Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att isolera och odla metanephriska rudiment från musembryon.
Abstract
Målet med detta protokoll är att beskriva en metod för dissektion, isolering och kultur av metanephriska rudiment från mus.
Under utveckling av däggdjurs njure kommunicerar de två progenitorvävnaderna, ureterknoppen och metanephriska mesenchymen och ger upphov till cellulära mekanismer för att slutligen bilda uppsamlingssystemet och nephronerna i njuren. Eftersom däggdjursembryon växer intrauterin och därför är otillgängliga för observatören har en organkultur utvecklats. Med denna metod är det möjligt att studera epithelial-mesenkymala interaktioner och cellulärt beteende under njurorganogenes. Vidare kan ursprunget av medfödda missbildningar av medfödda njurar och urogenitala kanaler undersökas. Efter noggrann dissektion överförs de metanephriska rudimenten på ett filter som flyter på odlingsmedium och kan hållas i en cellodlings-inkubator i flera dagar. Men man måste vara medveten om att villkoren ärArtificiell och kan påverka metabolism i vävnaden. Dessutom kan penetreringen av testämnen begränsas på grund av den extracellulära matrisen och det basala membranet som finns närvarande i explantet.
En viktig fördel med organkulturen är att experimenten kan få direkt tillgång till orgeln. Denna teknik är billig, enkel och möjliggör ett stort antal modifieringar, såsom tillsats av biologiskt aktiva substanser, studier av genetiska varianter och tillämpning av avancerade bildtekniker.
Protocol
Mössen behölls enligt svensk lagstiftning och EU-lagstiftning (2010/63 / EU). Alla förfaranden utfördes enligt den svenska etikutskottets riktlinjer (tillstånd C79 / 9, C248 / 11 och C135 / 14). Förfaranden vid Heidelberg University med djurämnen har godkänts av Regierungspräsidium Karlsruhe och djurskyddspersonal vid Heidelbergs universitet.
1. Framställning av reagens och material för kultur
ANMÄRKNING: Använd en laminärflödeshuv för att minimera förorening.
- På dissektionsdagen fusionerades pre-kluster mänskligt Fc-enbart eller rekombinanta chimära ephrinprotein till humant Fc genom att blanda det med anti-humana Fc-getantikroppar i ett molförhållande av 1: 5 i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Inkubera i 1 h vid 37 ° C 5 .
- Förbered odlingsmediet genom att komplettera Dulbecco's Modified Eagle Medium: NutrientBlandning F-12 (DMEM / F12) med 1% penicillin / streptomycin (volym / volym), 1% glutamin (volym / volym), 1% insulin-transferrinselium (volym / volym) Transferrin och 1,5 μg / ml amfotericin.
OBS: 10 ml medium är tillräckligt för 16 embryon. - Tillsätt klusterrad rekombinant ephrinlösning vid en slutlig koncentration av 20 | ig / ml till odlingsmediet. Använd Clustered Human Fc som kontroll.
- Beredda odlingsplattor genom att tillsätta 500 | il odlingsmedium till varje brunn i en steril, obelagd platta polystyren 4-brunnsplatta.
- Använd sterila tångar, placera försiktigt ett polykarbonatmembranfilter med en porstorlek på 5 μm per brunn ovanpå mediet. Överför den beredda plattan till inkubatorn (37 ° C / 5% CO2). Se till att filtret håller sig torrt på den övre ytan och flyter.
OBS: Ett filter är tillräckligt för två njuranlagen. - Använd ett rakblad, skär ca 30 pipettspetsar (volym: 100 μL) approximatelY 1 mm från spetsen för att resultera i en bredare öppning. Placera tipsen i ett pipettspetsstativ.
2. Dissektion av metanephriska Rudiments vid E11.5
- Offra en timed-gravid mus vid E11.5 genom cervikal dislokation (eller med hjälp av en metod som godkänts av den lokala etiska kommittén).
- Ta bort livmodern och embryon, som beskrivs av Brown et al. 6 . Från denna punkt framåt, arbeta under ett dissektionsmikroskop.
- Med nr 5 urmakare tvingar du embryot direkt under förbenen. Använd en ny petriskål för varje embryo. Ta bort benen och embryonets svans. För att göra detta, ta tag i den vävnad som ska avlägsnas med ett par nr. 5 urmakare och använd tipsen för ett andra par för att klippa.
- För att avlägsna ventral organmassa, använd spetsarna av ett par tångar för att lateralt öppna embryonets kroppsvägg i en rostral-till-caudal riktning.
- Klipp ytligt, parallellt med tHan dorsal aorta. Använd den blodfyllda och därmed synliga dorsala aortan för orientering. Skruva försiktigt den ventrala delen av kroppsväggen från dorsaldelen med spetsarna av stängda tångar och vänd embryot över. Klipp kroppsväggen i sidled i en rostral-till-caudal riktning och använd dorsalortan för orientering, som för föregående sida.
- När den ventrala kroppsväggen har separerats från dorsalkroppen, ta den med ett par tångar och dra försiktigt bort för att ta bort det, tillsammans med organmassan.
OBS: De metanephriska anlagen håller vanligtvis fäst vid den dorsala kroppsväggen. De är ovala, ~ 200 μm långa strukturer belägna på nivån av bakbenen. - Håll dorsala kroppsvägg med ett par tångar, med ventralsidan uppåt. Använd det andra paret tångar, ta den dorsala aortan vid dess rostrade ände och skölj försiktigt dorsalt aorta från den dorsala kroppsväggen.
OBS! Både metanephriska njurar brukar vara bifogadeEd till dorsal aorta. - Använd ett par tångar, skär rostrally till njuranlagen för att ta bort aortan. Därefter separera de två njuranlagen noga med hjälp av spetsarna.
- Skölj försiktigt av oönskad vävnad från njuranlagen med hjälp av tipsen på tången. Var försiktig så att du inte skadar mesenkymet eftersom skador kan leda till dålig tillväxt och uteslutning av explant från ytterligare analys.
- Överför njuranlagen separat med en mikroliterpipett och en bred öppen pipettspets i 10 μl PBS till polykarbonatmembranfiltret i en 4-brunnsplatta.
OBS! På grund av ytspänningen kommer explant att täckas med ett tunt lager av medium. Ett filter är tillräckligt för två njuranlagen.- Placera var och en av de två njuranlagen i mitten av respektive halvdel av filtret. Överför plattan tillbaka till inkubatorn vid 37 ° C / 5% CO2. Låt plattan ligga i inkubatorn tills metanephric rudIments från nästa embryo är redo att placeras på filtret.
- Upprepa steg 2.3-2.9.1 för varje embryo.
OBS! Med viss övning kommer dissektionsförfarandet att ta ca 5 min per embryo. - Inkubera njureanlagen i 3 dagar vid 37 ° C / 5% CO2.
3. Framställning av reagens för fixering och färgning
- För att framställa 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS utan kalcium och magnesium (vikt / volym), lösa PFA vid 60 ° C i PBS, kontinuerligt omröring. Kyl till rumstemperatur och använd ett pappersfilter för att avlägsna resterande partiklar. Aliquot och förvara vid 4 ° C för omedelbar användning eller frysning för långvarig förvaring.
VARNING: PFA är giftigt. Använd personlig skyddsutrustning enligt de lokala säkerhetsstandarderna och arbeta i en avluftningsskydd. Kassera avfall enligt institutionella riktlinjer och använda särskilda avfallshanterare. - För att förbereda permeabiliseringslösningen utspädd Triton X-100I PBS utan kalcium och magnesium till 0,3% (volym / volym).
- För att förbereda blockerande lösning, tillsätt 5% (v / v) get serum och 0,1% Triton X-100 till PBS utan kalcium och magnesium. Tillsätt natriumazid till en slutlig koncentration av 0,02% (vikt / volym). Förvara vid 4 ° C.
VARNING: Natriumazid är giftigt. Hantera natriumazid i enlighet med lokala säkerhets- och miljöskyddsbestämmelser.
OBS! När du använder antikroppar för färgning, använd 5% serum från arten den sekundära antikroppen härleddes från att göra blockeringslösning. - Späd biotinylerad Dolichorus biflorus agglutinin 1: 200 i blockerande lösning. Späd Alexa488-konjugerad streptavidin 1: 200 i blockerande lösning.
- För att göra färdigt inbäddningsmedium (se tabell över material), tillsätt 0,1 g vattenlöslig polyvinylalkoholbaserad mucoadhesiv / ml till 25% (w / v) glycerol i 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) . Värm till 50 ° C under kontinuerlig omröring i 1 h, svalna och justera pH till 8,0-8,5 med 1M NaOH. Undvik högre NaOH-koncentrationer. Tillsätt 100 μg / ml N-propylgallat och timerosal till en slutlig koncentration av 0,02% (vikt / volym). Rör om i 30 minuter vid rumstemperatur.
VARNING: Thimerosal är giftigt. Hantera den i enlighet med lokala säkerhets- och miljöskyddsbestämmelser.- Fyll inbäddningsmediet i 50 ml rör, balansera rotorn och centrifugera vid 3 200 xg och rumstemperatur i 10 min. Dekantera den klara lösningen i 15 ml rör och kassera pelleten. Aliquot och lagra vid -20 ° C i flera veckor. Efter upptining behålls lösningen vid 4 ° C. Värm till ~ 30 ° C omedelbart före användning.
- Förbered så många glasskivor som filter med explants ska monteras. För detta, klistra två små täckglas, 18 x 18 mm, på vardera sidan av glasskivan med hjälp av omedelbart lim, Lämna ett ~ 15 mm utrymme för filtret däremellan.
4. Fixering och färgning
- Efter en odlingsperiod av 3Dagar in vitro (div), ta bort plattorna från inkubatorn och försiktigt aspirera odlingsmediet från varje brunn med användning av en mikropipett. Se till att du inte rör filtret och håll spetsöppningen mot brunnens vägg.
- Tillsätt 500 μl 4% PFA / PBS till varje brunn. Filtret kommer att flyta på fixativet. Använd en mikropipett, lägg försiktigt PFA-fixativet droppvis för att nedsänka filtren. Inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.
OBSERVERA: För alla följande steg måste man se till att inte tvätta ut explanterna från filtret. Håll pipettens öppning mot brunnens vägg. - Ta bort PFA och skölj två gånger med 500 μL PBS, nedsänka filtret. Tillsätt 500 μl permeabiliseringslösning till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur i 1 h.
- Skölj två gånger med 500 μl PBS och tillsätt 500 μL blockeringslösning till varje brunn. Inkubera vid rumstemperatur i 1 h.
- Byt ut blockeringslösningen med250 μl biotinylerat Dolichorus biflorus agglutinin utspätt 1: 200 i blockeringslösning och inkubera vid 4 ° C i 24 timmar.
- Ta bort Dolichorus biflorus agglutininlösningen och skölj två gånger med 500 μL PBS per brunn.
- Tillsätt 250 μL Alexa488-konjugerad streptavidin utspädd 1: 200 i blockeringslösning och inkubera vid 4 ° C i 24 timmar. Alternativt inkuberas vid rumstemperatur i 2 timmar.
OBS: Ett bättre signal-brus-förhållande uppnås när inkuberas vid 4 ° C. - Skölj två gånger med 500 μl PBS per brunn. Överför filtren till de beredda glasskivorna med hjälp av tångar, med utplanterna vända uppåt. Montera med ~ 50-100 μL inbäddningsmedium. Omslag med 60 mm långa nr 1.5 täckglas. Låt inbäddningsmedelslösningen stelna i 2 timmar vid rumstemperatur i mörkret. Fortsätt till bildbehandling eller lagra bilderna, inslagna i folie, vid 4 ° C tills du är klar till bild.
- Bild med ett widefield epifluorescensmikroskop 7 </ Sup> kopplad till en Hg-lampa och använda en spegelenhet för blå excitation (exciteringsbandpass, 460-495 nm, dikromatisk spegel, 505 nm och emissionsbandpass, 510-550 nm) och 20X Plan-Apochromat-linser, 0,75 numeriska öppning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metanephriska njuranlagen härleddes från gravida Black-6 innaviga möss vid E11.5 och odlades. Efter 3 dagar hade uretärknoppen förgrenats upp till 5 gånger, vilket resulterade i en förgrening av den initialt T-formade ureteriska knoppen. Varje explant fotograferades, och antalet segment och slutpunkter kvantifierades för att bestämma förgreningsgenerationerna och att beräkna antalet slutpunkter per gren ( Figur 1 ). ImageJ ( rd generation, den 4 : e generationen nåddes i endast 8% av de behandlade explanterna, jämfört med 35% av kontrollexplanteringsmedlen ( Figur 1b ). Följaktligen reducerades antalet slutpunkter per gren och slutpunkter per mm 2 i Explanter som behandlats med klustret EphrinB2. Dessutom hade en tredjedel av explanterna ovanlig morfologi i ureteriska knopptipset ( Figur 1 ). Dessa resultat tyder på att EphrinB2 kan ha en begränsande effektPå ureterisk grenförgreningsprocessen, sannolikt genom att aktivera EphA4 och EphB2 framåtriktad signalering.
För ett framgångsrikt experiment är det kritiskt att metanephric mesenchym inte skadas vid dissektion. Eventuell skada av mesenkymet minskar den induktiva potentialen, leder till minskad eller frånvarande ureterisk knoppförgrening och kan vara en källa till förspänning. Exemplet i Figur 2A visar en explant där mesenkymet nästan saknas. Den ureteriska knoppen grenade inte bortom T-steget. Figur 2B visar ett exempel där skadan av metanephric mesenchym ledde till dålig tillväxt och förgrening. Båda explanterna måste uteslutas från analys.
Figur 1: E11.5 Metanephric Kidney Anlagen odlades för 3 div och behandlades med Clustered Rekombinant EphrinB2 eller ClustUtgjorde Human Fc som kontroll. ( A ) Metanephric njureanled dissekerades vid E11.5, odlades för 3 div och färgades med biotinylerat Dolichorus biflorus agglutinin och Alexa488-konjugerat streptavidin. Explantanterna avbildades med ett widefield-epifluorescensmikroskop med en excitationsbandpass av 460-495 nm, en dikromatisk spegel av 505 nm, en emissionsbandpass på 510-550 nm och 20X Plan-Apochromat-linser. Tillämpningen av klustrad rekombinant EphrinB2 (clEphrinB2) resulterade i minskad förgreningskomplexitet och missbildning av ureteriska knopptips (pilhuvud). ( B ) Det vänstra diagrammet visar förgreningsgenerationer i clEphrinB2-behandlade och kontrollexplanteringar. Den 4 : e generationen förgrening uppnåddes i endast 8% av de behandlade explanterna, jämfört med 35% av kontrollexplantanterna. Antalet slutpunkter per gren (mittgraf) och slutpunkter per område (höger graf) reducerades (slutpunkter per gren CNT, 2,1 ± 0,09; clEphrinB2, 1,7± 0,08, P = 0,007 **; Slutpunkter per kvadrat millimeter: CNT, 31 ± 0,01; ClEphrinB2, 27 ± 0,02; P = 0,04 *; N = 23). Uppgifterna presenteras som medelvärdet ± SEM och en unpaired Students t-test användes. Skalstång = 100 μm. Denna siffra har modifierats från Peuckert et al. , 2016 3 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel på två E11.5 Metanephric Kidney Anlagen som skadades under uppkomsten, odlades för 3 div och färgades med biotinylerat Dolichorus Biflorus Agglutinin och Alexa488-konjugerat Streptavidin. ( A och B ) Mesenchymets skada resulterade i dålig eller frånvarande tillväxt och ureterisk knoppförgrening,Diskvalificera explantsna från ytterligare analys. ( A ) Metanephric kidney explant efter 3 div, med frånvarande ureterisk knoppförgrening. Endast den första T-steget är synlig. ( B ) Metanephric kidney explant efter 3 div, med dålig ureterisk knoppförgrening. Skala bar = 60 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver en metod för att isolera de utvecklande metanephriska anlagen från musfosteret och att odla organets rudiment. Denna metod är en standardteknik, som utvecklats av Grobstein 8 och Saxén 9 , 10 , och anpassades och modifierades av många andra 11 , 12 . Metodens framgång beror huvudsakligen på dissektionens varaktighet, eftersom explant överlevnad och induktiv potential minskar med långvarig dissektionstid. Försiktighet måste också vidtas för att inte skada mesenkymet vid rengöring av njurröret från den omgivande vävnaden. Skador på det metanephriska mesenchymet är ofta orsaken till att tillväxtmedlen är svaga. Disseksionshastighet och fina motoriska färdigheter förbättras dock kraftigt med övning.
Det kemiskt definierade mediet i det presenterade protokollet används vanligen för att ersättaSerumhaltigt medium i primärcell och in vitro -organkultur och innehåller en blandning av DMEM och Ham's F-12 med 1: 1 (volym / volym), kompletterat med insulin-transferrinselen för att stödja tillväxten och överlevnaden av explanterna. Glukos- och aminosyraupptagning, lipogenes och intracellulär transport underlättas av insulin. Selen, en kofaktor för glutationperoxidas, fungerar som antioxidant. Transferrin är en järnbärare och hjälper till att skydda mot syreradikaler. I embryonal njurekultur ökar tillsatsen av transferrin till mediet tubulärdifferentiering och tymidininkorporering på ett dosberoende sätt med en maximal effekt omkring 50 | ig / ml 13 . Därför kompletteras human-holo-transferrin dessutom i mediet, vilket resulterar i en slutlig transferrinkoncentration av omkring 55 | ig / ml. Många protokoll, som använder en enklare men kemiskt mindre definierad komposition, med Eagle's Minimal Essential Medium(MEM) eller DMEM och 10% serum ( dvs. fetalt bovint serum, FBS) ger också mycket tillfredsställande resultat 12 , 13 , 14 , 15 . Men variationer mellan olika massor av FBS kan uppstå. För att undvika sådana variationer och utesluta eventuell störning av tillväxtfaktorer närvarande i serumet med Eph-signalering valdes serumfritt medium. Beslutet om användning av serumfritt medium beror på experimentell inställning och vetenskaplig fråga. Serumfria odlingsbetingelser skulle vara särskilt nödvändiga när det ultimata målet är terapeutisk applicering. Amphotericin B, det svampmedel som ingår i detta protokoll kan utelämnas. Odlingsperioden i det presenterade exemplet var 3 dagar, men metanephriska njurrederingar kan odlas i upp till 10 dagar 15 . I kulturer som överstiger 3 dagar, bör mediet bytas var 48: e timme. Utvecklingen av kidnÖgonstudier in vitro rekapitulerar in vivo -sekvensen av pre-tubulära aggregat, njurblåsor och komma- och S-formade kroppar. Efter 3 dagar in vitro har glomeruliknande strukturer bildat 15 , 16 . I längre kulturer ökar det explanta området ytterligare på grund av den fortsatta förgreningen av ureterknoppen. Vid ca 5 dagar av kultur har nefronerna segregerat i distala, mellersta och proximala segment 16 .
Trots den relativa lättheten och kostnadseffektiviteten hos tekniken, vilket möjliggör mångsidiga applikationer, bör vissa hänsyn tas i beaktande vid planering av experiment och tolkning av resultat. På grund av den extracellulära matrisen och basalmembranet som finns närvarande i de odlade organen är diffusionen av exogena medel och partiklar begränsad 17 . Vidare kan de artificiella odlingsförhållandena och manipuleringa orsaka förändringar i metabolismenIsm av vävnaden och cellbeteende som skiljer sig från in vivo- situationen 15 , 18 . Mest märkbart saknar explantanterna blodtillförseln och glomeruli är avaskulära; Även om nefronerna blir segmenterade, zonering och bildandet av en medulla och loopar av Henle saknas 14 , 19 . Sålunda är applikationsspektret för embryonisk njurekultur begränsad till de rörformiga strukturerna, deras förgreningsmorfologi och mesenkymala epiteliala interaktioner. Följaktligen kan vetenskapliga frågor som riktar sig mot njurfunktionen inte behandlas.
Nyliga modifieringar av odlingsmetoden där njurstudier odlas på belagd glas i en lågvolymaktiverad organotypisk utveckling till och med upp till cortico-medullär zonering med förlängda öglor av Henle 15 . Det är också värt att notera att, nyligen, en metod att lagra och bevara levandeEmbryonala njurar publicerades. Denna metod möjliggör transport av embryonala njurstudier vid E11.5 under flera dagar och tillåter att de odlas senare. Detta är särskilt intressant för samarbeten 20 . Naturen av hel kidney rudiment kultur möjliggör en mängd olika metodiska anpassningar, inklusive avancerad bildteknik. För att undvika störande rörelser under levande bildbehandling rekommenderas det att byta ut flytande med ett fast filter, t.ex. en transwellinsats. Den presenterade tekniken har till och med utökats till vävnadsblock med vävnad som innehåller hela urogenitala systemet. Med hjälp av denna expanderade kultur kan urinlägginsättning i blåsan undersökas 21 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Leif Oxburgh och Derek Adams för att generöst dela sin kunskap, Leif Oxburgh för de användbara kommentarerna på manuskriptet, och Stefan Wölfl och Ulrike Müller för deras tekniska support och Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer och Viola Mayer för hjälp i labb. Detta arbete stöddes av Development, The Company of Biologists (till CP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | use for dissection |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Thimerosal | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Propyl gallate | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Biotinylated Dolichorus Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 conjugated Streptavidin | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| Recombinant Mouse Ephrin-B2 Fc Chimera Protein, CF | R&D Systems | 496-EB | |
| Recombinant Human IgG1 Fc, CF | R&D Systems | 110-HG-100 | |
| Goat Anti-Human IgG Fc Antibody | R&D Systems | G-102-C | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | use for fixation and immunostaining |
| Dumont #5, biologie tips, INOX, 11 cm |
agnthos.se | 0208-5-PS | 2 pairs of forceps are needed |
| Iris scissors, straight, 12 cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Dressing Forceps, straight, delicate, 13 cm |
agnthos.se | 08-032-130 | |
| Petri dishes Nunclo Delta treated | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopore Membrane Filter, polycarbonate, Hydrophilic, 5.0 µm, 13 mm, white, plain | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 wells, flat bottom |
Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Microscope cover glass 24 x 50 mm thickn. No.1.5H 0.17+/-0.005 mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| Cover glasses No.1.5, 18 mm x 18 mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| Slides ~76 x 26 x 1, 1/2-w. ground plain | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman prepleated qualitative filter paper, Grade 113V, creped | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Fixed stage research mircoscope | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 inbred mice, male, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 inbred mice,female, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough Stereo Microscope | Leica | Leica S6 E |
References
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000 (2015).
- Peuckert, C., et al. Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development. Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).
- Pasquale, E. B. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).
- Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
- Brown, A. C., et al. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J Vis Exp. (50), e2555 (2011).
- Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
- Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
- Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
- Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
- Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
- Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).
- Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
- Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550 (2010).
- Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
- Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
- Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
- Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
- Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
- Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).
