Summary
Apresentamos um novo sistema de câmara hipóxico para uso com organismos aquáticos, como embriões de sapos e zebrafish. Nosso sistema é simples, robusto, econômico e permite a indução e sustentação da hipoxia in vivo e até 48 h. Apresentamos 2 métodos reprodutíveis para monitorar a eficácia da hipoxia.
Abstract
Aqui, apresentamos um novo sistema de indução de hipoxia, que desenvolvemos para estudar os efeitos da hipóxia em organismos aquáticos, como embriões de sapos e zebrafish. Nosso sistema compreende uma câmara com uma configuração simples que, no entanto, é robusta para induzir e manter uma concentração específica de oxigênio e temperatura em qualquer solução experimental de escolha. O sistema apresentado é muito econômico, mas altamente funcional, permite a indução e sustentação da hipoxia para experiências diretas in vivo e por vários períodos de tempo até 48 h.
Para monitorar e estudar os efeitos da hipóxia, empregamos dois métodos - aferição de níveis de fator 1alpha (HIF-1α) induzível por hipoxia em embriões inteiros ou tecidos específicos e determinação da proliferação de células estaminais da retina por 5-etinil-2'- Incorporação de desoxiuridina (EdU) no DNA. Os níveis de HIF-1α podem servir como marcador de hipoxia geral em todo o embrião ou tecidoDe escolha, aqui retina embrionária. A incorporação de EdU nas células de proliferação da retina embrionária é uma produção específica de indução de hipoxia. Assim, mostramos que os progenitores de retina embrionária hipóxica diminuem a proliferação dentro de 1 h de incubação sob 5% de oxigênio de embriões de sapo e zebrafish.
Uma vez dominado, nossa configuração pode ser empregada para uso com pequenos organismos modelo aquáticos, para experiências diretas in vivo , qualquer período de tempo e sob concentração de oxigênio normal, hipóxica ou hiperóxica ou sob qualquer outra mistura de gás.
Introduction
A pesquisa de hipoxia tem inúmeras aplicações. Estes incluem a investigação da patogênese e o desenvolvimento de tratamentos para condições médicas caracterizadas por hipoxia 1 e doença aguda de alta altitude 2 . O estresse hipóxico causa grandes alterações metabólicas em todos os organismos que necessitam de oxigênio. O estresse hipóxico também influencia o crescimento e desenvolvimento fetal e a patogênese de várias doenças humanas, incluindo a restrição do crescimento intra-uterino 3 . O estresse hipoxico não só pode levar a um menor peso ao nascer, mortalidade fetal e neonatal, mas também pode resultar em muitas complicações na vida adulta, como doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2, obesidade e hipertensão 4 . O estresse hipóxico também é freqüentemente observado durante o desenvolvimento de tumor sólido, quando o tecido tumoral ultrapassa o suprimento de sangue. Por conseguinte, é crucial poder estudar os efeitos da hipóxia in vivo e directamente durante o embrião Desenvolvimento yônico.
Entre os métodos mais bem conhecidos que foram empregados para estudar os efeitos da hipoxia durante o desenvolvimento é o uso de cloreto de cobalto no meio de crescimento ou a incubação do organismo em uma câmara hipóxica. O cloreto de cobalto induz artificialmente uma resposta hipóxica sob a concentração normal de oxigênio, devido ao seu papel na estabilização do alfa de factor 1 induzível pela hipoxia (HIF-1a), prevenindo sua degradação proteossômica 5 , 6 , 7 . No entanto, sendo um método conveniente 8 , o uso de cloreto de cobalto, bem como outros miméticos de hipóxia química semelhantes, podem ter efeito deletério inespecífico sobre células e tecidos, por exemplo , apoptose 9 . Portanto, as câmaras hipóxicas são um método melhor para a indução de "hipoxia natural" em organismos vivos ao longo do desenvolvimento normal.
Nós nos concentramos no desenvolvimento de um sistema de indução de hipoxia em embriões de animais aquáticos, tanto os sapos quanto o peixe-zebra tornaram-se organismos modelo informativos de vertebrados para estudos de numerosos processos biológicos, bem como modelos para várias doenças humanas. Embriões de sapo e zebra Desenvolver externamente, eliminando a complicação da compensação materna. Além disso, um rápido processo de desenvolvimento permite manipular fatores ambientais e observar as mudanças fenotípicas na formação de órgãos em tempo real. Além disso, muitos componentes das principais direções de transdução de sinal são altamente conservados em Esses organismos modelo e foram caracterizados em detalhes por uma grande quantidade de literatura. A principal vantagem no uso de sapos e embriões de peixe-zebra para estudar os efeitos da hipóxia no desenvolvimento de vertebrados é que todos os processos podem ser monitorados diretamente, já que o oxigênio penetra rapidamente nos embriões. Assim, em sapos e peixe-zebra, como em contraste com outros organismos modelo, comoEmbriões de camundongo, a influência de uma concentração específica de oxigênio pode ser estudada no tecido de interesse, sem levar em consideração a presença ou falta de vasculatura funcional.A maioria das configurações comercialmente disponíveis para incubação hipóxica tem a desvantagem de ser comparativamente grande e ter custos de funcionamento correspondentemente elevados. Além de seu alto custo inicial e consumo de gás, equilíbrio e manutenção de câmaras de hipoxia comuns requer manutenção de atmosfera hipoxica constante contra o gradiente de gás que ocorre naturalmente nestas câmaras devido ao seu maior tamanho e / ou respiração do organismo. Isso requer emprego de ventiladores de gás e um sistema de resfriamento, o que aumenta a quantidade de equipamentos necessários adicionais, impede a destreza do pesquisador e diminui a simplicidade do procedimento experimental. Em contraste, a configuração que apresentamos aqui é comparativamente robusta, mas muito econômica, pequena, fácil de estabelecer e permite que fEquilíbrio de gás, atmosfera hipóxica estável e troca simples de materiais e soluções dentro da câmara. Nosso sistema pode ser empregado para uso com qualquer organismo modelo aquático de interesse.
Nós construímos uma câmara hipóxica que é convenientemente pequena e, portanto, pode ser colocada dentro de uma incubadora comum de laboratório, que permite facilmente procedimentos experimentais a qualquer temperatura específica. Fornecer um controle conveniente da temperatura, bem como a concentração de oxigênio no meio, a vantagem do nosso sistema contra as incubadoras de hipoxia comercialmente disponíveis reside no seu pequeno tamanho e eficiência de custos. Assim, nossa configuração pode ser estabelecida usando suprimentos laboratoriais gerais disponíveis para a maioria dos laboratórios de pesquisa e não exige materiais caros. Além disso, nossa configuração não gera calor, ao contrário das incubadoras de hipoxia comercialmente disponíveis, e permite o uso a temperaturas inferiores à temperatura ambiente colocadas em uma incubadora. A laSt é especialmente crítico para o trabalho com organismos de sangue frio, como sapos e peixes, onde as taxas de desenvolvimento e metabólicas são fortemente dependentes da temperatura.
Sendo muito rentável e facilmente construído, a nossa câmara de incubação de gás é, no entanto, muito versátil no estabelecimento de várias condições hipóxicas ou hiperóxicas, além de permitir uma administração rápida e fácil de diferentes meios e soluções para uma grande quantidade de condições experimentais. Além disso, empregando uma placa de 24 poços em vez de pratos comumente usados ou tanques de laboratório 10 , 11 , 12 , nosso sistema permite a observação e tratamento experimental de várias condições mutantes ao mesmo tempo.
Para controlar a indução correta de hipoxia, monitoramos os níveis da proteína HIF-1a por detecção de Western Blot. Além disso, o número de células que proliferam antes e depois da incubaçãoN na câmara hipóxica pode ser usado para determinar se a hipóxia foi induzida no tecido. Este método baseia-se nos resultados publicados anteriormente 13 , mostrando que a proliferação no nicho das células-tronco da retina embrionária diminui após a indução da hipoxia. Assim, monitorizamos o nível de proliferação de células estaminais da retina por adição de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) ao meio embrionário e medindo sua incorporação no DNA de células que proliferam recentemente.
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Protocol
Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Cambridge.
1. Manutenção de animais
- Embriões de sapo
NOTA: Os embriões podem ser criados e mantidos de acordo com o animal e instalações laboratoriais. Aqui, um exemplo da manutenção animal é descrito.- Preparar solução de solução Barth's Solution (MBS) de 0,1x: NaCl 0,88 mM, KCl 10 uM, NaHCO3 24 uM, HEPES 100 μM, MgSO4 8,2 μM, Ca (NO3) 2 , 3,3 μM e CaCl2 a 4,1 uM, pH 7,6 .
- Obter embriões Xenopus laevis por adubação in vitro .
- Induzir a ovulação em sapos africanos de raparigas africanas ( Xenopus laevis) por injeção com gonadotrofina sérica da maria grávida uma semana (60 UI) e 12 h (500 UI) antes da postura do ovo.
- Recolher oócitos e fertilizá-los in vitro com testículo masculino homogeneizado.
- RaiEmbriões em 0.1x MBS a 16 - 18 ° C. Etapa os embriões de acordo com a tabela Normal de Xenopus laevis 14 . Tome cuidado para selecionar embriões inteiros e vivos para a experiência.
- Embriões de peixe-zebra
NOTA: Os embriões podem ser criados e mantidos de acordo com o animal e instalações laboratoriais. Aqui, um exemplo da manutenção animal é descrito.- Preparar meio de embrião: NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, CaCl2 0,33 mM, MgSO4 0,33 mM e azul de metileno 0,00001%.
- Manter e produzir WT AB cepa Danio rerio a 26,5 ° C.
- Recolher os embriões na manhã da adubação, aumentar até 4 dias após a adubação (dpf) a 28 ° C em meio de embrião preparado como descrito acima, selecionar e andar como descrito anteriormente 15 .
2. Indução da hipoxia in vivo
- Use um tanque aquático de reprodução ( Figura 1A ) que é normalmente usado na instalação de peixes para construção de câmara hipóxico. Este tanque deve caber uma placa de 24 poços.
- Prepare uma placa de 24 poços com fundo de malha, conforme descrito na Figura 1 . Remova o fundo de plástico da placa de 24 poços ( Figura 1B ), por exemplo , usando uma fresadora para este fim.
- Preencha o espaço entre o plástico dos poços e as paredes da placa com resina epoxi. Anexe qualquer filtro de nylon ( Figura 1C ) com um diâmetro de malha de 0,1-0,2 mm ao plástico revestido com resina e deixe a placa ser completamente seca.
- Uma vez seco, perfure três ou quatro túneis ( Figura 1D ) de 10 mm de comprimento e 5 mm de diâmetro nas paredes de placas revestidas com resina e malha. Anexar barras de plástico ou teflon( Figura 1E ) de diâmetro apropriado e 30 mm de comprimento para os túneis e coloque a placa no tanque de escolha.
- Coloque a placa de 24 poços de malha no tanque aquático de escolha. Usando a tubulação de silicone ( Figura 1F ), prenda um tanque de gás ( Figura 1G ) com a mistura O 2 / N 2 desejada ou outra mistura de gás de escolha para uma válvula distribuidora ( Figura 1H ) usando um regulador de gás apropriado (IOC) (BOC 200 Barra). Aqui, use tanques de gás contendo uma mistura de 5% de oxigênio e 95% de N 2 nas experiências de hipóxia apresentadas aqui.
- Ajuste o caudal de oxigênio no meio da câmara para 0,0017-0,0019 metros cúbicos por segundo. Sob esta taxa de fluxo de gás, nenhum perigo do meio deve ser visto nos poços da placa.
- Utilize o regulador de gás de duas fases de alta pureza para este fim. Defina o regulador para reduzir a pressão interna doE tanque de gás (1000 - 2500 PSI) a uma pressão de entrega de 10 PSI durante todo o experimento. Assim, de acordo com as especificações deste regulador de gás, um fluxo de 0,00189 metros cúbicos por segundo foi alcançado durante todo o experimento.
- Conecte a tubulação de silicone e a válvula de distribuição a um difusor de disco cerâmico ( Figura 1J ) dentro do tanque aquático. Feche o tanque aquático e selar com cuidado a tampa, revesti-lo com graxa de silicone ( Figura 1K ) (compare com a Figura 1 ). Se for necessária uma temperatura não-ambiente específica, coloque a câmara hipóxica em uma incubadora de laboratório da temperatura desejada.
- Dependendo do tipo de embriões utilizados no experimento, encha o tanque de câmara hipóxico com o meio de embrião apropriado e comece a difundir a mistura de gás através do difusor de disco cerâmico. Equilibre-se por 10-15 min.
- Após o equilíbrio com oE desejada mistura de oxigênio, medir a concentração de oxigênio na água usando um oximetro ou sonda de oxigênio. Aqui, use um oxímetro com o sensor de temperatura e oxigênio dissolvido em fibra óptica para este fim.
- Selecione cuidadosamente os embriões para o experimento, use embriões inteiros e vivos para a incubação de hipoxia. Aqui, nós embriões de sapo do estágio 38 ou embriões de peixe zebra 4 dpf nos experimentos aqui apresentados.
- Coloque os pratos de embrião na incubadora ( Figura 1K ) contendo a câmara de incubação de gás e deixe-os equilibrar à temperatura da incubadora.
- Transmita cuidadosamente os embriões nos poços da placa de 24 poços mesclado ( Figura 1B ) da câmara de incubação de gás, usando uma pipeta de plástico. Use sempre uma pipeta de plástico para transferência de embriões ao longo do protocolo.
NOTA: Cada poço desta placa pode conterPara 5 embriões de sapo do estágio 38 ou até 7 embriões de peixe cebre de 4 dpf. Rotule os poços com cuidado se estiver usando diferentes genótipos. - Manter a câmara de incubação de gás sob uma infusão constante com a mistura gasosa de escolha por 5 h ou por um período mais longo que se adapte à experiência. Use uma mistura de 5% de O2 e 95% de N2 aqui.
- Transfira cuidadosamente os embriões da câmara de incubação de gás de volta ao meio normoxico correspondente ao tipo de embrião e continue imediatamente com os Passos 3 ou 4.
- Se for necessário um tratamento normoxico adicional, transfira cuidadosamente os embriões para o meio normoxídico correspondente ao tipo de embrião.
3. Controle da Indução de hipoxia bem sucedida monitorando os níveis de HIF-1α
- Preparativos
- Prepare 0,4 mg / ml de solução de MS222 em 0,1 x MBS.
- Prepare o tampão de homogeneização: Compre o buffer de ensaio Radioimmunoprecipitation (RIPA bUffer) para a homogeneização do tecido e suplementar a quantidade de tampão necessária para a sua experiência com Inibidor de Protease para uma concentração final de 1: 100 v / v.
- Prepare soluções para Western blot.
- Preparar tampão de carga de gel Laemmli 4x: Tris 425 mM pH 8,0, 40% v / v Glicerol, SDS a 8% v / v, 4% v / v de beta-mercaptoetanol, 0,5% p / v Bromofenol Azul, volume total de 10 mL ddH 2 O.
- Preparar 5x tampão de corrida: 15 g de base de Trizma, 72 g de glicina, 5 g de SDS, volume total de 1 L ddH 2 O.
- Preparar buffer de transferência: 2,66 g de base de Trizma, 14,4 g de glicina, 200 mL de metanol a 100%, volume total de 1 L ddH 2 O.
- Preparar 10% TBST: 5 ml de Tris 1 M pH 8,0, 30 mL de NaCl 5 M, 2,5 mL de Tween 20, 1 volume total de H 2 O.
- Prepare a solução de bloqueio: 4% p / v de leite em pó desnatado em 1x TBST.
- Coleção de tecido
- Anestesiar os embriões tomando banho na solução MS222 a 0,4 mg / mL16 , 17 e transferi-los para um tubo de reação de plástico preenchido com tampão de homogeneização usando uma pipeta de plástico. Use 20 μL de tampão por embrião. Note-se que pelo menos 5 embriões de rã de estágio 38 ou 7 embriões de peixe-zebra de 4 dpf são necessários para determinar uma alteração significativa nos níveis de proteína HIF1α.
- Homogeneizar o tecido usando um homogeneizador de tecido apropriado ou um sonicador. Remova os restos por centrifugação (15 min; 13,000 xg; 4 ° C).
- Alternativamente, dissecar as retinas dos embriões de sapo anestesiados 17 e homogeneizar como acima. Use 20 μL de tampão de homogeneização por 10 retinas.
- Pegue o sobrenadante utilizando uma pipeta, desnaturar a 85 ° C durante 5 minutos e suplementar com tampão de carga de gel de Laemmli até uma concentração final de 1x v / v ( por exemplo , adicionar 5 μL de tampão 4x Laemmli a 15 μL de homogeneizado). Use este sobrenadante para o WesTern blot ou congelar as amostras a -20 ° C.
- Western Blot
- Carregue as amostras preparadas como descrito no Passo 3.2 em um gel pré-moldado de 12% em um sistema de eletroforese usando 1x v / v Tampão de corrida. Use uma escada de proteína para determinação do tamanho da proteína. Transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose (membrana de 0,45 μm) em tampão de transferência durante 1 h embalado em gelo a 4 ° C, de acordo com o protocolo do fabricante.
- Bloqueie locais de ligação inespecíficos incubando a membrana em tampão de bloqueio durante 60 min. Siga com 3 x 10 min lavagens em 1x TBST.
- Incubar a membrana em soluções de anticorpo anti-HIF-1a de coelho e anti-α-tubulina de rato diluídas 1: 100 v / v e 1: 5000 v / v, respectivamente, em solução de bloqueio, durante 2,5 h à TA. Siga com 3 x 10 min lavagens em 1x TBST.
- Para detecção, incubar em anticorpos de cabra anti-coelho e conjugado anti-camundongo de cabra diluídos 1: 1000 v / v em solução de bloqueio durante 1 h.Siga com 3 x 10 minutos de lavagem em 1x TBST e visualize a coloração HRP usando um kit comercial e uma máquina de revelação de escolha.
- Quantifique a quantidade de proteína HIF1α usando a quantificação digital.
4. Monitoramento da proliferação celular na hipóxia
- Preparativos
- Prepare solução de EdU 5 mM no meio embrionário de escolha. A solução pode ser usada imediatamente ou dividida em alíquotas e armazenada a -20 ° C por até 6 meses.
- Preparar salina tamponada com fosfato (PBS) ou comprar PBS a partir de recursos comerciais. Autoclave durante 10 minutos a 115 ° C.
- Prepare soluções para a detecção de incorporação de EdU.
- Preparar solução de fixação: 4% v / v de solução de reserva de formaldeído a 16% em PBS.
- Preparar solução de sacarose: 30% p / v de sacarose em PBS.
- Preparar PBST: 0,1% v / v Triton X-100 em PBS.
- Preparar solução de bloqueio: 10% v / v Soro de cabra inactivado pelo calor (HIGS) no PBST.
- Preparar a solução DAPI: 1: 1000 v / v 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em PBST.
- Incubação de embriões em hipoxia para incorporação de EdU
- Preencha a câmara de incubação de gás com 400-500 mL de solução de EdU 5 mM suplementada com DMSO a 1% v / v. Pré-equilibre a solução com a mesma mistura de gás utilizada no experimento durante 15 minutos antes da experiência. Note-se que o volume da solução de incubação pode ser minimizado através da fixação de varas mais curtas ( Figura 1E ) à placa inferior de malha.
- Conecte o tubo de gás ao cilindro de gás contendo uma mistura de gás de 5% de O2 e 95% de N2. Incube a solução por 15 min.
- Transfira os embriões para a câmara hipóxica, distribuindo-os uniformemente entre os poços e incubar durante 2 h. Cada poço pode acomodar até 5 embriões de sapo do estágio 38 ou até 7 embriões de peixe cebre 4 dpf.
- Analisar o embriãoS para incorporação de EdU.
- Curso temporal de incubação embrionária em hipoxia e incorporação de EdU
- Preencha a câmara de incubação com 500 ml de meio embrionário de escolha. Conecte o tubo de gás ao cilindro de gás contendo uma mistura de gás de 5% de O2 e 95% de N 2 e equilibre o meio com a mistura de gás durante 15 min.
- Transfira os embriões para a câmara hipóxica, distribuindo-os uniformemente entre os poços e incubar durante o período de tempo desejado até 48 h. Durante as últimas 1 h, substitua o meio embrionário com solução EdU 5 mM suplementada com DMSO a 1% v / v.
- Transfira os embriões de volta para o prato normoxic e analise a incorporação de EdU.
- Detecção e análise de incorporação de EdU
- Anestesiar os embriões tomando banho em solução de MS222 a 0,4 mg / mL.
- Transfira os embriões para um frasco de vidro apropriado e conserte incubando na solução de Fixação por 2 haT RT ou O / N a 4 ° C. Siga com 3 x 10 min lavagens em PBS. Transferir cuidadosamente os embriões para a solução de sacarose para a crioproteção tecidual. Incubar durante 4 h ou até que os embriões afundem no fundo do frasco de vidro.
- Incorporar os embriões em meio de incorporação (composto de temperatura de corte ideal). Blocos de criosecção com embriões imediatamente ou armazenar até 14 d a -80 ° C.
- Cryosecção os blocos contendo embriões usando um criostato. Coletar secções de 12 μm (embriões de peixe zebra) ou 16 μm (embriões de sapo) em lâminas de microscópio e deixar secar. Processe criosecções imediatamente ou armazene a -20 ° C por até 3 meses.
- Detectar incorporação de EdU por coloração imunofluorescente usando um kit de química comercial. Prepare a quantidade de EdU Reaction Mix necessária para o número de criosecções no experimento, conforme descrito pelo fabricante.
- Para 500 μL de EdU Reaction Mix, use 430 μL de 1X EdU reaction buffer, 20 μL de CuSO 4 , 1,2 μL de azida de Alexa Fluor, 50 μL de aditivo de tampão EdU 1X.
- Lave as criosecções uma vez com PBS para remover o meio de incorporação e 3 x 5 min com PBST para permeabilizar o tecido. Incubar as criosecções na solução de bloqueio por 30 min.
- Incubar as criosecções com o EdU Reaction Mix por 1 h e seguidas de 3 x 10 min lavagens em PBST. Costeie as criosecções com solução de DAPI durante 15 min, seguido de lavagens de 3 x 10 minutos em PBST. Monte as lâminas com criosecções coloridas em meio de montagem, cubra com lamínulas e deixe secar antes de analisar sob um microscópio fluorescente ou armazenando a 4 ° C por até 1 ano.
- Analise as criosecções com coloração anti-EdU sob um microscópio de varredura confocal invertido e determine o número de células positivas para EdU usando a quantificação digital.
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Representative Results
Empregar o sistema de câmara hipoxica que apresentamos aqui permite o estudo dos efeitos da hipoxia individual e in vivo em animais vivos inteiros. A hipoxia pode ser induzida colocando embriões inteiros de sapo ou zebra na câmara hipóxica ( Figura 1 ), e deve ser realizada em diferentes combinações de condições. Uma imagem da nossa configuração completa da câmara de gás é mostrada na Figura 2 . Nós monitoramos a concentração de oxigênio no meio de incubação usando um sensor de oxigênio de fibra óptica (2.1.9) em diferentes pontos de tempo durante a experiência. Esses dados indicam que induzimos hipoxia estável (6-6,5% de oxigênio dissolvido) ao longo de nossas experiências ( Tabela 1 ).
Em primeiro lugar, avaliamos níveis ubíquos e retinianos de HIF-1α na normoxia e na hipoxia induzida em nossa câmara hipóxica. HIF-1αÉ uma proteína estabilizada sob baixas concentrações de oxigênio. Medimos os níveis de HIF-1α em lisados de embriões de sapo inteiro mantidos sob concentração normal de oxigênio ou submetidos a hipoxia a 5% e em lisados de suas retinas isoladas. Conforme mostrado na Figura 3 , HIF-1α é estabilizado sob hipoxia em embriões inteiros e em retinas. A estabilização de HIF-1α é conseguida em diferentes poços da placa de incubação de fundo de malha ( Figura S1 ).
Como já mostramos anteriormente, a hipoxia afeta a proliferação de progenitores de células estaminais da retina na Zona Marginal Ciliar (CMZ) da retina 13 . Assim, monitorar a proliferação na CMZ por meio da incorporação de EdU é um bom marcador para a indução bem sucedida de hipoxia. Incubamos embriões em uma câmara hipóxica mantida a 5% de oxigênio e avaliamos a proliferação da retina conforme descrito na Etapa 4.2. Como esperadoAs retinas normoxicas de controle apresentaram coloração EdU intensa na CMZ, onde os progenitores proliferantes residem tanto em sapos ( figuras 4B quanto 4D ) e em embriões de peixe-zebra ( Figuras 5A e 5C ). Após a privação de oxigênio na câmara hipóxica, observou-se uma forte diminuição da proliferação de progenitores CMZ em ambos os embriões de sapo ( Figuras 4C-4D ) e zebrafish (Figuras 5B, 5C). Para determinar a extensão do efeito, realizamos um curso de tempo, incubando os embriões na câmara hipóxica por períodos mais longos de até 24 h, monitorando a proliferação por incorporação de EdU conforme descrito na Etapa 4.3. Poderíamos mostrar que a diminuição da proliferação da progenitores da retina era aguda e maior dentro de 2 h, e persistiu por muitas horas ( Figura 4D ), enquanto que os embriões desenvolveram-se normalmente de acordo com a fase de desenvolvimento. Este resultado sugere que nosso sistema pode induzir de forma eficiente hipoxia em um alvoInteresse, durante tempos curtos de incubação, além de sustentar essas condições por períodos mais longos, ao mesmo tempo em que apoiam o desenvolvimento normal do embrião.
Figura 1: Representação esquemática da configuração experimental da câmara de gás. ( A ) tanque aquático de criação (22 (comprimento) x 10,5 (largura) x 10,5 cm (altura)) ( B ) placa de 24 poços com fundo de malha (12,8 x 8,6 x 1,7 x 1,5 cm de diâmetro de poço) ( C ) nylon Filtro com um diâmetro de malha de 0,1-0,2 mm ( D ) túneis de 10 (comprimento) x 5 mm (diâmetro) ( E ) Teflon ou varetas de PVC de diâmetro apropriado e 30 mm de comprimento ( F ) tubo de silicone ( G ) tanque de gás com A válvula desejada de oxigênio / CO 2 ( H ) válvula distribuidora ( I ) válvula de gás ( J ) cerTampa do compartimento do difusor de disco amic ( K ). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2: Uma imagem da configuração experimental da câmara de gás. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Tabela 1: Medição da Concentração de Oxigênio em Diferentes Tempos de Incubação na Câmara de Gás. Clique aqui para ver uma versão maior deste f Igure.
Figura 3: Aumentos de níveis de HIF-1α após a indução de hipoxia em embriões Xenopus e suas retinas. Transferências de Western de lisados de proteínas de embriões inteiros ( A ) ou de retinas embrionárias isoladas ( B ) mantidas sob concentrações normais de oxigênio ou em hipoxia. Blots foram sondados para a subunidade HIF-1a e a-tubulina. Foram obtidos pelo menos 5 embriões ou 22 retinas para cada condição ( n = 5) ( C, D ) Quantificação da Western blot realizada em ( A, B ), respectivamente. Os níveis de proteína de HIF-1α foram normalizados para os níveis de proteína da a-tubulina. As barras de erro representam desvios padrão entre experiências. * P- valor <0,05, *** p- valor <0,001; N = 5.D / 55710 / 55710fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A hipoxia diminui a proliferação de progenitores no nicho de células-tronco da retina de embriões de rã. ( A ) Representação esquemática de uma seção transversal através de uma retina Xenopus de 38 estágios, indicando a posição da incorporação EdU da zona marginal ciliar (CM) ( B , C ) medida após um pulso EdU de 2 h em retinas coradas com DAPI de 38 estágios Embriões de sapo mantidos sob normoxia ( B ) ou na câmara hipóxica ( C ). Magenta = mancha DAPI; Gray = EdU mancha. Barras de escala = 50 μm ( D ) Quantificação do experimento realizado em B e C. As barras de erro representam desvios padrão. ***
Figura 5: A hipoxia diminui a proliferação de progenitores no nódulo de células estaminais da retina de 4 dpf embriões de peixe-zebra. A incorporação de EdU medida após um pulso de EdU de 2 h em retinas manchadas com DAPI de 4 dpf de embriões de peixe zebra WTe novos mantidos eEr normoxia ( A ) ou na câmara hipóxica ( B ). Magenta: mancha DAPI; Cinza: mancha EdU. Barras de escala = 50 μm ( C ) Quantificação do experimento realizado em B e C. As barras de erro representam desvios padrão. *** p- valor <0,001; N = 7. Para cada condição, foram quantificadas 10-15 retinas. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 1 suplementar: os níveis de HIF-1α aumentam após a indução de hipoxia consistentemente em diferentes poços da placa e entre experiências diferentes. Transferências de Western de lisados de proteína de embriões Xenopus inteiros mantidos sob concentrações normais de oxigênio ouEm dois poços diferentes da câmara hipóxica sob indução de hipoxia por 2 horas no experimento 1 ( A ) ou no experimento 2 ( B ). Blots foram sondados para a subunidade HIF-1a e a-tubulina. Foram obtidos 5 embriões de sapo do estágio 38 para cada condição. As experiências 1 e 2 são repetições biológicas independentes ( C, D ) Quantificação das transferências de Western realizadas em ( A, B ), respectivamente. Os níveis de proteína de HIF-1α foram normalizados para os níveis de proteína da a-tubulina. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
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Discussion
Aqui apresentamos um novo método fácil, mas robusto, para induzir hipoxia que é ajustada para uso com embriões de sapo e zebra, mas também pode ser adequada para outros organismos aquáticos. A principal vantagem deste método reside na sua simplicidade e eficiência de custos. No entanto, os resultados obtidos com este método são muito robustos. Mostramos que a hipoxia pode ser induzida eficientemente na câmara tanto em embriões inteiros quanto em tecido específico - aqui, retinas. Para determinar a eficácia da indução de hipoxia, monitorizamos os níveis de proteína HIF-1α em lisados inteiros de embriões e retina. De acordo com nossos resultados, a indução de hipoxia pode ser vista como bem sucedida, se um aumento dos níveis de HIF-1a pode ser observado após 1 h na câmara hipóxica comparado ao controle normoxico e normalizado aos níveis globais de proteína, por exemplo , usando níveis de α-tubulina Como controle. Confirmamos a atividade de hipoxia no tecido através do monitoramento da proliferação de células-troncoEm retinas pela incorporação de EdU, e poderia mostrar, de acordo com nossos resultados publicados anteriormente 13 , que a hipoxia induzida usando a configuração aqui apresentada leva a uma diminuição da proliferação de células estaminais da retina em embriões de sapo e zebrafish.
Uma das etapas críticas deste protocolo é garantir que a câmara hipóxica seja devidamente selada. É realizado usando uma vedação apropriada na tampa do tanque, que era a graxa de silicone no nosso caso. Além disso, a colocação dentro de uma incubadora ajudará a evitar vazamentos de oxigênio atmosférico na câmara, fornecendo uma barreira adicional. Uma medida da concentração de oxigênio com uma sonda ou eletrodo adequado garante também que os níveis de oxigênio hipóxicos sejam mantidos estáveis e sem flutuações. Além disso, deve-se ter cuidado para evitar a abertura da câmara por longos períodos enquanto troca soluções ou amostras entre experimentos.
Dado rápido equilTempos de calibração de 10 a 15 min para o estabelecimento da hipoxia, apenas uma pequena quantidade da mistura de gás e um baixo fluxo de gás são necessários para sustentar o sistema mesmo por períodos de tempo mais longos do que os descritos nos resultados representativos (24 h). As soluções utilizadas no experimento devem ser pré-equilibradas para atingir hipoxia durante 15 minutos antes da incubação na câmara (conforme descrito em 4.2.1). Utilizamos a câmara hipóxica durante o período de 48 h de hipóxia constante sem erros, conforme observado em nossas medidas de concentração de oxigênio ( Tabela 1 ). Deve notar-se que a correta difusão de gás deve ser controlada durante tempos de incubação mais longos. Finalmente, deve-se tomar cuidado ao colocar os embriões nos poços (Etapa 2.2.1.) Para evitar a mistura de embriões de diferentes animais mutantes / condições experimentais. Isso é bastante simples de alcançar, dado os muros relativamente altos dos poços individuais da placa.
Apesar de ser simples, mas eficazE sistema robusto para indução de hipóxia, o uso da câmara aqui descrita tem uma desvantagem para experimentos que exigem o uso de soluções e meios de incubação caros. O volume mínimo de mídia no tanque da câmara não deve cair abaixo de 400 mL. No entanto, os ajustes podem ser feitos para atender volumes menores: Conseguimos ajustar o comprimento das hastes ( Figura 1E ) anexado à placa (2.1.4 e 4.2.1) para que possamos exigir apenas 50 mL de mídia / solução . Embora não seja ideal para tempos de incubação mais longos, esta configuração pode caber na mesma tubulação de gás e pode ser adequadamente selada para garantir hipoxia suficiente até 8 h.
Em conjunto, a nossa configuração da câmara de gás pode ser empregada para uso com qualquer organismo modelo aquático e é separada de outros sistemas similares comercialmente disponíveis por sua simplicidade, rentabilidade e robustez. Uma vez dominado, pode ser usado para experiências diretas in vivo , qualquer período de tempo e sob qualquer desejoD atmosfera de gás, incluindo hipoxia, hiperoxia ou outras misturas de gases.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo apoio do Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z a WAH e a bolsa DFG KH 376 / 1-1 concedida a HK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl/0.1x MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3/0.1x MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1x MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca(NO3)2/0.1x MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | CG10 | Frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | Gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | Aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | Gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | Hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | Hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | Hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | For embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | Embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | Tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | Tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4x Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4x Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4x Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10x TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | Tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | Tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Oxoid | BR0014G | 1x |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) | Sigma | G6767-100ml | Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | Embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | Mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
- Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
- Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude? Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
- Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
- Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
- Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
- Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
- Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
- Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
- Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
- Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
- Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). Nieuwkoop, D. P., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
- McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).
