Summary
ここでは、成体マウスからの生存心室スライスの調製および鋭い電極活動電位記録のためのそれらの使用を記載する。これらの多細胞調製物は、 インビボでの電気生理学的および薬理学的研究のための貴重なモデルとなる組織構造のような保存されたインビボを提供する。
Abstract
マウス心筋細胞は、心臓生理学および新しい治療戦略のインビトロ研究に広く使用されている。しかし、解離した心筋細胞の多細胞調製物は、心臓の機械的および電気生理学的特性の両方に影響を与える、心筋細胞、非心筋細胞および細胞外マトリックスの生体内構造の複合体を代表するものではない。ここでは、保存されたインビボのような組織構造を有する成体マウス心臓の実行可能な心室スライスを調製する技術を説明し、電気生理学的記録のためのそれらの適合性を実証する。心臓の切除後、脳室を心房から分離し、2,3-ブタンジオンモノオキシムを含有するCa 2+不含溶液で灌流し、4％ 低融点アガロースブロックに包埋する。このブロックを振動刃付きミクロトーム上に置き、厚さ150〜400μmの組織切片を作製し、振動をfreブレードを60-70Hzで回転させ、ブレードを可能な限りゆっくりと前進させる。スライスの厚さは、さらなる用途に依存する。スライスを、0.9mMのCa 2+および2,3-ブタンジオンモノオキシム（BDM）を含む氷冷Tyrode溶液に30分間保存する。その後、スライスを37℃のDMEMに30分間移してBDMを洗い流す。スライスは、収縮機能を分析するための力測定、または移植された幹細胞由来の心筋細胞と宿主組織との相互作用を調べるために、鋭利な電極または微小電極アレイを用いた電気生理学的研究に使用することができる。鋭い電極記録のために、スライスを倒立顕微鏡の加熱プレート上の3cm細胞培養皿に入れる。スライスを単極電極で刺激し、スライス内の心筋細胞の細胞内作用電位を鋭利なガラス電極で記録する。
Introduction
YamamotとMcllwainは1966年に脳切片の電気的活動がin vitroで維持されていることを示して以来、薄い組織切片が基礎科学で頻繁に使用されています1 。それ以来、脳2 、肝臓3 、肺4および心筋組織5,6,7の切片について電気生理学および薬理学的研究が行われてきた。新生児ラット心臓からの心室スライスにおける最初のパッチクランプ記録は1990年8月に記載されていたが、この技術はしばらくの間忘れ去られた。 10年以上後、我々のグループは、マウス胚9 、新生児10および大人11の心臓スライスを調製するための新しい方法を確立した。これらの生存可能な組織切片は、急性実験（成人スライス数時間栽培することもできる）または短期間の培養実験（胚および新生児スライスを数日間培養することができる）。スライスは、電気生理学的特徴および鋭い電極活動電位およびマイクロ電極アレイ記録11によって評価される均一な励起広がりのようなインビボで示す 。 「2次元」形態のため、脳室内のすべての領域に記録電極を直接アクセスすることができ、電気生理学的調査のための興味深いツールとなり、Langendorff灌流心臓全体と比較して新しい実験的選択肢をもたらす。ベラパミル（L型Ca 2+チャンネルブロッカー）、リドカイン（Na +チャンネルブロッカー）、4-アミノピリジン（非選択的電圧依存性K +チャンネルブロッカー）およびリノパルジン（KCNQ K）のようなイオンチャネルブロッカーに対するスライスの薬物応答は、 +チャンネルブロッカー） 9,11 10 。これらの発見は、マウス心室スライスが、生理学的および薬理学的研究のためのインビトロ組織モデルとして適切であることを実証した。さらに、鋭い電極記録と組み合わせたレシピエント心臓の心室スライスは、移植された胎児12,13,14および幹細胞由来の15の心筋細胞の電気的および機械的な統合ならびに成熟を特徴付ける非常に有用なツールであることが判明している。
要約すると、心室スライスは、価値ある、十分に確立した多細胞組織モデルであり、解離した心筋細胞およびランゲンドルフ灌流心臓に対して相補的であると考えられるべきである（解離した細胞とは対照的に） インビボのような組織構造を提供すること、および（心臓全体の準備とは対照的に）鋭い電極記録のような測定技術の直接的なアクセスを心臓の全ての領域に提供することの大きな利点がある。
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Protocol
動物の取扱いは、地域の動物福祉委員会の指針と、欧州議会の2010/63 / EU指令に適合していなければならない。
1.ソリューションの準備
- NaCl 136、KCl 5.4、NaH 2 PO 4 0.33、MgCl 2 1、グルコース10、HEPES 5,2,3-ブタンジオンモノオキシム（BDM）30を用いて、Ca 2+ （mMの組成）を含まないTyrode溶液を調製する。 4℃でNaOHで処理した。
- NaCl 136、KCl 5.4、NaH 2 PO 4 0.33、MgCl 2 1、グルコース10、HEPES 5、BDM 30、CaCl 2 0.9のCa 2+ （mM単位の組成）でTyrodeの溶液を調製する。 4℃でNaOHでpHを7.4に調整する。
- 4％低融点アガロースの調製：Ca 2+を含まないTyrode溶液15 mLに低融点アガロース0.6 gを入れます。アガロースが溶解するまで、混合物を電子レンジで750Wで10-15秒間2回加熱する。溶液を37℃の一定温度に保ち、＃176; Cを添加し、連続的に攪拌する。
- 37℃で血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）をカルボゲン（5％CO 2、95％O 2 ）で泡立てた状態に保つ。
2.ミクロトームの準備
- ミクロトームのスイッチを入れる。
- 外側のミクロトームチャンバーを氷で満たします。
- 内部ミクロトームチャンバーをCa 2+を含まない氷冷Tyrode溶液で満たし、溶液を100％O 2で連続的に酸素化する。
- スチールブレードをミクロトームのブレードホルダーに置きます。
3.マウス心臓の分離
- 2,500Uのヘパリンを皮下に注射する。 15分待ちます。
- 頚椎脱臼によって動物を犠牲にする。
- 胸骨を開ける。
- 慎重に小さなはさみと鉗子＃5を使用して心膜を切開する。
- 上行大動脈にカニューレを挿入し、 その場で冠状動脈を氷で冷やすTyrode's残りの血液が取り除かれるまで、Ca 2+を含まない溶液である。
- 穏やかに鉗子とはさみで心臓を切除し、冷たいタイロードの溶液をCa 2+なしで乗せて移します。
- メスまたはハサミで心房を心室から分離する。
4. 4％低融点アガロースへの心室の埋め込み
- アペックスを上向きにして心室をアガロースモールドに置きます（ 図1 ）。左心室の金型の中央にピンを置きます。
- 心臓が完全に覆われるまで、37℃で4％低融点アガロースでモールドを満たす。
- 金型を氷上に置き、アガロースのより速い硬化が組織の浮きを防止するようにする。
- メスを用いて、心室を含むアガロースブロックを金型から取り出す。
- ブロックを裏返しにして、心室と、アガロースブロックの裏側の隙間を満たします。20Gの針を備えたシリンジを用いて4％低融点アガロースを用いてモルトのピンによって放置された。
- メスでアガロースブロックをトリムして、ブロックの平坦な底部および心尖部の直立位置を達成する。
5.心室のスライス
- シアノアクリレート接着剤を滴下してミクロトームの試料ホルダーにブロックを固定する。心尖部を上に向けます。
- 標本ホルダーをミクロトームの内部標本チャンバーに置き、Ca 2+を含まない氷冷タイロードで満たします。タイロードの溶液でアガロースブロックを完全に覆います。
- さらなる適用（シャープな電極記録150-200μmの場合）に応じて150〜400μmの厚さの短軸スライスを準備し、ブレードの振動周波数を60〜70Hzに保ち、できるだけゆっくりとブレードを前進させる。
- 細かいブラシを使用して、残りのアガロースをスライスから慎重に除去します。
- 優しくトランスファー0.9mMのCa 2+を含むTyrode溶液にパスツールピペットでスライスし、100％O 2を通気し、スライス手順から回復するために氷上で少なくとも30分間貯蔵する。
- その後、37℃でDMEM中で30分間スライスし、カルボジェンを通気し、その後の使用の前にBDMを洗い流す。
6.シャープな電極セットアップの準備
- 予熱のために、録音が始まる30分前にすべての電気装置をオンにします。
- 3cmの細胞培養皿を、倒立顕微鏡上に置かれた加熱プレート上に置く。
- ディッシュにカスタムメイドのリング電極（ 図2 ）を置き、プリアンプと刺激電極のアース線を接続します。
- 灌流システムのフレキシブルチューブを皿に接続します。
- carbogenを通気したDMEMで灌流システムのリザーバを満たしてください。
- 灌流ポンプのスイッチを入れ、潅流を設定する2~3mL /分である。
- フローヒーターと加熱プレートを調節して、ディッシュ内のDMEMの温度を37°Cに調整します。
7.アクション潜在的なレコーディング
- DMEMで満たされた皿に心室スライスを置く。
- 倒立顕微鏡を用いて組織の構造的完全性および生存能力（収縮機能に基づく）をチェックする。
- 記録用ガラス電極に3M KCLを充填する。
- 刺激電極をDMEMで満たす。
- 記録電極と刺激電極を電極ホルダーの上に置く。
- スライス上に刺激電極を注意深く置き、電気刺激装置をオンにします。 1〜2Hzの刺激周波数で開始する。
- マイクロマニピュレータを使用して記録電極を目的の記録位置に移動します。
- 先端が組織に触れるまで、記録電極をゆっくりと下げる。
- 短い長方形の電気パルスを記録電極が細胞膜を貫通する。
- 安定した信号が得られるまで記録電極の位置を慎重に変えてください。
- 活動電位の記録を開始する。
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Representative Results
心筋梗塞は、実質的に不可逆的な心筋細胞の喪失をもたらす。外因性心臓再生のための幹細胞由来心筋細胞を用いる細胞補充療法は有望な治療アプローチである。移植された細胞の電気的統合および成熟は、細胞置換療法の安全性および効率のために重要である。
組込みおよび成熟を評価するために、本発明者らは、成熟マウスの健康な心臓に、増強された緑色蛍光タンパク質（eGFP）を発現する、誘発された多能性幹細胞（iPSCM; 0.5×10 6 iPSCM /10μLの2回の注入）に由来する心筋細胞を移植した（Peinkofer et al。方法の詳細な説明については15 ）。移植の6日後、レシピエント心臓の心室スライスを記載のプロトコールを用いて調製した。代表的な録音は図3移植されたiPSCMを含むスライスを37℃でDMEMに入れ、宿主組織中に配置された単極性電極によって局所的に刺激した（ 図3A 、左）。 eGFP陽性移植iPSCMおよびスライス内の隣接する宿主組織において、3M KClで満たされた鋭利なガラス微小電極で細胞内作用電位を記録した（ 図3A 、右）。
受容者の心臓への移植されたiPSCMの持続性および電気的統合を実証することができた。 iPSCMは、移植された心筋細胞において細胞内に記録された刺激アーチファクトおよび活動電位の時間的相互依存性が存在する場合、電気的に統合されたと考えられた（ 図3B ）。電気的統合の品質は、電気的活性化の遅延、 すなわち刺激と開始の間の遅延によって定量化することができた活動電位の上昇、および伝導ブロックのない最大刺激周波数、 すなわち 、各刺激後に1：1世代の活動電位に至る最大刺激周波数である。
この代表的な実験における移植されたiPSCMは、約5Hzの伝導ブロックのない最大の刺激頻度（ 図3B 、右）によって示されるように、電気的に統合されたが、カップリングの質は、刺激アーチファクトと活動電位アップストローク（宿主組織：8ms; iPSCM：20ms）との間の遅延。宿主心筋細胞の活動電位は、84mVの振幅、-74mVの最大拡張期電位、50％再分極時の11ms持続時間、90％再分極時の108ms持続時間および114V / sのアップストローク速度を有した。刺激周波数を1Hzから5Hzに増加させると、活動電位の低下が生じる90％再分極時のイオン（86ms）。移植されたiPSCMは、活動電位特性に有意差を示した。宿主細胞と比較して、振幅はより小さく（53mV）、最大拡張期ポテンシャルはマイナス（-54mV）、再分極50％における持続時間（14ms）、再分極90％での持続時間がより短く（90ms）、アップストローク速度より遅い（57V / s）。刺激周波数が1Hzから5Hzに増加すると、90％再分極（67ms）で活動電位持続時間が減少した。結論として、この代表的な例では、移植後6日で、分析したiPSCMは、未熟な心筋細胞の典型的な特徴を示した。この事例の知見は、統計的に十分な数の細胞および調製物の測定値と一致しており、 15日前に報告されている。
図1： 心臓をアガロースに埋め込むためのカスタムメイドの金型。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2： 鋭利な電極記録のためのカスタムメイドのリング電極（グランド）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3： 移植されたiPSCMの電気的統合 。 （ A ）eGFP陽性iPSCMを含む心室心臓スライス（左）（右）。 SE：刺激電極。赤い点が録音の位置を示します。 （ B ）健康な宿主組織（上のトレース）および移植されたiPSCM（下のトレース）における活動電位記録。スライスは、約2Hz（左のトレース）および5Hz（右のトレース）で宿主組織に配置された刺激電極で、顔面刺激された。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
心室スライスは、組織構造のような保存されたインビボでの電気生理学的、薬理学的および機械的研究ならびに心臓のすべての領域への測定技術の直接アクセスを可能にする。生理学的作用潜在的特性は、胚、新生児および成人のスライス9,10,11において示されている。スライシング手順によって直接損傷された表面層を除いて、スライスの活性は、活力染色によって確認された9 。鋭利なガラス電極を用いたスライス内の活動電位記録を用いて、本明細書に記載の移植心筋細胞の統合および成熟、または心臓活性化合物を添加した後の薬理学的研究を調査することができる。個々の細胞で1時間以上の長期間の記録が可能です。この記録時間は、逐次灌流およびウォッシュアウトによる1つの細胞に対する異なる薬理学的化合物の影響。
重要な準備ステップ
切片の品質を最適化するために、虚血組織損傷を避けるべきである。したがって、Tyrodeの溶液による心臓の心臓の灌流、急速な心臓切除および氷冷酸素添加Tyrode溶液における即時保存が重要であると考えられている。 2,3-ブタンジオンモノオキシムを用いた鼓動する心臓の固定化は、虚血に対する感受性をさらに低下させる可能性があり、低融点アガロースにおける固体埋め込みに必要とされる。低融点アガロースに包埋することは、拡散を制限することによって組織の供給を妨げる可能性があるが、スライスする前に柔らかい心臓組織を安定させるために不可欠である。標本ブロック内の小さな空洞、 例えばアガロースまたは残存気泡で完全に満たされていない心室が組織の安定化を妨げる可能性がある。不安定化した心筋組織は十分なresisを提供しない重度の組織破壊および損傷を引き起こす振動刃にぶつかる。明確な切断を確実にし、組織の損傷を最小限に抑えるためには、ブレードを鋭利にしなければならない（ すなわち 、3回以上再使用しない）。また、ブレードの往復運動は、鈍いブレードまたは過速度により心室を埋め込み、または組織を裂く。
信頼性と再現性のある結果を確実にするために、スライスの品質は、顕微鏡検査で確認できる組織の構造的完全性、および10 Hzまでの生理学的な鼓動頻度での電気刺激に対する応答を含む特定の基準を満たす必要があります。
スライスは、さらなる用途に応じて、150〜400μmの厚さで切断することができる。より薄い薄片は、組織コアにおける低酸素状態を防止することができ、蛍光顕微鏡による移植細胞の検出を容易にするとともに、記録電極15は、より厚いスライスにより組織構造のより完全な一体性と組織のより高い安定性を提供することができ、これは、力測定10および記録後のさらなる組織学的処理に有利であろう。
イオンチャネルおよびCa 2+処理タンパク質16,17に対する高BDM濃度の潜在的影響を防ぐために、さらなる使用前に少なくとも30分間BDM遊離DMEM中のスライスをインキュベートすることによるBDMウォッシュアウトが推奨される。驚くべきことに、BDMウォッシュアウト後の組織の収縮およびその後の動きは、鋭い電極記録を妨げない。
制限事項
一般的な細胞培養モデルとは対照的に、スライスは、保存された電気的および機械的細胞間結合、細胞外マトリックスおよび心筋の分布を含む無傷の組織構造を提供するネズミ組織内の非 - 筋細胞および非 -しかし、心臓組織スライスは、人工媒質によって供給される厚さがわずか150〜400μmであり、調製プロセス中に損傷を受ける可能性があるため、インビボ状況に正確に一致しない。トリパンブルー染色および活性カスパーゼ-3およびPARP p85断片の免疫組織学的評価により、表層のものを除いて、胚切片内の細胞はスライスした後に生存可能であることが明らかになった。
伝導系は心室スライスに保存されず、励起拡散はフラットスライスでは3次元ではなく2次元である。胚の心臓からのスライスは、培養で最大2週間自発的な鼓動を示す 。大人のスライスの自発収縮もまた起こり得るが、それらが伝導系の細胞によって誘導されるのか、または細胞損傷およびCa 2+を示す可能性があるかは不明であるオアド18 。
将来のアプリケーション
活動電位特性および興奮伝播に対する薬剤の影響を分析するための薬理学的実験に用いることができる鋭利な電極および微小電極アレイによる電気生理学的研究の他に、発育研究19または上記の移植心筋細胞15の特徴付け、新生児の心室スライス大人のスライスにも適用できる力収縮測定のために心臓が使用されている10 。 （II）細胞間結合を調べるためのギャップジャンクション透過性色素の注入、または（III）内皮の研究（I）、（II）細胞間結合を調べるためのギャップジャンクション透過性色素の注入、コロナの血管機能スライス内の船。
結論として、心室スライスは、一般的な細胞培養モデルの限界を克服するのに役立つ可能性があり、広範囲の薬理学的、生理学的、発生的および細胞治療研究に適用可能な、インビボ様構造のような保存された貴重な多細胞組織モデルである。
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Disclosures
著者は宣言することは何もない。
Acknowledgments
我々は、神経生理学研究所のワークショップと動物施設が提供する支援を認めています。この作品は、Walter und Marga Boll-Stiftung、KölnFortune、Deutsche StiftungfürHerzforschungによって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27 G x 3/4`` Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20 G 11/2`` Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
References
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