embryoer i et hypoksisk kammer opprettholdt ved 5% oksygen og bedømt retinalproliferasjon som beskrevet trinn 4.2. Som forventetEd, normoksic kontroll retinas viste intens EdU farging i CMZ, hvor proliferative forfedre bosatt i både frosk ( fig. 4B og 4D ) og zebrafish embryoer ( fig. 5A og 5C ). Etter oksygenmangel i det hypoksiske kammeret ble det observert en kraftig reduksjon i CMZ-stamfarsproliferasjon i begge froskene ( figur 4C-4D ) og sebrafiskembryoer (figur 5B, 5C). For å bestemme effektens omfang utførte vi et tidskurs, inkubering av embryoer i hypoksisk kammer i lengre perioder på opptil 24 timer, overvåkning av proliferasjon ved EdU-inkorporering som beskrevet i trinn 4.3. Vi kunne vise at nedgangen i retinal progenitor proliferation var akutt og størst innen 2 timer, og vedvarende i mange timer ( Figur 4D ), mens embryoer utviklet seg normalt i henhold til deres utviklingsstadium. Dette resultatet antyder at vårt system effektivt kan indusere hypoksi i et mål tiSsue av interesse, ved korte inkubasjonstider, samt opprettholde disse forholdene i lengre perioder mens de støtter normal embryoutvikling.
Figur 1: Skjematisk representasjon av eksperimentell gasskammeroppsett. ( A ) oppdrettsvanntank (22 x 10,5 cm bredde) x 10,5 cm (høyde)) ( B ) 24-brønnplate med maskebunn (12,8 x 8,6 x 1,7 x 1,5 cm brønn diameter) Filter med en maskediameter på 0,1-0,2 mm ( D ) tunneler på 10 (lengde) x 5 mm (diameter) ( E ) Teflon eller PVC stenger med passende diameter og 30 mm lengde ( F ) silikonrør ( G ) gassbeholder med Den ønskede oksygen / CO 2 -blanding ( H ) fordelerventil ( I ) gassventil ( J ) cerSprinkler ( K ) tanklokk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Et bilde av eksperimentell gasskammeroppsett. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Måling av oksygenkoncentrasjon ved forskjellige inkubasjonstider i gasskammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne f igur.
Figur 3: HIF-1a-nivåer øker ved hypoksi-induksjon i Xenopus- embryoer og deres Retinas. Western blots av proteinlysater fra hele embryoer ( A ) eller fra isolerte embryonale retinaser ( B ) holdt under normale oksygenkonsentrasjoner eller i hypoksi. Blots ble undersøkt for HIF-1a-underenhet og a-tubulin. Minst 5 embryoer eller 22 retinas ble tatt for hver tilstand ( n = 5) ( C, D ) Kvantifisering av Western blot utført i henholdsvis ( A, B ). Protein nivåer av HIF-1a ble normalisert til protein nivåer av a-tubulin. Feilstenger representerer standardavvik mellom eksperimenter. * P -value <0,05, *** p -value <0,001; N = 5.D / 55710 / 55710fig3large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Hypoksi reduserer spredning av progenitorer i retinal stamcelle nisje av froskembryoer. ( A ) Skjematisk representasjon av et tverrsnitt gjennom en 38-trinns Xenopus retina, som indikerer plasseringen av ciliary marginalsone (CMZ) ( B , C ) EdU-inkorporering målt etter en 2 timers EDU-puls i DAPI-farget retinas fra 38 trinn Froskembryoer holdt under normoksi ( B ) eller i hypoksisk kammer ( C ). Magenta = DAPI flekk; Grå = EdU flekk. Skalestenger = 50 μm ( D ) Kvantifisering av eksperimentet utført i B og C. Feilstenger representerer standardavvik. ***
Figur 5: Hypoksi reduserer spredning av progenitorer i retinal stamcelle nisje av 4 dpf sebrafiskembryoer. EdU-inkorporering målt etter en 2 timers EDU-puls i DAPI-farget retinas fra 4 dpf gamle WTe-sebrafiskembryoer holdt undEr normoksi ( A ) eller i hypoksisk kammer ( B ). Magenta: DAPI flekk; Grå: EdU flekk. Skalestenger = 50 μm ( C ) Kvantifisering av eksperimentet utført i B og C. Feilstenger representerer standardavvik. *** p- verdi <0,001; N = 7. For hver tilstand ble 10-15 retinas kvantifisert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende Figur 1: HIF-1a-nivåer øker på hypoksi-induksjon konsekvent i forskjellige brønner på platen og mellom forskjellige eksperimenter. Western blots av proteinlysater fra hele Xenopus- embryoer holdes under normale oksygenkonsentrasjoner ellerI to forskjellige brønner i det hypoksiske kammer under induksjon av hypoksi i 2 timer i forsøk 1 ( A ) eller i forsøk 2 ( B ). Blots ble undersøkt for HIF-1a-underenhet og a-tubulin. 5 froskembryoer fra stadium 38 ble tatt for hver tilstand. Eksperiment 1 og 2 er uavhengige biologiske replikater ( C, D ) Kvantifisering av de vestlige blottene utført i henholdsvis ( A, B ). Protein nivåer av HIF-1a ble normalisert til protein nivåer av a-tubulin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi presentert en enkel, men robust ny metode for å indusere hypoksi som er justert for bruk med frosk- og sebrafiskembryoer, men kan også være egnet for andre akvatiske organismer. Den største fordelen med denne metoden ligger i sin enkelhet og kostnadseffektivitet. Likevel er resultatene oppnådd med denne metoden svært robuste. Vi har vist at hypoksi kan effektivt framkalles i kammeret både i hele embryoer og i spesifikt vev - her, retina. For å fastslå effektiviteten av hypoksi-induksjonen har vi overvåket nivåene av HIF-1a-protein i hele embryo- og retinallysater. Ifølge resultatene kan hypoksi-induksjonen sees som vellykket hvis en økning av HIF-1a-nivåer kan observeres om 1 time i hypoksikkammeret sammenlignet med normoksisk kontroll og normalisert til globale proteinnivåer, f.eks . Ved bruk av a-tubulinnivåer Som kontroll. Vi bekreftet aktiviteten av hypoksi i vev ved å overvåke stamcelleproliferAtion i retina ved EdU inkorporering, og kunne vise, i samsvar med våre tidligere publiserte resultater 13 , at hypoksi indusert ved hjelp av oppsettet presentert her fører til en reduksjon av retinalt stamcelleproliferasjon i både frosk- og sebrafiskembryoer.
En av de kritiske trinnene i denne protokollen er å sikre at det hypoksiske kammeret er riktig forseglet. Det oppnås ved å bruke en passende tetning på tanklokket, som var silikonfett i vårt tilfelle. I tillegg vil plassering inne i en inkubator bidra til å unngå lekkasje av atmosfærisk oksygen inn i kammeret ved å gi en ekstra barriere. En måling av oksygenkonsentrasjon med en passende sonde eller elektrode sikrer også at hypoksiske oksygenivåer holdes stabile og uten svingninger. I tillegg bør det tas hensyn til å unngå kammeråpning i lange perioder mens man utveksler løsninger eller prøver i mellom eksperimenter.
Gitt rask likevektIbrationstider på 10-15 minutter for hypoksi etablering, er det bare nødvendig med en liten mengde gassblanding og en lav gassstrømning for å opprettholde systemet selv for lengre tidsperioder enn beskrevet i de representative resultatene (24 timer). Løsningene som brukes i forsøket, bør forhåndsekvibreres for å oppnå hypoksi i 15 minutter før inkubering i kammeret (som beskrevet i 4.2.1). Vi har brukt det hypoksiske kammeret i løpet av 48 timer med konstant hypoksi uten noen feil, sett fra våre oksygenkonsentrasjonsmålinger ( Tabell 1 ). Det skal bemerkes at korrekt gassdiffusjon må styres under lengre inkubasjonstider. Endelig bør det tas hensyn når du plasserer embryoene i brønnene (trinn 2.2.1) for å unngå blanding av embryoer fra forskjellige mutantdyr / eksperimentelle forhold. Dette er ganske enkelt å oppnå gitt de relativt høye veggene i de enkelte brønnene på platen.
Til tross for å være en enkel, men effektivOg robust system for hypoksi-induksjon, har bruken av kammeret beskrevet her en ulempe for eksperimenter som krever bruk av dyre inkubasjonsløsninger og medier. Det minimale volumet av media i kammertanken bør ikke falle under 400 ml. Imidlertid kan justeringer gjøres for å passe til lavere volumer: Vi har lyktes å justere lengden på stengene ( Figur 1E ) festet til platen (2.1.4 og 4.2.1) slik at vi kun trenger 50 ml media / løsning . Selv om det ikke er ideelt for lengre inkubasjonstider, kan dette oppsettet passe til samme gassrør og kan være forseglet for å sikre tilstrekkelig hypoksi i opptil 8 timer.
Samlet sett kan vårt gasskammeroppsett brukes til bruk med noen organismer av vannmodell og er skilt fra andre lignende kommersielt tilgjengelige systemer, med enkelhet, kostnadseffektivitet og robusthet. Når man har mestret, kan den brukes til direkte in vivo eksperimenter, i en gitt tidsperiode og under et hvilket som helst ønskeD-gassatmosfære, inkludert hypoksi, hyperoksi eller andre gassblandinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Support from Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z til WAH og DFG fellesskapet KH 376 / 1-1 tildelt HK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl/0.1x MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3/0.1x MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1x MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca(NO3)2/0.1x MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | CG10 | Frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | Gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | Aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | Gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | Hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | Hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | Hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | For embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | Embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | Tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | Tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4x Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4x Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4x Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10x TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | Tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | Tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Oxoid | BR0014G | 1x |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) | Sigma | G6767-100ml | Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | Embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | Mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
- Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
- Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude? Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
- Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
- Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
- Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
- Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
- Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
- Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
- Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
- Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
- Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Nieuwkoop, D. P., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
- McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).
