Summary
هنا، نحن تصف إعداد شرائح البطين قابلة للحياة من الفئران الكبار واستخدامها للالتسجيلات المحتملة عمل القطب حادة. هذه الاستعدادات متعددة الخلايا توفر الحفاظ عليها في الجسم الحي مثل هيكل الأنسجة، مما يجعلها نموذجا قيما للدراسات الكهربية والدوائية في المختبر .
Abstract
كارديوميوسيتس الفئران استخدمت على نطاق واسع للدراسات في المختبر من علم وظائف الأعضاء القلب واستراتيجيات علاجية جديدة. ومع ذلك، الاستعدادات متعددة الخلايا من كارديوميوسيتس فصلها ليست ممثلة للمجمع في هيكل الجسم الحي من العضلية، غير ميوسيتس والمصفوفة خارج الخلية، مما يؤثر على كل من الخصائص الميكانيكية والكهربية للقلب. هنا نحن تصف تقنية لإعداد شرائح البطين قابلة للحياة من قلوب الماوس الكبار مع الحفاظ عليها في الجسم الحي مثل هيكل الأنسجة، وإثبات مدى ملاءمتها للتسجيلات الكهربية. بعد استئصال القلب، يتم فصل البطينين من الأذينين، بيرفوسد مع كا 2 + خالية من الحل يحتوي على 2،3-بوتانيديون مونوكسيم وجزءا لا يتجزأ من كتلة الاغاروز ذوبان منخفضة 4٪. يتم وضع كتلة على مشراح مع شفرة تهتز، ويتم إعداد شرائح الأنسجة مع سمك 150-400 ميكرون حفظ الاهتزاز الحرةكنسي من شفرة في 60-70 هرتز وتحريك شفرة إلى الأمام ببطء ممكن. سمك شرائح يعتمد على مزيد من التطبيق. يتم تخزين شرائح في الجليد حل تيرود البارد مع 0.9 ملي كا 2 + و 2،3-بيوتانيديون مونوكسيمي (بدم) لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، يتم نقل شرائح إلى 37 درجة مئوية دمم لمدة 30 دقيقة لغسل بدم. شرائح يمكن استخدامها للدراسات الكهربية مع أقطاب حادة أو صفائف القطب الصغير، لقياسات القوة لتحليل وظيفة مقلص أو للتحقيق في التفاعل من الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الجذعية المستمدة والأنسجة المضيفة. لتسجيلات القطب حاد، يتم وضع شريحة في طبق الثقافة 3 سم ثقافة على لوحة التدفئة من المجهر المقلوب. يتم تحفيز شريحة مع القطب أحادي القطب، ويتم تسجيل إمكانات العمل داخل الخلايا من العضلية داخل شريحة مع القطب الزجاج حاد.
Introduction
وقد استخدمت شرائح الأنسجة رقيقة في كثير من الأحيان في العلوم الأساسية منذ ياماموت و مكلوين أظهرت في عام 1966 أن النشاط الكهربائي لشرائح الدماغ والحفاظ عليه في المختبر 1 . ومنذ ذلك الحين، وقد أجريت الدراسات الكهربية والدوائية على شرائح من الدماغ 2 والكبد 3 والرئة 4 وأنسجة عضلة القلب 5 و 6 و 7 . وقد وصفت التسجيلات الأولى المشبك التصحيح في شرائح البطين من قلوب الفئران حديثي الولادة في عام 1990 8 ، ولكن هذه التقنية سقطت في غياهب النسيان لبعض الوقت. بعد أكثر من عقد واحد في وقت لاحق، أنشأت مجموعتنا طريقة جديدة لإعداد الفئران الجنينية 9 ، حديثي الولادة 10 والكبار 11 شرائح القلب. هذه شرائح الأنسجة قابلة للحياة يمكن استخدامها للتجارب الحادة (شريحة الكبارق يمكن زراعتها لعدة ساعات) أو تجارب الثقافة على المدى القصير (الجنينية وشرائح الوليد يمكن زراعتها لبضعة أيام). تظهر شرائح في الجسم الحي مثل الخصائص الكهربية وانتشار الإثارة متجانسة كما تقييمها من قبل إمكانات عمل القطب حاد والتسجيلات مجموعة القطب الصغير 11 . نظرا لمورفولوجيا "ثنائي الأبعاد"، فإنها تسمح بالوصول المباشر لأقطاب التسجيل إلى جميع مناطق البطين، مما يجعلها أداة مثيرة للاهتمام للتحقيقات الكهربية ويثير خيارات تجريبية جديدة بالمقارنة مع قلوب لانجندورفف بيرفوسد كاملة. استجابة المخدرات من شرائح إلى حاصرات قناة أيون مثل فيراباميل (L- نوع كا 2 + مانع القناة)، ليدوكين (نا + مانع القناة)، 4-أمينوبيريدين (غير انتقائي تعتمد على الجهد K + قناة مانع) و لينوبيردين (كنق K + -channel بلوكر) 9 ، 11 10 . وأظهرت هذه النتائج أن شرائح البطين الفئران هي مناسبة كنموذج في المختبر الأنسجة للدراسات الفسيولوجية والدوائية. وعلاوة على ذلك، شرائح البطين من قلوب المتلقي في تركيبة مع تسجيلات قطب حاد أثبتت أن تكون أداة مفيدة جدا لتوصيف التكامل الكهربائي والميكانيكية، فضلا عن نضوج الجنين المزروع 12 ، 13 ، 14 والخلايا الجذعية 15 المستمدة من الخلايا الجذعية.
باختصار، شرائح البطين هي قيمة ونموذج الأنسجة متعدد الخلايا إنشاء جيدا، وينبغي أن تعتبر مكملة ل كارديوميوسيتس فصل وقلوب لانجندورفف بيرفوسدفي أبحاث القلب والأوعية الدموية، مع ميزة كبيرة لتوفير في الجسم الحي مثل هيكل الأنسجة (على النقيض من الخلايا فصل)، وكذلك الوصول المباشر للتكنولوجيات القياس مثل تسجيلات القطب حاد لجميع مناطق القلب (على النقيض من الاستعدادات القلب كله).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يجب أن يكون التعامل مع الحيوانات مطابقة للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان المحلية والتوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي للبرلمان الأوروبي.
1. إعداد الحلول
- إعداد حل تيرود دون كا 2 + (تكوين في مم): كلوريد الصوديوم 136، بوكل 5.4، ناه 2 بو 4 0.33، مغكل 2 1، الجلوكوز 10، هيبيس 5، 2،3-بيوتانيديون مونوكسيمي (بدم) 30. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية.
- إعداد حل تيرود مع كا 2 + (تكوين في مم): كلوريد 136، بوكل 5.4، ناه 2 بو 4 0.33، مغكل 2 1، الجلوكوز 10، هيبيس 5، بدم 30، كاكل 2 0.9. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم في 4 درجات مئوية.
- إعداد 4٪ منخفضة تذوب أغاروس: ضع 0.6 غرام ذوبان منخفضة الاغاروز في 15 مل حل تيرود دون كا 2 + . تسخين الخليط في فرن الميكروويف مرتين في 750 واط لمدة 10-15 ثانية حتى يتم حل الاغاروز. الحفاظ على الحل في درجة حرارة ثابتة من 37 &# 176؛ C ويقلب باستمرار.
- الحفاظ على تعديل دولبيكو النسر المتوسطة (دمم) دون مصل في 37 درجة مئوية فقاعات مع الكربوجين (5٪ كو 2 ، 95٪ O 2 ).
2. إعداد مشراح
- التبديل على مشراح.
- ملء غرفة مشراح الخارجي مع الجليد.
- ملء الغرفة مشراح الداخلية مع الجليد حل تيرود البارد دون كا 2 + وبشكل مستمر الأوكسجين الحل مع 100٪ O 2 .
- وضع شفرة الصلب في حامل شفرة مشراح.
3. الماوس عزل القلب
- حقن 2500 U هيبارين تحت الجلد. انتظر 15 دقيقة.
- التضحية الحيوان عن طريق خلع عنق الرحم.
- فتح الصدر عن طريق القص.
- تشريح بعناية التامور باستخدام مقص صغير وملقط # 5.
- إدراج قنية في الشريان الأورطي الصاعد وإرواء الشرايين التاجية في الموقع مع الجليد البارد تيرود لالحل دون كا 2 + حتى تتم إزالة الدم المتبقية.
- بلطف قلب القلب مع ملقط ومقص ونقل القلب في الجليد الباردة حل تايرود ركب دون كا 2 + .
- فصل الأذينين من البطينين مع مشرط أو مقص.
4. تضمين البطينين في 4٪ منخفضة تذوب أغاروس
- وضع البطينين مع قمة تواجه صعودا في قالب الاغاروز ( الشكل 1 ). وضع دبوس في منتصف القالب في غرفة البطين الأيسر.
- ملء القالب مع الاغاروز ذوبان منخفضة 4٪ عند 37 درجة مئوية، حتى يتم تغطية القلب تماما.
- وضع القالب على الجليد لسرعة تصلب أغاروس منع العائمة من الأنسجة.
- إزالة كتلة الاغاروز التي تحتوي على البطينين من القالب مع مشرط.
- تحويل كتلة رأسا على عقب وملء غرف البطين والفجوة على المؤخر من كتلة الاغاروز، والتي أناs اليسار من قبل دبوس من مولت، مع 4٪ منخفضة تذوب الاغاروز باستخدام حقنة مع 20 G إبرة.
- تقليم كتلة أغاروس مع مشرط لتحقيق أسفل مسطح للكتلة ووضع مستقيم من قمة القلب.
5. تشريح الأنسجة البطين
- إصلاح كتلة على حامل عينة من مشراح مع قطرة من الغراء سيانوكريلات. تواجه قمة القلب صعودا.
- وضع حامل العينة في غرفة العينة الداخلية من مشراح، والتي هي مليئة تيرود الجليد الباردة دون كا 2 + . تغطية تماما كتلة الاغاروز مع حل تيرود ل.
- إعداد شرائح محور قصير بسمك 150-400 ميكرون، اعتمادا على مزيد من التطبيق (لتسجيلات قطب حاد 150-200 ميكرون)، والحفاظ على تردد الاهتزاز من شفرة في 60-70 هرتز ونقل شفرة إلى الأمام ببطء ممكن .
- استخدام فرشاة غرامة لإزالة بعناية الاغاروز المتبقية من شرائح.
- ترانسف بلطفr شرائح مع ماصة باستور في حل تايرود مع 0.9 ملي كا 2 + تهوية مع 100٪ O 2 وتخزينها لمدة 30 دقيقة على الأقل على الجليد للتعافي من إجراء تشريح.
- بعد ذلك، والحفاظ على شرائح لمدة 30 دقيقة في دمم عند 37 درجة مئوية، تهوية مع كاربوجين، لغسل بدم قبل مزيد من الاستخدام.
6. إعداد إعداد القطب حاد
- قبل التسخين، والتبديل على جميع الأجهزة الكهربائية 30 دقيقة قبل بدء التسجيلات.
- وضع 3 سم طبق ثقافة الخلية على لوحة التدفئة وضعت على المجهر المقلوب.
- وضع حسب الطلب القطب الكهربائي ( الشكل 2 ) في الطبق وتوصيل أسلاك التأريض من قبل مكبر للصوت والقطب التحفيز.
- ربط أنابيب مرنة من نظام نضح إلى الطبق.
- ملء خزان نظام نضح مع دمم، تهوية مع كاربوجين.
- التبديل على مضخة نضح وتعيين نضح راتي إلى 2-3 مل / دقيقة.
- ضبط درجة الحرارة من دمم في الطبق إلى 37 درجة مئوية عن طريق تنظيم سخان التدفق ولوحة التدفئة.
7. عمل التسجيلات المحتملة
- وضع شريحة البطين في طبق دمم شغلها.
- التحقق من سلامة الهيكلية وجدوى (على أساس وظيفة مقلص) من الأنسجة مع المجهر المقلوب.
- ملء القطب الزجاج تسجيل مع 3 M كل.
- ملء القطب التحفيز مع دمم.
- وضع القطب تسجيل والتحفيز الكهربائي على حاملي القطب.
- وضع القطب التحفيز بعناية على شريحة والتبديل على مشجعا الكهربائية. تبدأ مع تردد التحفيز من 1-2 هرتز.
- حرك القطب تسجيل مع ميكرومانيبولاتور على موقف تسجيل المقصود.
- انخفاض ببطء في تسجيل القطب حتى يلمس طرف الأنسجة.
- تطبيق نبض كهربائي مستطيلة قصيرة من خلالتسجيل القطب لاختراق غشاء الخلية.
- إعادة بعناية القطب تسجيل حتى يتم ضمان إشارة مستقرة.
- بدء تسجيل إمكانات العمل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
احتشاء عضلة القلب يؤدي إلى فقدان لا رجعة فيه تقريبا من العضلية. العلاج استبدال الخلايا باستخدام الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الجذعية لتجديد القلب الخارجية هو نهج علاجي واعد. التكامل الكهربائي والنضج من الخلايا المزروعة هي حاسمة لسلامة وكفاءة العلاج استبدال الخلايا.
لتقييم التكامل والنضج، قمنا بزرع الخلايا العضلية المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة (إبسم؛ 2 حقن 0.5 × 10 6 إبسم / 10 ميكرولتر) معربا عن تعزيز البروتين الفلورسنت الأخضر (إغف) في قلوب صحية من الفئران الكبار (انظر بينكوفر وآخرون. للحصول على وصف تفصيلي للطرق 15 ). بعد ستة أيام من الزرع، تم إعداد شرائح البطين من قلوب المتلقين باستخدام بروتوكول وصفها. يظهر تسجيل ممثل فيالشكل 3. وضعت شريحة تحتوي على إبسم مزروع في دمم عند 37 درجة مئوية وتحفيز فوكالي بواسطة القطب أحادي القطب وضعت في الأنسجة المضيف ( الشكل 3A ، يسار). تم تسجيل إمكانات العمل داخل الخلايا مع ميكرولتروديس الزجاج حادة مليئة 3 M بوكل في إغف زرع إيجابية إبسم والأنسجة المضيفة المجاورة داخل شرائح ( الشكل 3A ، والحق).
ويمكن إثبات الثبات والتكامل الكهربائي من إبسم المزروع في قلوب المتلقين. اعتبرت إبسم لتكون متكاملة كهربائيا، إذا كان الترابط الزمني من التحف التحف وإمكانات العمل المسجلة داخل الخلايا في العضلية المزروعة كان حاضرا ( الشكل 3B ). ويمكن قياس نوعية التكامل الكهربائي عن طريق تأخير التنشيط الكهربائي، أي التأخير بين التحفيز وبداية ثe العمل أوبستروك المحتملة، وتكرار التحفيز القصوى دون كتل التوصيل، أي تردد التحفيز القصوى مما يؤدي إلى جيل 1: 1 من إمكانيات العمل بعد كل حافز.
زرع إيبسم في هذه التجربة التمثيلية تم دمجها كهربائيا، كما هو مبين من قبل تردد التحفيز القصوى دون كتل التوصيل من حوالي 5 هرتز ( الشكل 3B ، يمين)، ولكن نوعية اقتران لم تكن جيدة كما هو الحال داخل الأنسجة المضيف كما هو مبين من قبل أطول التأخير بين التحف التحف والعمل أوبستروك المحتملة (الأنسجة المضيف: 8 مس؛ إبسم: 20 مللي ثانية). وكانت إمكانات العمل من كارديوميوسيتس المضيف 84 ميغابايت السعة، -74 مف القدرة الانبساطي القصوى، مدة 11 مللي ثانية في الاستقطاب 50٪، مدة 108 مللي ثانية في استقطاب 90٪ وسرعة أوبستروك من 114 V / ثانية. زيادة تردد التحفيز من 1 إلى 5 هرتز يؤدي إلى انخفاض في العمل دورات المحتملةأيون في استقطاب 90٪ (86 مللي ثانية). زرع إبسم أظهرت اختلافات كبيرة في خصائص المحتملة العمل. بالمقارنة مع الخلايا المضيفة، كان الاتساع أصغر (53 مف)، إمكانات الانبساطي القصوى أقل سلبية (-54 مف)، زادت مدة الاستقطاب 50٪ (14 مللي ثانية)، والمدة عند استقطاب 90٪ أقصر (90 مللي ثانية) وسرعة أوبستروك أبطأ (57 فولت / ثانية). زيادة في تردد التحفيز من 1 إلى 5 هرتز تسبب في انخفاض في مدة العمل المحتملة في 90٪ إعادة الاستقطاب (67 مللي ثانية). في الختام، في هذا المثال ممثل في 6 أيام بعد زرع، وأظهرت إبسم تحليلها الخصائص النمطية لل كارديوميوسيتس غير ناضجة. هذه النتيجة القصصية تتماشى مع القياسات في عدد كاف إحصائيا من الخلايا والاستعدادات، والتي تم الإبلاغ عنها قبل 15 .
شكل 1: حسب الطلب العفن لتضمين البطينين في أغاروس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: حسب الطلب الدائري الكهربائي (الأرض) لشارب قطب التسجيلات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التكامل الكهربائي من إيبسم المزروع . ( A ) البطين شريحة القلب (يسار) التي تحتوي على إغف إيبسم إيجابية (يمين). SE:تحفيز الكهربائي. النقاط الحمراء بمناسبة موقع التسجيلات. ( B ) عمل التسجيلات المحتملة في الأنسجة المضيفة صحية (آثار العليا) وزرع إبسم (آثار أقل). تم تحفيز شريحة فوكالي مع القطب التحفيز وضعها في الأنسجة المضيف في حوالي 2 هرتز (آثار اليسار) و 5 هرتز (آثار الحق). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
شرائح البطين تمكن الكهربية والدراسات الدوائية والميكانيكية مع الحفاظ عليها في الجسم الحي مثل هيكل الأنسجة والوصول المباشر للتكنولوجيا القياس إلى جميع مناطق القلب. وقد أظهرت الخصائص الفسيولوجية العمل المحتملة في الجنينية، حديثي الولادة والشرائح الكبار 9 ، 10 ، 11 . حيوية من شرائح، باستثناء طبقات السطح تضررت مباشرة من قبل إجراء تشريح، وقد أكد من قبل تلطيخ حيوية 9 . عمل التسجيلات المحتملة داخل شرائح باستخدام أقطاب الزجاج الحادة يمكن استخدامها للتحقيق التكامل والنضج من العضلية المزروعة كما هو موضح هنا، أو للدراسات الدوائية بعد إضافة المركبات كارديواكتيف. التسجيلات طويلة الأجل مع مدة ساعة واحدة أو أكثر في خلية فردية ممكنة. مدة التسجيل هذه كافية للاختباروتأثير المركبات الدوائية المختلفة على خلية واحدة عن طريق نضح متتابعة والتجفيف.
خطوات التحضير الحاسمة
لتحسين نوعية شريحة، وينبغي تجنب تلف الأنسجة الدماغية. ولذلك، نضح القلب في الموقع مع حل تيرود، واستئصال القلب السريع والحفاظ الفوري في الجليد الأوكسجين الباردة حل تيرود تعتبر حاسمة. شلل القلب الضرب باستخدام 2،3-بوتانيديون مونوكسيم قد يزيد من الحد من قابلية لنقص التروية ومطلوب لتضمين الصلبة في الاغاروز ذوبان منخفضة. التضمين في الاغاروز ذوبان منخفضة قد يعيق توريد الأنسجة عن طريق الحد من الانتشار، ولكن ضروري لتحقيق الاستقرار في أنسجة القلب لينة قبل تشريح. تجاويف صغيرة داخل كتلة العينة، على سبيل المثال غرف البطين لا مليئة تماما مع الاغاروز أو فقاعات الهواء المتبقية، قد يعيق استقرار الأنسجة. نسيج عضلة القلب غير مستقرة لا توفر ريسيس كافيةتانس إلى شفرة تهتز، مما يسبب انقطاع الأنسجة الحاد والأضرار. لضمان خفض واضح وتقليل تلف الأنسجة، وينبغي أن تكون شفرات حادة ( أي لا يعاد استخدامها أكثر من ثلاث مرات)، وينبغي أن حركة إلى الأمام من شفرة من خلال كتلة العينة تكون بطيئة قدر الإمكان، لأن شفرات مملة أو السرعة الزائدة قد تخفف من جزءا لا يتجزأ من البطينين أو تمزق الأنسجة.
لضمان نتائج موثوقة وقابلة للتكرار، ونوعية شرائح يجب أن تفي بمعايير محددة، بما في ذلك سلامة الهيكلية للأنسجة، والتي يمكن تأكيدها من قبل المجهري، والاستجابة للتحفيز الكهربائي في ترددات الضرب الفسيولوجية تصل إلى 10 هرتز.
يمكن قطع شرائح بسمك 150-400 ميكرون اعتمادا على مزيد من التطبيق. في حين أن شرائح أرق قد تمنع الظروف نقص الأكسجة في جوهر الأنسجة والسماح للكشف أسهل من الخلايا المزروعة مع المجهر مضان وكذلك تحديد المواقع أكثر دقة منأقطاب تسجيل 15 ، شرائح أكثر سمكا قد توفر سلامة أفضل من بنية الأنسجة واستقرار أعلى من الأنسجة، والتي سوف تكون مفيدة لقياسات القوة 10 والمزيد من المعالجة النسيجية بعد التسجيلات.
لمنع التأثيرات المحتملة من تركيزات بدم عالية على القنوات الأيونية وكالسيوم 2+ التعامل مع البروتينات 16 ، 17 ، ويوصى بدم غسلها من قبل حضانة شرائح في بدم خالية دمم لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل مزيد من الاستخدام. والمثير للدهشة، والانكماش والحركة اللاحقة من الأنسجة بعد بدم غسل لا تعيق تسجيلات قطب حاد.
محددات
على النقيض من نماذج زراعة الخلايا المشتركة، شرائح توفر بنية الأنسجة سليمة بما في ذلك الحفاظ على الخلايا الكهربائية والميكانيكية للاتصالات الخلية، مصفوفة خارج الخلية وتوزيع كارديوميوسيتيس وغير ميوسيتس داخل الأنسجة المحلية 6 . ومع ذلك، شرائح الأنسجة القلبية لا تتطابق تماما في الوضع في الجسم الحي ، لأنها ليست سوى 150 - 400 ميكرون سميكة، التي تقدمها المتوسطة الاصطناعية، ويمكن أن تتضرر أثناء عملية الإعداد. تريبان تلطيخ الأزرق والتقييم المناعي من نشط كاسباس-3 و بارب p85 جزء كشفت أن الخلايا داخل شرائح الجنينية، باستثناء تلك الموجودة في طبقات السطح، كانت قابلة للحياة بعد تشريح 9 .
لا يتم الحفاظ على نظام التوصيل في شرائح البطين، وانتشار الإثارة هو ثنائي الأبعاد بدلا من ثلاثي الأبعاد في شرائح مسطحة. شرائح من قلوب الجنينية تظهر الضرب العفوي لمدة تصل إلى أسبوعين في الثقافة 9 . قد تحدث تقلصات عفوية من شرائح الكبار أيضا، وليس من الواضح ما إذا كانت مستحثة عن طريق خلايا نظام التوصيل أو قد تشير إلى تلف الخلايا وكا 2 + تراكبأواد 18 .
التطبيقات المستقبلية
إلى جانب الدراسات الكهربية مع أقطاب حادة ومصفوفات القطب الصغير، والتي يمكن استخدامها للتجارب الدوائية لتحليل تأثير المخدرات على الخصائص المحتملة العمل وانتشار الإثارة 11 ، الدراسات التنموية 19 أو توصيف كارديوميوسيتس زرع 15 كما هو مبين أعلاه، شرائح البطين من حديثي الولادة وقد استخدمت قلوب لقياسات انكماش القوة 10 ، والتي يمكن تطبيقها على شرائح الكبار، أيضا. وتشمل التطبيقات المستقبلية المحتملة الأخرى (I) دراسات المجهري على المدى الطويل في شرائح مزروعة، على سبيل المثال لتقييم التكامل الهيكلي من الخلايا العضلية المستمدة من الخلايا الجذعية المستمدة حقن (إي) من الحقن تقاطع الفجوة الأصباغ نفاذية إلى التحقيق بين الخلايا اقتران أو (إي) دراسات البطانية وظيفة الأوعية الدموية من الاكليلري داخل السفن.
في الختام، شرائح البطين هي نموذج الأنسجة متعدد الخلايا قيمة مع الحفاظ عليها في الجسم الحي مثل هيكل، والتي قد تساعد على التغلب على القيود المفروضة على نماذج زراعة الخلايا المشتركة والتي تنطبق على مجموعة واسعة من الدراسات الدوائية والفسيولوجية والتنموية والعلاج الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفين ليس لديهم ما يعلن.
Acknowledgments
ونحن نقر بالدعم الذي قدمته ورش العمل والمرفق الحيوانى لمعهد الفيزيولوجيا العصبية. وأيد هذا العمل من قبل والتر أوند مارغا بول ستيفتنغ، كولن فورتشن ودويتشه ستيفتنغ فور هيرزفورسشونغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27 G x 3/4`` Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20 G 11/2`` Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
References
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
- Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
- Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).
- Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
- Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
- Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
- Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
- Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).
