Summary
운동 선수는 매년 수백 건의 경증 외상성 뇌 손상 (mTBI) / 뇌진탕을 흡수합니다. 그러나 뇌에 대한 이들의 결과는 제대로 이해되지 못했습니다. 따라서 임상 적으로 적절한 증상을 반복적으로 반복하는 단일 및 반복 mTBI의 동물 모델은 mTBI 및 뇌진탕의 연구를 발전시킬 수있는 수단을 제공합니다.
Abstract
경미한 외상성 뇌 손상 (mTBI)은 혼란의시기, 의식 상실 (LOC), 국소 신경 학적 결손 및 기억 상실을 포함하여 뇌 기능의 급격한 상실을 초래할 수 있습니다. 접촉 스포츠에 참여하는 선수는 많은 수의 mTBI에 노출 될 위험이 높습니다. 운동 선수의 부상 정도를 보면 mTBI는 전반적인 병리학 적 변화를 일으키지 않는 경미한 부상으로 정의되지만 자발적으로 해결되는 단기간의 신경 학적 결손을 유발합니다. 마우스 및 쥐에서 mTBI를 모델링하려는 이전의 시도에도 불구하고 많은 사람들이 두개골 골절, 뇌내 출혈, 축삭 손상 및 신경 세포 죽음을 포함하는 심한 부작용을보고했다. 여기서 우리는 임상 적으로 관련된 증상을 재생하는 mTBI의 매우 재현 가능한 동물 모델을 설명합니다. 이 모델은 맞춤형 공압 임팩터 장치를 사용하여 폐두 외상을 제공합니다. 이 충격은 정밀한 속도 및 변형 파라미터 하에서 이루어지며,단일 또는 반복 진탕 mTBI의 효과에 기여하는 메커니즘을 조사 할 수있는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 모델을 만듭니다.
Introduction
외상성 뇌 손상 (Traumatic Brain Injury, TBI)은 외부의 물리적 인 힘으로부터 지속되는 두부 손상으로 정의되어 정상적인 뇌 기능을 손상시킵니다. 질병 통제 예방 센터 (CDC)는 매년 20 백만명의 미국인이 매년 TBI를지지한다고 추산하는 의회보고를 통해 심각한 사회 경제적 및 공중 보건 부담을 나타냅니다. 이것은 환자의 삶의 질에 영향을 줄뿐만 아니라, 현재 연간 765 억 달러로 추정되는 지역 사회에 매우 높은 경제적 비용을 부과합니다. 전달되는 실제 뇌 손상의 양과 급성기의 증상은 경증, 중등도 및 중증의 TBI를 정의합니다.
뇌진탕이라고도하는 경미한 외상성 뇌 손상 (mTBI)은 매년보고되는 TBI의 70 % 이상을 차지합니다 1 . 권투 및 축구 2를 포함하여 위험도가 높은 접촉 스포츠에 참여하는 선수들 사이에서 가장 일반적입니다. 온건파와 달리또는 심한 형태의 TBI로 인해 mTBI와 관련된 즉각적인 손상 및 증상이 때로는 분명하지 않습니다 3 . 대조적으로, mTBI의 장기적인 효과는 중등도 및 중증 형태에서 나타나는 것과 마찬가지로 쇠약해질 수 있습니다. 반복되는 mTBI로 고통받는 사람들은 만성 외상성 뇌 질환 (CTE)뿐만 아니라 기타인지 및 퇴행성 질환을 발병하는 것으로 나타났습니다 4 . 따라서 mTBI 이후에 발생하는 단기 증상 및 전반적인 장기 손상에 기여하는 메커니즘에 대한 이해를 높이는 것이 중요합니다.
사람의 경우, 스포츠 제동에 대한 제 4 차 국제 회의 (취리히 2012) 5 에 정의 된 뇌진탕의 정의는 스포츠 뇌진탕의 경미한 수준은 경미하고, 병리학 적으로 큰 변화를 일으키지 않지만 단기간의 신경 학적 결손을 유발한다고 명시합니다 자발적으로 해결됩니다. 실제로, 수신기nt 연구는 머리 충돌 원격 측정 시스템을 사용하는 고등학교 축구 선수의인지 장애에 대한 mTBI의 영향을 조사했습니다. 이 연구는 선수가 한 시즌에 20 그램을 초과하는 헬멧 충격을 견뎌내는 시간이 226 (평균, 세션 당 4.7)에서 1855 (최고, 세션 당 평균 38.6)의 최고치까지 다양하다는 것을 보여주었습니다. 이러한 충격의 대부분은 뇌진탕의 임상 진단을 초래하지는 않았다. 뇌 기능의 기능적 변화에 대한 증거는 fMRI 6을 사용하여 관찰 할 수있다. 이러한 기능적 변화를 일으키는 뇌의 변화는 알려지지 않았기 때문에, 진탕 및 협착 성 mTBI의 효과에 대한 연구를 용이하게하기 위해서는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 모델을 필요로합니다.
생쥐와 쥐에서 mTBI를 모델링하려는 이전의 시도에도 불구하고 많은 사람들이 부작용을보고합니다. 특히, 대부분의 설치류 모델은 더 적은 th를 사용하여 반복성이 제한적입니다5 개의 mTBI는 뇌내 출혈, 두개골 골절, 심한 축삭 손상, 신경 세포 사멸, 사망률 증가 등의 이상 병리학 적 증상을 나타냅니다 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . 여기서 우리는 인간에서 뇌진탕의 진정한 정의에 더 가까운 mTBI의 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 명백한 뇌의 병리가없는 의식의 일시적인 손실을 초래하는 기계적 힘과 같은 인간 mTBI에서 관찰되는 많은 증상을 반복합니다. 더욱이 이전에보고 된 것처럼 오랜 기간 동안 단일 충격 및 반복 충격 패러다임 모두에 활용할 수 있다는 점에서 유리하다.
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Protocol
이 연구는 국립 연구소 건강의 실험실 동물의 관리와 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격하게 준수하여 수행되었습니다. 이 의정서는 조지 타운 대학교 (Georgetown University)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 생쥐를 온도 조절 동물 시설에 넣고 12 시간의 빛 / 12 시간의 암주기에 두었다. 음식과 물은 자유롭게 사용할 수있었습니다.
1. mTBI 장치의 준비
참고 : mTBI 장치에는 충돌 매개 변수를 제어하는 데이터 수집 (DAQ) 상자, 충격을 수행하는 고속 공기압 임팩터 및 충돌 후 헤드를 감속시키기위한 성형 젤 충진베이스가 있습니다.
- 압축 공기를 켜고 고속 공기압 임팩 터를 861.85 kPa의 압력 설정으로 초기화하십시오.
- DAQ 컨트롤 시스템을 피스톤 속도 2.35 m / s, 표면 드웰 시간e는 31.5ms이다.
- 정중선이 임팩터 팁의 궤적과 수직이되도록 성형 된 겔 충전베이스 (압축률 64 kPa / mm)를 놓습니다.
2. mTBI 충격
- 사용할 모든 마우스의 무게를 기록하십시오.
- 유도 챔버에서 120 초 동안 3 % isoflurane 산소로 마우스를 마취.
- 마우스를 mTBI 장치로 옮기고 유연하고 고정되지 않은 코 콘을 통해 마취를 계속합니다.
- 노우즈 콘에서 마우스 헤드를 젤 패드 위에 올려 놓으면 두개골의 평평한 표면이 임팩터 팁에 수직으로 표시됩니다.
- 마우스 헤드 위로 테이프를 올려 평평한 표면을 만들고 귀를 충격 부위에서 멀리 떨어 뜨립니다.
- 폴리 테트라 플루오르 에틸렌 임팩터 팁을 머리 중심의 시상 정중선과 정렬하도록 낮추십시오. 사용 된 임팩터 팁은 직경 10mm이며 눈 바로 뒤부터 귀의 정중선까지 두피 영역을 덮을 것입니다. 임팩터를 조정하여 주무세요.st는 마우스 머리의 표면을 만지고.
- 임팩터 팁을 후퇴시키고 필요한 굴곡 깊이 (7.5 mm)를 수동으로 내려줍니다.
- DAQ 컨트롤 시스템을 가동하고 트리거 버튼을 눌러 마우스 헤드에 영향을줍니다 (단수 또는 반복적 인 영향). 반복되는 영향은 각 충격 사이에 지체없이 연속적으로 전달됩니다.
- 최종 충격 직후 마취와 mTBI 장치에서 마우스를 제거하고 앙와위 자세로 놓습니다.
- 스톱워치를 사용하면 우회전 (잠복기부터 취침까지)의 복귀 대기 시간을 측정하고 의식 시간의 손실뿐 아니라 보행 시간 (방해받지 않는 걷기)을 결정할 수 있습니다.
- 마우스를 모니터하고 정상적인 동작으로 회복되면 홈 케이지로 돌아갑니다.
- 가짜 쥐는 동일한 취급 및 마취를 받지만 아무런 영향을받지 않습니다.
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Representative Results
이 새로운 mTBI 장치를 사용하면 두개골 골절이나 구조적 뇌 손상의 위험없이 단발적이고 반복적 인 경미한 머리 부상이 가능합니다. 이 모델은 맞춤형 공압식 Teflon 임팩터 장치를 사용하여 닫힌 머리의 기계적 에너지 충격을 전달합니다. 충격은 단일 속도 또는 반복적 인 진탕 mTBI ( 그림 1 )의 효과에 기여하는 메커니즘을 조사 할 수있는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 모델을 만드는 정확한 속도 및 변형 매개 변수로 이루어집니다.
LOC의 존재 또는 부재는 동물 모델에서 뇌진탕의 중증도를 평가하는 데 유용한 도구입니다. 우측 반사 시간의 복귀는 우리가 단일 및 반복 mTBI (7.5 mm 깊이, 그림 2 ) 후에 LOC를 정량화하는 데 사용한 상해의 심각성에 대한 급성 신경 학적 평가입니다. 절차 동안 마우스는 총 3 분 동안 isoflurane을받습니다. 산소가 없으므로, 가짜를 포함한 모든 생쥐는 마취 철수 후 LOC 기간을 갖는다. 단일 mTBI는 가짜 쥐 (36.4 ± 1.6 sv 64.2 ± 7.7 s, n = 5, ** p <0.01, 그림 2A )와 비교하여 유의하게 증가 된 LOC를 초래한다. 이것은 또한 단일 mTBI (52.0 ± 4.5 sv 140.0 ± 21.1 s, n = 5, ** p <0.01, 그림 2B )에 따른 보행 시간 증가와 관련이있다. 반복 상해 패러다임 (총 30 회 충격, 6 일 동안 하루 5 회 충격)에서 모든 시험 일에 LOC와 보행 시간이 유의하게 증가했다 (반복 상해 대책의 양방향 분석, F 1,14 = 22.92, p <0.0003). 전체 연구 동안 6 일 동안의 평균 LOC는 35.5 ± 1.4 sv mTBI : 64.9 ± 1.7 s, n = 8, p <0.01, 그림 2C 및 평균 보행 시간 Sham : 64.3 ± 3.3 sv mTBI : 160.8 ± 5.3 초, n = 8, p <0.01,lass = "xfig"> 그림 2D. microglia / macrophages에 대한 Iba1 염색법은 가짜와 단일 mTBI 생쥐 사이에 변화가 없었지만, 반복 mTBI 생쥐 ( 그림 3 )의 광학 분야에서 광범위한 Iba1 면역 반응성을 나타내었다. 반복 mTBI 마우스는 피질 ( 그림 3 ) 또는 다른 뇌 영역에서 회색 물질 염증의 증거를 보여주지 못했습니다.
그림 1 : mTBI 마우스 모델의 대표적인 표현. ( A ) mTBI 수행에 필요한 모든 자료의 설정. ( B ) 마우스를 2 분 동안 이소 플루 란 유도 챔버에 두었다. ( C ) mTBI 장치에서 마우스를 고정되지 않은 코 콘에 놓고 마취를 계속하십시오. ( D ) 부드럽게 테이프 헤드 표면을 만들고 귀를 뒤로 잡으십시오. 충격팁이 헤드의 표면을 만지기 위해 내려갔습니다. ( E ) 임팩터 팁을 집어 넣고 필요한 굴곡 깊이를 다이얼 (삽입)을 사용하여 낮 춥니 다. mTBI는 트리거 버튼을 눌러 수행됩니다. ( F ) 의식 상실. 정위 반사가 되돌아 오는 데 걸리는 시간 (기면에서 경향으로). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 단일 및 반복 mTBI는 의식의 일시적인 상실을 늘리고 ambulation 시간으로 돌아갑니다. 단일 mTBI를 투여받은 마우스는 가짜 대조군 마우스와 비교하여 ( A ) 의식 상실 (LOC) 및 보행 시간 ( B )을 유의하게 증가시켰다 (그룹당 5 명, ** p <0.01). 반복적 인 mTBI (6 일 동안 하루 5 회 충격)는 가짜 쥐와 비교하여 일일 LOC와 보행 시간을 유의하게 증가시킨다 (n = 8, * p <0.05, ** p <0.01, *** p < 0.001). Bonferroni 사후 검사로 양방향 반복 측정 ANOVA로 분석 한 평균 ± SEM으로 표시 한 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 반복적 인 mTBI는 시신경에서 미 글로리아 / 대 식세포 활성화를 유도합니다. ( A ) 가짜 쥐에서 Iba1 얼룩은 피질 (a1 - a3)에서 정지 microglia / macrophages과 시신경 (a4 - a6)에서 제한된 얼룩을 나타냅니다. ( B ) 단일 mTBI를받는 마우스(7.5mm)는 충돌 후 24 시간 동안 피질 (b1-b3) 및 시신경 (b4-b6)에서 가짜 마우스와 유사한 Iba1 염색 프로파일을 갖는다. ( C ) 반복 mTBI 생쥐 (하루 6 회 연속 5 일간)는 시각계 (c4-c6)에서 강한 염증 반응을 나타내지 만 마지막 충돌 후 24 시간 (7 일)에는 피질 (c1-c3) ). 모조, 단일 및 반복 mTBI 생쥐의 피질 (a3, b3, c3) 및 시신경 (a6, b6, c6)의 Iba-1 양성 소교 아세포 / 대 식세포의 형태를 각각 나타내는 확대 이미지. 스케일 바 = 200 μm (A, B, C); 50 ㎛ (a1-a5, b1-b5, c1-c5); 20 μm (a3, a6, b3, b6, c3, c6, 확대 된 패널). 그룹당 n = 6 인 이미지. Cortex (cx), 시신경 (opt), 경미한 외상성 뇌 손상 (mTBI). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
사람의 경우, mTBI는 구조적 상해가없는 경우 기능 장애를 특징으로합니다. 이것은 의식 상실을 동반하거나 동반하지 않고 발생할 수 있습니다 1 . 반복 뇌진탕에 대한 노출은 현재 CTE 4 와 같은 신경 퇴행성 질환의 발달 및 / 또는 진행의 기초가되는 것으로 생각됩니다. CTE가 사각 팬 및 축구 선수에서 흔히 발견되며 CTE를 개발하는 데 반복적 인 뇌진탕 (의식 상실을 초래하지 않는 뇌진탕 포함)이 필수 요소로 알려져 있지만 잘 모르겠다. 반복 뇌진탕이 뇌에서 발생하는 뚜렷한 변화를 일으키는 메커니즘.
이러한 메커니즘을 이해하는 데있어 주요 장애물은 mTBI 영향을 유지하는 개인에서 관찰되는 주요 증상을 정확하게 반복하는 모델 개발의 어려움입니다. 이는 급성 및 만성 생물학적 팻이 있음을 의미합니다.뇌진탕의 근본 원인은 조사하기가 어렵고 새로운 치료법을 개발할 수 없습니다. 특히 반복 뇌진탕의 기존 동물 모델은 광범위한 신경 세포 손실, 두개골 골절 및 뇌 조직의 손상을 일으키는 2-3 회 반복 충격을 사용하여 매우 심합니다. 8 , 10 , 11 , 12 . 인간의 반복적 인 뇌진탕 후에도 이러한 정도의 상해는 발생하지 않으며, 단 하나의 반복적 인 경미한 두부 충돌에 대한 새로운 모델의 필요성을 입증합니다.
여기에서는 mTBI의 새로운 모델을 설명합니다.이 모델은 두개골과 뇌를 통해 그리고 마우스에서 멀리 이동하여 에너지를 전달하도록 특별히 고안된 맞춤형 확산 상해 장치를 사용합니다. 단일 충격 및 반복 충격 패러다임을 통해 모델은 뇌진탕이 신경 장애에 어떻게 기여하는지 나중에 조사 할 수있는 수단을 제공합니다. 단 하나 h이 패러다임은 인간에서 관찰되는 경미한 외상성 뇌 손상의 특성을 반복적으로 보여 주지만, 반복적 인 패러다임은 이러한 가벼운 부상이 시간 경과에 따라 어떻게 만성적이고 지속적인 변성을 일으키는 지 조사 할 수 있습니다. 이 장치는 두개골 골절이나 구조적 뇌 손상의 위험없이 반복적 인 mTBI 머리 충격을 허용합니다.
많은 기술의 경우와 마찬가지로이 프로토콜의 특정 측면은 정확하고 신뢰할 수있는 결과를 생성하는 데 중요합니다. 챔버 유도 및 mTBI 손상 동안 각 마우스에 일정 수준의 마취를 유지하는 것이 중요합니다. 보행 및 보행 시간이이 mTBI 절차의 핵심 결과 측정이므로 연구원은 mTBI 손상 및 가짜 동물이 유사한 수준의 마취에 노출되도록해야합니다. 특히, 전체 절차의 기간 동안, 마우스는 3 분 총 마취하에 있어야합니다 (에서 2 분분출 챔버, mTBI 노우즈 콘 장치로 1 분). 이 낮은 수준과 마취 기간은 다른 많은 mTBI 모델보다 큰 이점이며, 일관된 정맥 반사 반응 시간 (sham 마우스 20-40 초, mTBI 마우스 50-100 초)을 산출합니다. 또한, 반복 mTBI 패러다임을 사용할 때, 연구 기간 동안 매일 마우스 무게의 기록을 유지하는 것이 중요합니다. 이것은 mTBI 절차의 전체 시간 과정에 걸쳐 스트레스 및 일반적인 동물 복지에 대한 일관된 모니터링을 보장하기위한 것입니다. 이 절차로 인해 마우스가 뽑히거나 격리되지 않습니다. 정상적인 손질, 식사 및 음주는 첫 번째 1 시간 이내에 시행해야합니다.
부상 후 1 주간의 시간 경과에 따른 단일 또는 복합 충격으로 인해 뇌 조직에 심한 형태 학적 병리 현상이 나타나지 않습니다 . 단일 mTBI 후 관찰 된 유일한 세포 반응은 흥분성 시냅스의 일시적인 감소이다. 일염증, 회색 또는 백색 물질의 상실, 축삭 손상 또는 세포사는 없습니다. 30 반복 mTBI (하루에 5 일, 6 일 이상)에는 이전에 정량 된 것과 비슷한 수준의 시신경의 만성 염증이 있습니다 1 . 만성 백질 염증은 단일 mTBI 14 이후 여러 해 동안 관찰되었으며, 만성 염증은 반복 mTBI 15 병력이있는 살아있는 운동 선수에서 발견 될 수 있습니다. 이 모델의 한계는 우리 모형에서 빠지기 때문에 시신경 외의 축삭 손상이나 세포 사멸의 기전을 연구하는데 사용될 수 없다는 것입니다. 또한 이전에 발표 된 데이터를 기반으로이 모델은 알츠하이머 병 마우스 모델에서 mTBI 1 개월 후 아밀로이드 또는 타우 병리학 적 변화를 유도하지 않습니다. 우리는이 아밀로이드 및 타우 병리학의 부족이 우리 모델에서 축색 병리학의 부재와 관련이 있다고 믿는다. 우리 모델은 조사 할 플랫폼을 제공합니다.뉴런 네트워크의 불연속적인 변화, 시냅스 무결성과 구성, 반복적 인 뇌진탕 후 행동의 변화를 먹었습니다. 이러한 결과를 바탕으로이 새로운 모델은 통제되고 엄격하며 효율적인 방식으로 임상 적으로 관련된 증상을 나타냅니다. 이 모델의 추가 사용은 mTBI와 뇌진탕의 급성 및 만성 병태 생리학의 기초가되는 메커니즘에 대한 조사를 허용 할 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 신경 장애 및 뇌졸중 (MPB)을위한 국립 연구소의 R01 NS067417에 의해 뒷받침되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powerlab 8SP data acquisition (DAQ) control box | (AD instruments) | ||
| VIP 3000 calibrated vaporizer | Matrx | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Oxygen | Commercially available | ||
| Compressed Air | Commercially available | ||
| Masking Tape | Commercially available | ||
| Stop Watch | Fisher Scientific | 02-261-840 | |
| C57 Bl/6 Mice | Jackson Laboratories | ||
| Digital Scale and weigh container | Fisher Scientific | 20031 | |
| anti-Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| HRP labelled secondary | Jackson Immunoresearch | 111-035-003 |
References
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