Summary
Denne protokol beskriver en metode til isolering og dyrkning af metanephriske rudimenter fra museembryoner.
Abstract
Formålet med denne protokol er at beskrive en metode til dissektion, isolering og kultur af metanfriske rudimenter fra mus.
Under udvikling af pattedyrs nyre kommunikerer de to progenitorvæv, ureterbindet og det metanephriske mesenchym, og frembringer gensidigt cellulære mekanismer til sidst at danne samlingssystemet og nephronerne i nyrerne. Da pattedyrsfostre vokser intrauterin og derfor er utilgængelige for observatøren, er der udviklet en orgelkultur. Med denne metode er det muligt at studere epithelial-mesenchymale interaktioner og cellulær adfærd under nyreorganogenese. Desuden kan oprindelsen af medfødte nyrer og urogenitale malformationer undersøges. Efter omhyggelig dissektion overføres de metanephriske rudimenter til et filter, der flyder på dyrkningsmedium og kan opbevares i en cellekultur-inkubator i flere dage. Men man må være opmærksom på, at betingelserne erKunstig og kunne påvirke stofskiftet i vævet. Også penetrering af teststoffer kunne begrænses på grund af den ekstracellulære matrix og basalmembran til stede i eksplantatet.
En væsentlig fordel ved organkultur er, at eksperimentøren kan få direkte adgang til orgelet. Denne teknologi er billig, enkel og giver mulighed for et stort antal ændringer, såsom tilsætning af biologisk aktive stoffer, undersøgelse af genetiske varianter og anvendelse af avancerede billeddannelsesteknikker.
Protocol
Mus blev opretholdt i henhold til svenske regler og EU-lovgivning (2010/63 / EU). Alle procedurer blev udført efter retningslinjerne i det svenske etiske udvalg (tilladelser C79 / 9, C248 / 11 og C135 / 14). Procedurer ved Heidelberg Universitet, der involverer dyrefag, er blevet godkendt af Regierungspräsidium Karlsruhe og dyrevelfærdsansvarlig ved Heidelberg Universitet.
1. Fremstilling af reagenser og materialer til kultur
BEMÆRK: Brug en laminær flowhætte til at minimere forurening.
- På disseksionsdagen fusioneredes pre-cluster human Fc alene eller rekombinant kimært ephrinprotein til humant Fc ved at blande det med anti-humane Fc-gedeantistoffer i et molforhold på 1: 5 i sterilt phosphatpufret saltopløsning (PBS). Inkuber i 1 time ved 37 ° C 5 .
- Forbered kulturmediet ved at supplere Dulbecco's Modified Eagle Medium: NæringsstofBlanding F-12 (DMEM / F12) med 1% penicillin / streptomycin (vol / vol), 1% glutamin (vol / vol), 1% insulintransferrin selenium (volumen / volumen), 50 μg / ml human holo- Transferrin og 1,5 μg / ml amphotericin.
BEMÆRK: 10 ml medium er tilstrækkeligt til 16 embryoner. - Tilsæt klynget rekombinant ephrinopløsning ved en slutkoncentration på 20 μg / ml til dyrkningsmediet. Brug clustered human Fc som kontrol.
- Forbered kulturplader ved at tilsætte 500 μl dyrkningsmedium til hver brønd af en steril, ikke-belagt, pladbundet polystyren 4-brønds plade.
- Ved hjælp af sterile pincetter placeres omhyggeligt et polycarbonatmembranfilter med en porestørrelse på 5 μm pr. Brønd oven på mediet. Overfør den tilberedte plade til inkubatoren (37 ° C / 5% CO2). Sørg for, at filteret forbliver tørt på den øvre overflade og flyder.
BEMÆRK: Et filter er tilstrækkeligt til to nyreanlæg. - Ved hjælp af et barberblad skæres ca. 30 pipettespidser (volumen: 100 μL) tilnærmelsesvisY 1 mm fra spidsen for at resultere i en bredere åbning. Placer spidserne tilbage i en pipette-tip rack.
2. Dissektion af Metanephric Rudiments ved E11.5
- Opdrage en timet-gravid mus ved E11.5 ved cervikal dislokation (eller ved anvendelse af en metode godkendt af det lokale etiske udvalg).
- Fjern livmoderen og embryoerne, som beskrevet af Brown et al. 6 . Fra dette punkt fremover, arbejde under et dissektionsmikroskop.
- Brug nr. 5 urmagerpinde, skære embryonet direkte under forbenene. Brug en frisk petriskål for hvert embryo. Fjern benene og embryoens hale. For at gøre dette, tag det væv, der skal fjernes, med et par nr. 5 urmagerpinde og brug tipsene fra et andet par til at skære.
- For at fjerne den ventrale organmasse skal du bruge spidserne af et par tang for at åbne fosterets kropsvæg i sidelinjen i en rostral-til-caudal retning.
- Skær overfladisk parallelt med tHan dorsal aorta. Brug den blodfyldte og dermed synlige dorsale aorta til orientering. Adskilt forsigtigt den ventrale del af kropsvæggen fra den dorsale del ved hjælp af spidserne af lukkede tænger og flip embryoen over. Klipp kropsvæggen lateralt i en rostral-til-caudal retning og brug dorsal aorta til orientering, som for den forrige side.
- Når den ventrale kropsvæg er adskilt fra dorsallegemet, tag den med et par tang og trækk forsigtigt for at fjerne det sammen med organmassen.
BEMÆRK: De metanephriske anlagen forbliver normalt fastgjort til den dorsale kropsvæg. De er ovale, ~ 200 μm lange strukturer placeret på niveauet af bagbenene. - Hold den dorsale kropsvæg med et par tang, med den ventrale side opad. Brug det andet par tænger, tag den dorsale aorta ved sin røde ende og skyll forsigtigt den dorsale aorta fra den dorsale kropsvæg.
BEMÆRK: Både metanephriske nyrer forbliver normalt vedhæftetEd til dorsal aorta. - Ved hjælp af et par tænger skæres rostrally til nyrene anlagen for at fjerne aorta. Derefter adskilles de to nyre anlag forsigtigt ved hjælp af tangens tang.
- Skal forsigtigt uønsket væv fra nyrene anlagge ved hjælp af tangens tang. Pas på ikke at beskadige mesenchymet, da skader kan resultere i dårlig vækst og udelukkelse af eksplantaten fra yderligere analyse.
- Overfør nyrerne anlagen separat ved hjælp af en mikroliter pipette og en bred åben pipette spids i 10 μl PBS til polycarbonat membranfilter i en 4-brønds plade.
BEMÆRK: På grund af overfladespændingen bliver eksplanteret dækket af et tyndt lag medium. Et filter er tilstrækkeligt til to nyreanlæg.- Placer hver af de to nyreanlæg i midten af hver respektive halvdel af filteret. Overfør pladen tilbage til inkubatoren ved 37 ° C / 5% CO2. Lad pladen i inkubatoren indtil den metanephriske rudIments fra det næste embryo er klar til at blive anbragt på filteret.
- Gentag trin 2.3-2.9.1 for hvert embryo.
BEMÆRK: Med en eller anden øvelse vil dissektionsproceduren tage ca. 5 minutter pr. Embryo. - Inkuber nyreanlæg i 3 dage ved 37 ° C / 5% CO2.
3. Fremstilling af reagenser til fastgørelse og farvning
- For at fremstille 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS uden calcium og magnesium (vægt / volumen), opløs PFA ved 60 ° C i PBS under kontinuerlig omrøring. Afkøles til stuetemperatur og brug et papirfilter til at fjerne de resterende partikler. Aliquot og opbevar ved 4 ° C til øjeblikkelig brug eller frys til længerevarende opbevaring.
FORSIGTIG: PFA er giftig. Brug det personlige værnemidler, der er angivet i de lokale sikkerhedsstandarder, og arbejd i en dampplade. Kassér affald som følge af institutionelle retningslinjer og brug af udpegede affaldsbeholdere. - For at forberede permeabiliseringsopløsning, fortynd Triton X-100I PBS uden calcium og magnesium til 0,3% (vol / vol).
- For at forberede blokerende opløsning tilsættes 5% (v / v) gedsserum og 0,1% Triton X-100 til PBS uden calcium og magnesium. Tilsæt natriumazid til en slutkoncentration på 0,02% (vægt / volumen). Opbevares ved 4 ° C.
FORSIGTIG: Natriumazid er giftigt. Håndter natriumazid i overensstemmelse med de lokale sikkerheds- og miljøbestemmelser.
BEMÆRK: Brug antistoffer til farvning ved anvendelse af 5% serum fra arten, som det sekundære antistof blev afledt af for at lave blokerende opløsning. - Fortynd biotinyleret Dolichorus biflorus agglutinin 1: 200 i blokerende opløsning. Fortynd Alexa488-konjugeret streptavidin 1: 200 i blokeringsopløsning.
- Til fremstilling af færdigbygget medium (se materialebordet), tilsættes 0,1 g vandopløseligt polyvinylalkoholbaseret mucoadhesive / mL til 25% (w / v) glycerol i 0,1 M Tris-HCI (pH 8,5) . Opvarm til 50 ° C under kontinuerlig omrøring i 1 time, afkølet og juster pH til 8,0-8,5 ved anvendelse af 1M NaOH. Undgå højere NaOH-koncentrationer. Tilsæt 100 μg / ml N-propylgallat og thimerosal til en slutkoncentration på 0,02% (vægt / volumen). Omrør i 30 minutter ved stuetemperatur.
FORSIGTIG: Thimerosal er toksisk. Håndter det i overensstemmelse med de lokale sikkerheds- og miljøbestemmelser.- Fyld indlejringsmediet i 50 ml rør, balancer rotoren og centrifuger ved 3.200 xg og stuetemperatur i 10 minutter. Dekanter den klare opløsning i 15 ml rør og kassér pelleten. Aliquot og opbevar ved -20 ° C i flere uger. Efter optøning opbevares opløsningen ved 4 ° C. Varm til ~ 30 ° C umiddelbart inden brug.
- Forbered så mange glasskinner som filtre med eksplantater skal monteres. Til dette skal du lim to små dæksler 18 x 18 mm på hver side af glasskinnen ved hjælp af øjeblikkelig klæbemiddel. Læg en ~ 15 mm plads til filteret imellem.
4. Fastgørelse og farvning
- Efter en dyrkningstid på 3Dage in vitro (div), fjern pladerne fra inkubatoren og aspirér forsigtigt dyrkningsmediet fra hver brønd ved anvendelse af en mikropipette. Sørg for ikke at røre ved filteret og holde spidsåbningen mod brøndens væg.
- Tilsæt 500 μL 4% PFA / PBS til hver brønd. Filtrene flyder på fixativet. Ved hjælp af en mikropipette skal du forsigtigt tilsætte PFA-fiksativet dråbevist for at nedsænke filtrene. Inkubér ved stuetemperatur i 30 minutter.
BEMÆRK: For alle følgende trin skal der tages hensyn til ikke at vaske eksplanterne fra filteret. Hold åbningen af pipettespidsen mod brøndens væg. - Fjern PFA og skyll to gange med 500 μl PBS, nedsænk filteret. Tilsæt 500 μl permeabiliseringsopløsning til hver brønd og inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
- Skyl to gange med 500 μl PBS og tilsæt 500 μL blokeringsopløsning til hver brønd. Inkubér ved stuetemperatur i 1 time.
- Udskift blokeringsopløsningen med250 μl biotinyleret Dolichorus biflorus agglutinin fortyndet 1: 200 i blokeringsopløsning og inkuberes ved 4 ° C i 24 timer.
- Fjern Dolichorus biflorus-agglutininopløsningen og skyll to gange med 500 μl PBS pr. Brønd.
- Tilsæt 250 μl Alexa488-konjugeret streptavidin fortyndet 1: 200 i blokeringsopløsning og inkuber ved 4 ° C i 24 timer. Alternativt inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer.
BEMÆRK: Et bedre signal-støjforhold opnås ved inkubering ved 4 ° C. - Skyl to gange med 500 μl PBS pr. Brønd. Overfør filtrene til de forberedte glasskinner ved hjælp af tang, og eksplanterne vender opad. Monter med ~ 50-100 μL indlejringsmedium. Cover med 60 mm lange nr. 1,5 coverlips. Lad indlejringsmediumopløsningen størkne i 2 timer ved stuetemperatur i mørke. Fortsæt til billedbehandling eller gem diaserne, indpakket i folie, ved 4 ° C indtil klar til billede.
- Billede med et widefield epifluorescensmikroskop 7 </ Sup> koblet til en Hg-lampe og brug en spejleenhed til blå excitation (excitation bandpass, 460-495 nm, dichromatisk spejl, 505 nm og emissionsbåndspass, 510-550 nm) og 20X Plan-Apochromat-objektiver, 0,75 numeriske blænde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metanephriske nyreanlæg blev afledt af gravide Black-6 inavlede mus ved E11.5 og blev dyrket. Efter 3 dage havde ureterbommen forgrenet op til 5 gange, hvilket resulterede i en forgrening af den oprindeligt T-formede ureteriske knopp. Hver eksplanter blev fotograferet, og antallet af segmenter og endepunkter blev kvantificeret for at bestemme forgreningsgenerationerne og at beregne antallet af endepunkter pr. Gren ( figur 1 ). ImageJ ( rd generation, den 4. generation blev nået i kun 8% af de behandlede eksplantater sammenlignet med 35% af kontroleksplanterne ( Figur 1b ). Derfor blev antallet af endepunkter pr. Gren og endepunkter pr. Mm 2 reduceret i Eksplanterede stoffer behandlet med klynget EphrinB2. Desuden havde en tredjedel af eksplantaterne usædvanlig morfologi i ureterisk budtip ( Figur 1 ). Disse resultater tyder på, at EphrinB2 kan have en begrænsende virkningPå den ureteriske grenforgreningsproces, sandsynligvis ved at aktivere EphA4 og EphB2 fremadgående signalering.
For et vellykket forsøg er det kritisk, at det metanfiske mesenchym ikke beskadiges under dissektion. En hvilken som helst skade af mesenchymet reducerer det induktive potentiale, fører til nedsat eller fraværende ureterisk grenforgrening og kan være en kilde til forspænding. Eksemplet i figur 2A viser et eksplanteringsmiddel, hvor mesenchymet næsten mangler. Den ureteriske knopp brækkede ikke ud over T-trinet. Figur 2B viser et eksempel, hvor skaden af metanephric mesenchyme førte til dårlig vækst og forgrening. Begge eksplantater skal udelukkes fra analyse.
Figur 1: E11.5 Metanephric Kidney Anlagen dyrket for 3 div og behandlet med Clustered Recombinant EphrinB2 eller ClustUdførte Human Fc som en kontrol. ( A ) Metanephric nyreanlæg blev dissekeret ved E11.5, dyrket for 3 div og farvet med biotinyleret Dolichorus biflorus agglutinin og Alexa488-konjugeret streptavidin. Eksplantaterne blev afbildet med et widefield-epifluorescensmikroskop med en excitationsbåndpassage på 460-495 nm, et dichromatisk spejl på 505 nm, en emissionsbåndpassage på 510-550 nm og 20X Plan-Apochromat-linser. Anvendelsen af klynget rekombinant EphrinB2 (clEphrinB2) resulterede i reduceret forgreningskompleksitet og misdannelse af de ureteriske budtips (pilehoved). ( B ) Den venstre graf viser forgreningsgenerationer i clEphrinB2-behandlede og kontroleksplanter. Den 4. generation af forgrening blev nået i kun 8% af de behandlede eksplantater sammenlignet med 35% af kontroleksplanterne. Antallet af endepunkter pr. Filial (midtergraf) og endepunkter pr. Område (højre graf) blev reduceret (slutpunkter pr. Gren CNT, 2,1 ± 0,09; clEphrinB2, 1,7± 0,08, P = 0,007 **; Endepunkter pr. Kvadrat millimeter: CNT, 31 ± 0,01; ClEphrinB2, 27 ± 0,02; P = 0,04 *; N = 23). Dataene præsenteres som middelværdien ± SEM, og en unpaired Students t-test blev anvendt. Målestang = 100 μm. Denne figur er blevet modificeret fra Peuckert et al. , 2016 3 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempler på to E11.5 Metanephric Kidney Anlagen, der blev beskadiget under Dissektionen, dyrket til 3 div og farvet med biotinyleret Dolichorus Biflorus Agglutinin og Alexa488-Konjugeret Streptavidin. ( A og B ) Mesenchymens skade resulterede i dårlig eller fravigende vækst og ureterisk budforgrening,Diskvalificere eksplantaterne fra yderligere analyse. ( A ) Metanephric nyre eksplantat efter 3 div, med fraværende ureterisk bud forgrening. Kun den første T-trins gren er synlig. ( B ) Metanephric Kidney Explant efter 3 div, med dårlig ureterisk bud forgrening. Skalestang = 60 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskript beskriver en metode til at isolere de udviklende metanephriske anlagen fra museembryoen og til at dyrke organets rudimenter. Denne metode er en standardteknik, som udviklet af Grobstein 8 og Saxén 9 , 10 , og blev tilpasset og modificeret af mange andre 11 , 12 . Fremgangsmetoden afhænger hovedsageligt af dissektionens varighed, idet eksplanterende overlevelse og induktivt potentiale falder med langvarig dissek tionstid. Pas på også at beskadige mesenchymet ved rengøring af nyrene fra det omgivende væv. Skader på metanephriske mesenchyme er ofte årsagen til eksplosivernes dårlige vækst. Disseksionshastighed og fine motoriske færdigheder forbedrer dog meget med praksis.
Det kemisk definerede medium i den præsenterede protokol bruges almindeligt til at erstatteSerumholdigt medium i primærcelle og in vitro organkultur og indeholder en 1: 1 (v / v) blanding af DMEM og Ham's F-12 suppleret med insulin-transferrin-selen for at understøtte eksplantaternes vækst og overlevelse. Glucose og aminosyreoptagelse, lipogenese og intracellulær transport lettes af insulin. Selen, en cofaktor til glutathionperoxidase, virker som antioxidant. Transferrin er en jernbærer og hjælper med at beskytte mod iltradikaler. I embryonisk nyrekultur øger tilsætningen af transferrin til mediet tubulerdifferentiering og tymidininkorporering på en dosisafhængig måde med en maksimal effekt omkring 50 μg / mL 13 . Derfor suppleres human-holo-transferrin yderligere i mediet, hvilket resulterer i en endelig transferrinkoncentration på ca. 55 μg / ml. Mange protokoller, der bruger en enklere men kemisk mindre defineret sammensætning, med Eagle's Minimal Essential Medium(MEM) eller DMEM og 10% serum ( dvs. føtalt bovint serum, FBS) giver også meget tilfredsstillende resultater 12 , 13 , 14 , 15 . Der kan dog forekomme variationer mellem forskellige masser af FBS. For at undgå sådanne variationer og udelukke mulig interferens af vækstfaktorer, der er til stede i serumet med Eph-signalering, blev serumfrit medium valgt. Beslutningen om at anvende serumfrit medium afhænger af den eksperimentelle opsætning og det videnskabelige spørgsmål. Serumfrie kulturbetingelser ville være særligt nødvendige, når det endelige mål er terapeutisk anvendelse. Amphotericin B, det anti-svampemiddel, der er inkluderet i denne protokol, kan udelades. Kultiveringsperioden i det viste eksempel var 3 dage, men metanephriske nyrerørringer kan dyrkes i op til 10 dage 15 . I kulturer, der overstiger 3 dage, skal mediet ændres hver 48 time. Udviklingen af kidnØrevirimeringer in vitro recapitulerer in vivo sekvensen af præ-tubulære aggregater, nervevesikler og komma- og S-formede legemer. Efter 3 dage in vitro har glomerulignende strukturer dannet 15 , 16 . I længere kulturer stiger eksplantatområdet yderligere på grund af den fortsatte forgrening af ureterbommen. Ved ca. 5 dages kultur er nefronerne adskilt i distale, midterste og proximale segmenter 16 .
På trods af teknikkens relative lethed og omkostningseffektivitet, der giver mulighed for alsidige applikationer, bør nogle overvejelser tages i betragtning ved planlægning af forsøg og tolkning af resultater. På grund af den ekstracellulære matrix og basalmembran, som er til stede i de dyrkede organer, er diffusionen af eksogene stoffer og partikler begrænset 17 . Desuden kan de kunstige kulturbetingelser og manipulationer forårsage ændringer i metabolittenIsm af vævet og celleadfærd, der adskiller sig fra in vivo- situationen 15 , 18 . Mest synligt mangler eksplantaterne blodtilførsel, og glomeruli er avaskulære; Selvom nefronerne bliver segmenterede, zonering og dannelsen af en medulla og loops af Henle mangler 14 , 19 . Anvendelsesspektret for embryonisk nyrekultur er således begrænset til de rørformede strukturer, deres forgreningsmorfologi og mesenchymale-epitheliale interaktioner. Derfor kan ikke videnskabelige spørgsmål rettet mod nyrefunktionen behandles.
Nylige modifikationer af kultiveringsmetoden, hvor nyreregmenter dyrkes på belagt glas i en lav volumenaktiveret organotypisk udvikling, selv op til cortico-medulær zonering med forlængede løkker af Henle 15 . Det er også værd at bemærke, at for nylig en metode til at gemme og bevare levevisEmbryonale nyrer blev offentliggjort. Denne metode gør det muligt at transportere embryonale nyreregmenter ved E11.5 i flere dage og giver dem mulighed for at dyrkes senere. Dette er især af interesse for samarbejder 20 . Naturen af hel kidney rudiment kultur giver mulighed for en række metodologiske tilpasninger, herunder avancerede billedbehandling teknikker. For at undgå forstyrrende bevægelser under levende billeddannelse anbefales det at erstatte det flydende med et fast filter, f.eks. Et transwellindgange. Den præsenterede teknologi er endda blevet udvidet til kulturvæv blokke indeholdende hele urogenitale kanaler. Ved anvendelse af denne udvidede kultur kan ureterindsættelse i blæren undersøges 21 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Leif Oxburgh og Derek Adams for generøst at dele deres viden, Leif Oxburgh for de nyttige bemærkninger til manuskriptet, og Stefan Wölfl og Ulrike Müller for deres tekniske support og Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer og Viola Mayer for hjælp i lab. Dette arbejde blev støttet af Development, The Company of Biologists (til CP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | use for dissection |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Thimerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 conjugated Streptavidin | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF | R&D Systems | 496-EB | |
| Recombinant Human IgG1 Fc, CF | R&D Systems | 110-HG-100 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc Antibody | R&D Systems | G-102-C | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | use for fixation and immunostaining |
| Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm |
agnthos.se | 0208-5-PS | 2 pairs of forceps are needed |
| Iris scissors, straight, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm |
agnthos.se | 08-032-130 | |
| Petri dishes Nunclo Delta treated | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom |
Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Fixed stage research mircoscope | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough Stereo Microscope | Leica | Leica S6 E |
References
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000 (2015).
- Peuckert, C., et al. Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development. Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).
- Pasquale, E. B. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).
- Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
- Brown, A. C., et al. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J Vis Exp. (50), e2555 (2011).
- Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
- Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
- Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
- Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
- Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
- Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
- Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550 (2010).
- Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
- Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
- Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
- Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
- Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
- Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).
