Summary
Qui descriviamo la preparazione di fette ventricolari vitali da topi adulti e il loro utilizzo per registrazioni potenziali di azione elettrodo. Queste preparazioni multicellulari forniscono una struttura tissutale conservata in vivo , che li rende un prezioso modello per studi elettrofisiologici e farmacologici in vitro .
Abstract
Cardiomiociti murini sono stati ampiamente utilizzati per studi in vitro di fisiologia cardiaca e nuove strategie terapeutiche. Tuttavia, le preparazioni multicellulari di cardiomiociti dissociati non rappresentano la struttura complessa in vivo di cardiomiociti, non miociti e matrice extracellulare, che influenza sia le proprietà meccaniche che elettrofisiologiche del cuore. Qui descriviamo una tecnica per preparare fette ventricolari vitali di cuori adulti con un tessuto tissutale in vivo e dimostrare la loro idoneità alle registrazioni elettrofisiologiche. Dopo l'escissione del cuore, i ventricoli vengono separati dall'atria, perfezionati con soluzione Ca 2+ -libera contenente 2,3-butanedione monoxime e incorporati in un blocco agarosio a basso contenuto di fusione al 4%. Il blocco è posto su un microtomo con una lama vibrante, e fettine di tessuto con uno spessore di 150-400 μm sono preparate mantenendo la vibrazione freDella lama a 60-70 Hz e spostare la lama in avanti in modo più lento possibile. La spessore delle fette dipende dall'ulteriore applicazione. Le fette vengono conservate in soluzione di Tyrode ghiacciata con 0,9 mM Ca 2+ e 2,3-butanedione monoxime (BDM) per 30 minuti. Successivamente, le fette vengono trasferite a 37 ° C di DMEM per 30 minuti per lavare il BDM. Le fette possono essere utilizzate per studi elettrofisiologici con elettrodi taglienti o matrici di microelettrodi, per misurare le forze per analizzare la funzione contrattile o per indagare l'interazione tra i cardiomiociti derivanti dalle cellule staminali trapiantati e il tessuto ospite. Per registrazioni di elettrodo nitide, una fetta viene posta in un piatto di coltura da 3 cm sulla piastra riscaldante di un microscopio invertito. La fetta è stimolata con un elettrodo unipolare e potenziali d'azione intracellulari di cardiomiociti all'interno della fetta sono registrati con un elettrodo di vetro nitido.
Introduction
Le fette di tessuto sottile sono state utilizzate frequentemente nella scienza di base poiché Yamamot e Mcllwain hanno mostrato nel 1966 che l'attività elettrica delle fette del cervello è mantenuta in vitro 1 . Da allora, studi elettrofisiologici e farmacologici sono stati condotti su fette da cervello 2 , fegato 3 , polmone 4 e tessuto miocardico 5 , 6 , 7 . Le prime registrazioni di patch-clamp in fette ventricolari da cuori di ratto neonatale sono state descritte nel 1990 8 , ma questa tecnica è caduta nell'oblio per un certo tempo. Più di un decennio più tardi, il nostro gruppo ha stabilito un nuovo metodo per preparare le embrioni murine 9 , le neonate 10 e le 11 fette di cuore adulte. Queste fette di tessuto vitale possono essere utilizzate per esperimenti acuti (fetta adultaS possono essere coltivati per diverse ore) o esperimenti di coltura a breve termine (fette embrionali e neonatali possono essere coltivate per alcuni giorni). Le fette mostrano in vivo caratteristiche elettrofisiologiche simili e una diffusione di eccitazione omogenea valutata con potenzialità di azione dell'elettrodo acuto e registrazioni a matrice di microelettrodi 11 . Grazie alla loro morfologia "bidimensionale", consentono l'accesso diretto degli elettrodi di registrazione a tutte le regioni del ventricolo, che li rende uno strumento interessante per le indagini elettrofisiologiche e solleva nuove opzioni sperimentali rispetto ai cuori interi perfezionati da Langendorff. La risposta del farmaco delle fette ai bloccanti del canale ionico come verapamil (bloccante canale L-tipo Ca 2+ ), lidocaina (bloccante Na + -cannel), 4-aminopiridina (bloccante K + -kanelare dipendente dalla tensione non selettiva) e linopirdina (KCNQ K + - blocco canale) 9 , 11 10 . Questi risultati hanno dimostrato che le fettine ventricolari murine sono adatte come un modello di tessuto in vitro per studi fisiologici e farmacologici. Inoltre, le fetture ventricolari di cuori riceventi in combinazione con registrazioni di elettrodo nitide hanno dimostrato di essere uno strumento molto utile per caratterizzare l'integrazione elettrica e meccanica, nonché la maturazione dei cardiomiociti fetali 12 , 13 e 14 trapiantati.
In sintesi, le fetture ventricolari sono un prezioso e ben consolidato modello di tessuto multicellulare e devono essere considerati complementari ai cardiomiociti dissociati e ai cuori perfezionati da LangendorffNella ricerca cardiovascolare, con il grande vantaggio di fornire una struttura tissutale in vivo (in contrasto con le cellule dissociate), nonché l'accesso diretto delle tecnologie di misura come le registrazioni di elettrodo nitido a tutte le regioni del cuore (in contrasto con i preparati cardiaci interi).
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Protocol
La manipolazione degli animali deve essere conforme alle linee guida del comitato locale per la protezione degli animali e alla direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo.
1. Preparare soluzioni
- Preparare la soluzione di Tyrode senza Ca 2+ (composizione in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl2 1, glucosio 10, HEPES 5, 2,3-butanedione monoxime (BDM) 30. Regolare il pH a 7,4 Con NaOH a 4 ° C.
- Preparare la soluzione di Tyrode con Ca 2+ (composizione in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl2 1, glucosio 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl2 0,9. Regolare il pH a 7,4 con NaOH a 4 ° C.
- Preparare agarosio a basso contenuto di fusione al 4%: inserire 0,6 g di agarosio a bassa percentuale di fusione in soluzione di Tyrode da 15 ml senza Ca 2+ . Scaldare la miscela in un forno a microonde due volte a 750 W per 10-15 s finché l'agarosio non si scioglie. Tenere la soluzione a una temperatura costante di 37 &# 176; C e mescolare continuamente.
- Mantenere il Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) senza siero a 37 ° C in bolle con carbogeno (5% CO 2 , 95% O 2 ).
2. Preparare il Microtomo
- Accendere il microtomo.
- Riempire la camera esterna del microtomo con ghiaccio.
- Riempire la camera interna del microtomo con la soluzione di Tyrode ghiacciata senza Ca 2+ e continuamente ossigenare la soluzione con 100% O 2 .
- Mettere una lamiera d'acciaio nel porta-lama del microtomo.
3. Isolamento del cuore del mouse
- Iniettare 2,500 U di eparina sottocutanea. Attendere 15 min.
- Sacrificare l'animale per dislocazione cervicale.
- Apri il petto con la sternotomia.
- Separare con attenzione il pericardio usando piccole forbici e una pinza # 5.
- Inserire una cannula nell'arto ascendente e perfezionare le arterie coronarie in situ con Tyrode's ghiaccio freddoSoluzione senza Ca 2+ fino a rimuovere il sangue rimanente.
- Rescondare delicatamente il cuore con una pinza e forbici e trasferire il cuore in soluzione fredda di Tyrode, guidata senza Ca 2+ .
- Separare l'atria dai ventricoli con un bisturi o forbici.
4. Incorporazione dei ventricoli in agarosio a basso contenuto di fusione del 4%
- Posizionare i ventricoli con l'apice rivolto verso l'alto nello stampo agarosio ( Figura 1 ). Posizionare il perno in mezzo dello stampo nella camera ventricolare sinistra.
- Riempire lo stampo con agarosio a basso contenuto di fusione al 4% a 37 ° C, finché il cuore non sia completamente coperto.
- Posizionare lo stampo sul ghiaccio per una tempra più rapida dell'agarosio che impedisce il galleggiamento del tessuto.
- Rimuovere il blocco di agarosio contenente i ventricoli dallo stampo con un bisturi.
- Girare il blocco capovolto e riempire le camere ventricolari e il divario sul retro del blocco agarosio, cheS lasciata dal perno del molt, con agarosio a basso contenuto di fuso al 4% utilizzando una siringa con un ago da 20 G.
- Tagliare il blocco di agarosio con uno scalpello per ottenere un fondo piatto del blocco e in posizione verticale dell'apice cardiaco.
5. Sezione del tessuto ventricolare
- Fissare il blocco sul supporto del campione del microtomo con una goccia di colla cianoacrilato. Affrontare l'apice cardiaco verso l'alto.
- Posizionare il supporto del campione nella camera del campione interno del microtomo, che è riempito di Tyrode senza ghiaccio senza Ca 2+ . Completamente coprire il blocco di agarosio con la soluzione di Tyrode.
- Preparare le fette di asse corto a uno spessore di 150-400 μm, a seconda dell'ulteriore applicazione (per registrazioni di elettrodo nitido 150-200 μm), mantenere la frequenza di vibrazione della lama a 60-70 Hz e spostare la lama in avanti in modo più lento possibile .
- Utilizzare una spazzola fine per rimuovere attentamente l'agarosio residuo dalle fette.
- Trasferisce delicatamenteR sezioni con una pipetta Pasteur nella soluzione Tyrode con 0,9 mM Ca 2+ aerata con 100% O 2 e conservarle per almeno 30 minuti in ghiaccio per recuperare dalla procedura di affettatura.
- Successivamente, tenere le fette per 30 minuti in DMEM a 37 ° C, aerata con carbogeno, per lavare BDM prima dell'uso successivo.
6. Preparazione dell'installazione dell'elettrodo Sharp
- Per il pre-riscaldamento, accendere tutti i dispositivi elettrici 30 minuti prima che le registrazioni inizieranno.
- Mettere un piatto di coltura da 3 cm sulla piastra riscaldante posta sul microscopio invertito.
- Posizionare l'elettrodo ad anello su misura ( figura 2 ) nel piatto e collegare i fili di messa a terra del preamplificatore e dell'elettrodo di stimolazione.
- Collegare i tubi flessibili del sistema di perfusione al piatto.
- Riempire il serbatoio del sistema di perfusione con DMEM, aerato con carbogeno.
- Accendere la pompa di perfusione e impostare la perfusioneTe a 2-3 ml / min.
- Regolare la temperatura del DMEM nel piatto a 37 ° C regolando il riscaldatore di flusso e la piastra riscaldante.
7. Potenziali registrazioni di azione
- Mettere una fetta ventricolare nel piatto riempito con DMEM.
- Controllare l'integrità strutturale e la vitalità (sulla base della funzione contrattile) del tessuto con il microscopio invertito.
- Riempire un elettrodo di vetro di registrazione con 3 M KCL.
- Riempire un elettrodo di stimolazione con DMEM.
- Posizionare l'elettrodo di registrazione e l'elettrodo di stimolazione sui supporti degli elettrodi.
- Posizionare con cura l'elettrodo di stimolazione sulla fetta e accendere lo stimolatore elettrico. Inizia con una frequenza di stimolazione di 1-2 Hz.
- Spostare l'elettrodo di registrazione con il micromanipolatore sulla posizione di registrazione desiderata.
- Abbassare lentamente l'elettrodo di registrazione fino a quando la punta tocca il tessuto.
- Applicare un breve impulso elettrico rettangolare attraverso laL'elettrodo di registrazione per penetrare nella membrana cellulare.
- Riposizionare con cautela l'elettrodo di registrazione fino a garantire un segnale stabile.
- Avviare la registrazione dei potenziali di azione.
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Representative Results
L'infarto miocardico porta ad una perdita praticamente irreversibile di cardiomiociti. La terapia sostitutiva cellulare che utilizza cardiomiociti derivanti da cellule staminali per la rigenerazione cardiaca esogena è un approccio terapeutico promettente. L'integrazione elettrica e la maturazione delle cellule trapiantate sono fondamentali per la sicurezza e l'efficienza della terapia sostitutiva delle cellule.
Per valutare l'integrazione e la maturazione, abbiamo trapiantato cardiomiociti derivanti da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCM; 2 iniezioni di 0,5 x 10 6 iPSCM / 10 μL) che esprimono una maggiore proteina fluorescente verde (eGFP) nei cuori sani di topi adulti (vedi Peinkofer et al. Per una descrizione dettagliata dei metodi 15 ). Sei giorni dopo il trapianto, fette ventricolari di cuori riceventi sono state preparate usando il protocollo descritto. Viene visualizzata una registrazione rappresentativaFigura 3. Una fetta contenente iPSCM trapiantato è stata collocata in DMEM a 37 ° C e focalizzata a stimolo da un elettrodo unipolare collocato nel tessuto ospite ( figura 3A , sinistra). I potenziali d'azione intracellulari sono stati registrati con microelettrodi di vetro taglienti pieni di 3 M KCl in iPSCM trapiantato positivo eGFP e il tessuto ospite vicino nelle fette ( Figura 3A , a destra).
La persistenza e l'integrazione elettrica di iPSCM trapiantati nei cuori riceventi potrebbero essere dimostrati. IPSCM sono stati considerati elettricamente integrati, se fosse presente un'interdipendenza temporale di artefatti e potenziali di azione stimolati intracellulariamente nei cardiomiociti trapiantati ( Figura 3B ). La qualità dell'integrazione elettrica potrebbe essere quantificata dal ritardo dell'attivazione elettrica, vale a dire il ritardo tra lo stimolo e l'inizio del thE la massima frequenza di stimolazione senza blocchi di conduzione, vale a dire la frequenza di stimolazione massima che porta ad una generazione di potenzialità d'azione di 1: 1 dopo ogni stimolo.
IPSCM trapiantati in questo esperimento rappresentativo sono stati integrati elettricamente, come indicato da una frequenza di stimolazione massima senza blocchi di conduzione di circa 5 Hz ( Figura 3B , a destra), ma la qualità dell'accoppiamento non era tanto buona quanto all'interno del tessuto ospite come indicato dalla più lunga Ritardo tra artefatto di stimolazione e salto potenziale d'azione (tessuto ospite: 8 ms; iPSCM: 20 ms). Le potenzialità d'azione dei cardiomiociti ospitanti avevano 84 mV di ampiezza, -74 mV potenziale diastolico massimo, durata di 11 ms a repolarizzazione del 50%, durata di 108 ms a repolarizzazione del 90% e velocità di salita di 114 V / s. L'aumento della frequenza di stimolazione da 1 a 5 Hz porta ad una diminuzione del potenziale di azione duratIon a 90% repolarizzazione (86 ms). IPSCM trapiantato ha mostrato differenze significative nelle proprietà del potenziale di azione. In confronto alle cellule ospite, l'ampiezza era minore (53 mV), potenziale diastolico massimo negativo (-54 mV), durata a 50% repolarizzazione aumentata (14 ms), durata a 90% repolarizzazione più breve (90 ms) e velocità di salita Più lento (57 V / s). Un aumento della frequenza di stimolazione da 1 a 5 Hz ha causato una diminuzione della durata del potenziale d'azione al 90% di repolarizzazione (67 ms). In conclusione, in questo esempio rappresentativo a 6 giorni dopo il trapianto, iPSCM analizzato mostrava caratteristiche tipiche di cardiomiociti immaturi. Questo risultato aneddotico è in linea con le misurazioni in un numero statisticamente sufficiente di cellule e preparati, che sono stati riportati prima del 15 .
Figura 1: Stampo su misura per l'inserimento di ventricoli in agarosio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Elettrodo ad anello su misura (messa a terra) per le registrazioni degli elettrodi Sharp. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Integrazione elettrica del iPSCM trapiantato . ( A ) Fetta ventricolare del cuore (a sinistra) contenente iPSCM positivo eGFP (a destra). SE:Elettrodo di stimolazione. Punti rossi contrassegnano la posizione delle registrazioni. ( B ) Registrazioni potenziali di azione nei tessuti sani dell'ospite (tracce superiori) e iPSCM trapiantati (tracce inferiori). La fetta è stata stimolata focalizzata con un elettrodo di stimolazione collocato nel tessuto ospite a circa 2 Hz (tracce di sinistra) e 5 Hz (tracce di destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le fetture ventricolari consentono studi elettrofisiologici, farmacologici e meccanici con una struttura tissue preservata in vivo e accesso diretto della tecnologia di misura a tutte le regioni del cuore. Le proprietà del potenziale fisiologico di azione sono state dimostrate in fette embrionali, neonatali e adulti 9 , 10 , 11 . La vitalità delle fette, ad eccezione degli strati superficiali direttamente danneggiati dalla procedura di affettamento, è stata confermata dalla colorazione della vitalità 9 . Le registrazioni potenziali di azione all'interno delle fette usando elettrodi di vetro taglienti possono essere utilizzati per indagare l'integrazione e la maturazione dei cardiomiociti trapiantati come descritto qui, o per studi farmacologici dopo l'aggiunta di composti cardioattivi. Sono possibili registrazioni a lungo termine con durata di un'ora o più in una singola cellula. Questa durata della registrazione è sufficiente per verificareL'impatto dei diversi composti farmacologici su una cellula per perfusione sequenziale e lavaggio.
Fasi di preparazione critiche
Per ottimizzare la qualità della fetta, evitare danni ai tessuti ischemici. Pertanto, la perfusione del cuore in situ con la soluzione di Tyrode, la resezione rapida del cuore e la conservazione immediata nella soluzione di tyrode ossigenata con ghiaccio freddo sono considerati cruciali. L'immobilizzazione del cuore battente utilizzando il 2,3-butanedione monoxime può ulteriormente ridurre la suscettibilità all'ischemia ed è necessaria per un incorporamento solido in agarosio a bassa fusione. Incorporare in agarosio a bassa scienza potrebbe ostacolare l'offerta di tessuti limitando la diffusione, ma è essenziale per stabilizzare il tessuto cardiaco morbido prima di affettare. Piccole cavità all'interno del blocco del campione, ad es. Camere ventricolari non completamente riempite con agarosio o residui di bolle d'aria, potrebbero ostacolare la stabilizzazione dei tessuti. Il tessuto miocardico non stabilizzato non offre resistenza sufficienteLa lama vibrante, che provoca gravi disturbi e danni ai tessuti. Per garantire un taglio chiaro e per ridurre al minimo i danni ai tessuti, le lame devono essere taglienti ( vale a dire non riutilizzate più di tre volte) e il movimento in avanti della lama attraverso il blocco del campione dovrebbe essere il più lento possibile, in quanto le lamierine o l'overspeeding Ventricoli incorporati o lacerazione del tessuto.
Per garantire risultati affidabili e riproducibili, la qualità delle fette dovrebbe soddisfare criteri specifici, tra cui l'integrità strutturale del tessuto, che può essere confermata dalla microscopia e la risposta alla stimolazione elettrica a frequenze fisiologiche di battimento fino a 10 Hz.
Le fette possono essere tagliate a uno spessore di 150-400 μm a seconda dell'applicazione. Mentre le fette più sottili possono prevenire le condizioni ipossiche nel nucleo del tessuto e consentire una più facile individuazione delle cellule trapiantate con un microscopio a fluorescenza e un posizionamento più preciso diGli elettrodi di registrazione 15 , le fette più spesse possono fornire una migliore integrità della struttura del tessuto e una maggiore stabilità del tessuto, che sarà vantaggioso per le misure di forza 10 e l'ulteriore trattamento istologico dopo le registrazioni.
Per prevenire potenziali influssi di concentrazioni elevate di BDM sui canali ionici e sulle proteine di trattamento Ca 2+ 16 , 17 , lavaggio BDM mediante incubazione di fette in DMEM libero da BDM per almeno 30 minuti prima di essere ulteriormente impiegato. Sorprendentemente, la contrazione e il successivo movimento del tessuto dopo il lavaggio BDM non ostacolano registrazioni di elettrodo nitide.
limitazioni
In contrasto con i modelli comuni di coltura delle cellule, le fette offrono una struttura intatta del tessuto, tra cui cellule elettriche e meccaniche conservate a connessioni cellulari, matrici extracellulari e distribuzione di cardiomiocchiTes e non miociti all'interno del tessuto nativo 6 . Tuttavia, le fette di tessuto cardiaco non corrispondono esattamente alla situazione in vivo , in quanto sono di spessore di soli 150-400 μm, fornite da un mezzo artificiale e potrebbero essere danneggiate durante il processo di preparazione. La colorazione del Trypan blu e la valutazione immunohistologica del frammento attivo di caspasi-3 e PARP p85 hanno rivelato che le cellule in fette embrionali, ad eccezione di quelle degli strati superficiali, erano vitali dopo l'affettatura 9 .
Il sistema di conduzione non è conservato in fette ventricolari, e la diffusione dell'eccitazione è piuttosto tridimensionale rispetto a tridimensionale nelle fette piatte. Le fette di cuori embrionali mostrano una battuta spontanea fino a due settimane nella cultura 9 . Possono verificarsi anche contrazioni spontanee di fette adulte e non è chiaro se siano indotti da cellule del sistema di conduzione o possono indicare danni cellulari e Ca 2+ overlOad 18 .
Applicazioni future
Oltre agli studi elettrofisiologici con elettrodi taglienti e matrici di microelettrodi che possono essere utilizzati per esperimenti farmacologici per analizzare l'impatto dei farmaci sulle proprietà potenziali di azione e sulla diffusione di eccitazione 11 , studi di sviluppo 19 o caratterizzazione dei cardiomiociti trapiantati 15 come mostrato in precedenza, fette ventricolari di neonatali I cuori sono stati utilizzati per misure di contrazione della forza 10 , che potrebbero essere applicate anche a fette adulte. Ulteriori potenziali applicazioni future includono (I) studi a lungo termine di microscopia in fette coltivate, per esempio per valutare l'integrazione strutturale dei cardiomiociti derivanti da cellule staminali iniettate, (II) iniezione di coloranti periferici di giunzione delle giunzioni all'accoppiamento intercellulare studiato o (III) studi di endoteliali E la funzione vascolare della coronaImbarcazioni all'interno delle fette.
In conclusione, le fetture ventricolari sono un valido modello di tessuto multicellulare con struttura conservata in vivo , che può aiutare a superare le limitazioni dei modelli comuni di coltura cellulare e sono applicabili ad una vasta gamma di studi farmacologici, fisiologici, di sviluppo e di terapia cellulare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Acknowledgments
Riconosciamo il sostegno offerto dai laboratori e dalla struttura animale dell'Istituto di Neurofisiologia. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Walter und Marga Boll-Stiftung, dalla Köln Fortune e dalla Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27 G x 3/4`` Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20 G 11/2`` Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
References
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
- Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
- Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29 (2014).
- Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
- Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
- Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
- Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
- Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
- Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
- Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
- Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
- Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
- Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
- Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
- Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
- Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).
