Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Fremstilling af plasmamembresvesikler fra knoglemarv Mesenkym stamceller til potentiel cytoplasm erstatningsterapi

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55741
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Multidisciplinary Research Center, Shantou University

Summary

Aldersrelaterede sygdomme er forbundet med flere defekter i cytoplasmaets komponenter. Her præsenterer vi en protokol til fremstilling af plasmamembranvesikler fra knoglemarvs mesenkymale stamceller. Denne teknik kan potentielt anvendes som et middel til cytoplasmudskiftningsterapi til at forbedre eller endog omvendt aldersrelaterede fænotyper.

Abstract

Vi har tidligere rapporteret om dannelsen af ​​plasmamembresvesikler (PMV'er) gennem mekanisk ekstrudering af pattedyrceller. Fusionen af ​​PMV'er med mitochondriale mangelfulde Rho0-celler genoprettede mitotisk aktivitet under normale dyrkningsbetingelser. Aterosklerose, type 2 diabetes, Alzheimers sygdom og kræft er aldersrelaterede sygdomme, der er rapporteret at være forbundet med flere mekaniske og funktionelle defekter i cytosol og organeller af en række celletyper. Knoglemarv mesenkymale stamceller (BMSC'er) repræsenterer en unik cellepopulation fra knoglemarven, som har selvfornyelsesevne, samtidig med at deres multipotensitet opretholdes. Suppleringen af ​​senescensceller med ung cytoplasma fra autologe BMSC'er via fusion af PMV'er giver en lovende tilgang til forbedring eller endog omvendt aldersrelaterede fænotyper. Denne protokol beskriver, hvordan man forbereder PMV'er fra BMSC'er via ekstrudering gennem en polycarbonatmembran med 31; m porer, bestemme forekomsten af ​​mitokondrier og undersøge vedligeholdelsen af ​​membranpotentialet inden for PMV'er ved anvendelse af et konfokalt mikroskop, koncentrere PMV'er ved centrifugering og udføre in vivo injektionen af ​​PMV'er i muskels gastrocnemius muskel.

Introduction

En stor mængde indsats er blevet brugt til at etablere tilgange til gen-, enzym- og celleudskiftningsterapier. Dette har resulteret i store gennembrud og endda kliniske anvendelser 1 , 2 , 3 . For nylig blev en kontroversiel mitokondrierepoterterapi baseret på nukleoverførselsteknologi anvendt til in vitro befrugtning til kvinder i alderdommen eller med en dødelig mitokondriell DNA-mutation 4 . Defekter, der findes i aldersrelaterede sygdomme, herunder aterosklerose, type 2 diabetes, Alzheimers sygdom og kræft, er som regel mange facetter. Det er blevet dokumenteret, at akkumuleringen af ​​lipiddråber; Aflejringen af ​​amyloidprotein; Opbevaring af udfoldede proteiner i det endoplasmatiske retikulum; Og defekt proteasom, autophagosom og mitokondrier bidrager til udviklingen eller forværringen af ​​disse sygdomme"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . I øjeblikket er der ingen tilgængelig mekanisme rettet mod direkte afhjælpning af funktionsfejl i cytosol og organeller, hvilket forårsager senescens og aldrende fænotyper.

Vi har tidligere rapporteret om dannelsen af ​​plasmamembresvesikler (PMV'er) gennem den mekaniske ekstrudering af pattedyrceller 12 . Med undtagelse af kernen blev komponenter i membranen eller cytosolen, herunder proteiner og RNA, såvel som organellerne, såsom mitokondrier, fundet i PMV'er. I det væsentlige kan en PMV betragtes som en miniature enucleeret celle. Endnu vigtigere fik fusion af PMV'er med mitokondrier-defekte Rho0-celler genoprettet mitotisk aktivitet under normale dyrkningsbetingelser. Dette er den første rapport om establiUdvise en potentielt effektiv tilgang til cytoplasm-erstatningsterapi.

Knoglemarvs mesenkymale stamceller (BMSC'er) er multipotente stamceller, som rutinemæssigt genereres fra knoglemarven og ekspanderes let i kultur. Embryonale stamcelle markører Oct4, Nanog og SOX2 er blevet påvist ved lave niveauer i MSCs 13 . Telomeraseaktivitet er også målelig. Desuden gør fraværet af co-stimulerende molekyler og humane leukocytantigen (HLA) klasse II-molekyler såvel som lav HLA klasse I-ekspression på MSC'er dem ideelle celler til allogen eller "off-the-shelf" -brug i Både regenerativ medicin og immunmodulerende anvendelser 14 .

Her beskriver vi hvordan man forbereder PMV'er fra mus BMSC'er via ekstrudering gennem en polycarbonatmembran med 3 μm porer, bestemmer forekomsten af ​​mitokondrier og undersøge vedligeholdelsen af ​​membranpotentialet i PMV'er ved anvendelse af confocAl mikroskopi, forberede koncentrerede, men ikke aggregerede PMV'er ved centrifugering og udføre in vivo injektionen af ​​PMV'er i muscus gastrocnemius muskelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

8 til 12 ugentlige BALB / c-mus blev købt fra Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, Kina) og opdrættet i et specifikt patogenfrit og luftkonditioneret dyreanlæg. Dyrepleje og forsøgsprocedurer var i overensstemmelse med retningslinjerne for brug og pleje af forsøgsdyr etableret af Shantou University.

1. Montering af apparatet

  1. For at sikre sterilitet skal du tænde UV-lyset af en vævskulturhætte i 30 minutter før brug.
  2. Skru en engangs 25 mm filterenhed ned og sænk hætten og bunden af ​​enheden i en 200 ml glasskål fyldt med 75% ethanol i 30 minutter. Enheden er lavet af polypropylen af ​​medicinsk kvalitet.
  3. Hæld hætten og bunden af ​​enheden ved hjælp af tang, skub den resterende ethanol for hånden, og lad dele lufttørre i 10 minutter i hætte.
  4. Våd en 19 mm polycarbonatmembran i PBS, og læg den omhyggeligt oven på bundens understøtningsmatrixM af enheden. Polymerfilmen har en glat, flad overflade og spor-ætset 3 μm porer.
  5. Monter enheden igen ved at skrue låget tæt ned mod bunden. Sørg for, at membranen ikke løsnes fra midten.
  6. Fjern nålen af ​​en 1 ml insulin sprøjte og træk 1 ml PBS. Fastgør sprøjten til filterenheden, og tryk derefter PBS gennem enheden for at vådte aggregatet og for at teste om der er lækage.

2. Generering af plasmamembranvesikler (PMV'er)

  1. Etablere en BMSC-kultur, som rapporteret af Nemeth et al. 15 i DMEM kulturmedium indeholdende 15% FBS og 1% penicillin / streptomycin. Dyrk cellerne i en 6-brønds plade i en befugtet inkubator indeholdende 5% CO2 ved 37 ° C.
  2. For at propagere cellerne fjernes dyrkningsmediet og skylles brønden med 0,5 ml calciumfri PBS.
  3. Tilsæt 0,5 ml 0,25% trypsin-EDTA og inkuber cellerne ved 37 ° CI 3 min. Tryk pladen imod håndfladen et par gange for at lette celledepositionen. Stop fordøjelsen ved at tilføje 1 ml dyrkningsmedium.
  4. Saml cellerne i et 15 ml konisk rør og drej ved 200 xg i 2 minutter i en bænk-topcentrifuge. Resuspender cellerne i 4 ml dyrkningsmedium og alikvot cellerne i to brønde af en 6-brønds plade.
    BEMÆRK: Celler når sædvanligvis sammenløbet omkring 24 timer.
  5. For at generere PMV'er, høst cellerne fra en brønd (ca. 5 x 10 5 celler) af en 6-brønds plade ved trypsinfordøjelse og monodisperse cellerne i 0,5 ml dyrkningsmedium.
  6. Læg cellerne i insulinsprøjten, fastgør den til filterenheden, og skub stemplet hurtigt for at klemme cellerne gennem filteret. Kassér det ekstruderede medium, fordi der kun bør være et par PMV'er inde i det.
  7. Læg yderligere 0,5 ml medium i sprøjten og skub det hurtigt gennem filteret. Samlet mediet af den anden ekstrudering, som indeholderS PMV'er af forskellig størrelse.
  8. Indsæt 150 μL af det opsamlede medium i en 35 mm glasbundet skål og lad PMV'erne sætte sig i bunden i ca. 10 min. Undersøg PMV'erne under et inverteret fase kontrastmikroskop udstyret med et CCD kamera ved hjælp af 20X objektivlinsen.

3. Undersøgelse af indholdet i PMV'erne ved hjælp af konfokal mikroskopi

  1. For at udføre transfektion i BMSC'erne fortyndes 2 μg supercoiled plasmid DNA og 6 μl kationisk transfektionsreagens ( fx PolyJet) i 50 μl serumfri DMEM. Vortex skal blandes godt og spinde kort for at samle al væske fra rørets sider.
  2. Tilsæt den fortyndede opløsning (fra trin 3.1) dråbevis i fortyndet DNA-opløsning, hvirvel kraftigt i 1 minut, snurr kort og inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter.
  3. Udskift det gamle medium på BMSC'erne, som er blevet podet ved ca. 30% sammenblanding natten over, med 2 ml frisk dyrkningsmedium og tilsæt DNEn transfektionsblanding dråbevis.
  4. Udskift med 2 ml frisk medium efter 12 timers transfektion.
  5. For at spore cytoplasmatisk lokaliserede proteiner transfekterer cellerne med plasmidet indeholdende en EGFP-ekspressionskassette (pEGFP-N1) som beskrevet ovenfor. Høst cellerne ved trypsinfordøjelse 48 timer efter transfektion for PMV-generering som beskrevet ovenfor.
  6. For at spore mitokondrierne, pletter cellerne med mitokondriske farvestoffer (1 μM, MitoTracker) i frisk dyrkningsmedium i 30 minutter ved 37 ° C.
  7. For at detektere mitochondriernes membranpotentiale, pletter cellerne med cyaninfarvestoffet JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetrachlor-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyaniniodid) (10 μg / ML) i frisk dyrkningsmedium i 30 minutter ved 37 ° C.
    1. Vask cellerne med 0,5 ml PBS tre gange og høst derefter cellerne ved trypsinfordøjelse til PMV-generering som beskrevet ovenfor.
    2. Indlæs 150 μL af den indsamlede medIum i en 35 mm glasbundet skål og lad PMV'erne sætte sig i bunden i ca. 10 min. Undersøg PMV'erne under et konfokalmikroskop ved brug af 100X-objektivlinsen.
  8. For at detektere EGFP eller mitokondriske farvestoffer, skal du tænde 488 nm laser og indsamle signal ved 505-530 nm. For at detektere JC-1 skal du tænde laserne på 488 nm og 543 nm og indsamle signaler ved 505-530 nm og 560-615 nm. Indstil pinholeværdien til omkring 1,4.

4. Fremstilling af koncentrerede PMV'er ved centrifugering

  1. Høst cellerne ved trypsinfordøjelse og generere PMV'er som beskrevet ovenfor i 0,5 ml dyrkningsmedium.
  2. Spin PMV'erne ved 1200 xg i en benchtopcentrifuge i 5 minutter ved stuetemperatur. Sug forsigtigt supernatanten og resuspender pelleten i 100 μl dyrkningsmedium med forsigtig hvirvling.
  3. Indsæt 50 μL PMV'er i en 35 mm glasbundet skål og lad dem sætte sig ved stuetemperatur i ca. 10 min. Undersøg PMV'erneUnder et konfokalmikroskop ved brug af 40X-objektivlinsen.
  4. Tilsæt serien af ​​fortyndet polyethylenimin (PEI) opløsning til BMSC-kulturen i 1 time og kontroller for tegn på cytotoksicitet.
    BEMÆRK: Her blev PEI ved 2 μg / ml valgt, da der ikke blev påvist tegn på toksicitet i BMSC'er.
  5. Høst cellerne ved hjælp af trypsinfordøjelse og tilsæt PEI ved 2 μg / mL i 1 time for at oplade cellemembranen som et middel til at forhindre aggregering. Generer PMV'er som beskrevet ovenfor i 0,5 ml dyrkningsmedium. Koncentrer PMV'erne og undersøge dem under et konfokalt mikroskop som beskrevet ovenfor.

5. Injektion af PMV'er i Gastrocnemius Muscle

  1. For at plette membranen tilsættes CM-DiI (chloromethyl dialkyl-indocarbocyanin) (10 μM) farvestof i 1 ml frisk dyrkningsmedium til BMSC'erne i 30 minutter.
  2. Høst cellerne (ca. 5 x 105) ved trypsinfordøjelse og resuspender dem i 0,5 ml dyrkningsmedium. Tilsæt PEI (2 μg / ml) til 1h. Generere og koncentrere PMV'erne i 100 μl dyrkningsmedium som beskrevet ovenfor.
  3. Anæstes en BALB / c-mus ved at injicere natriumbarbital (10 mg / kg) efter 12 timers fastning.
  4. Rengør ydersiden af ​​gastrocnemius muskel med 75% ethanol. Inducer langsomt PMV'erne (100 μL) i gastrocnemius-muskelen ved hjælp af en 30 G insulinsprøjte.
  5. Efter administration af anæstesien skal du placere en våd gaze over øjnene under forsøgets varighed og varme musen med et glødelampe, indtil det vågner op. Hus musen alene i et individuelt ventilationsbur.
  6. For at høste gastrocnemius muskel 12 timer efter operationen, dræb musen ved cervikal dislokation.
  7. Drys 75% ethanol over gastrocnemius musklerne, åbner huden med en saks og skærer hele gastrocnemius muskler i begge ender.
  8. Skyl musklerne med PBS og undersøge det under et fluorescensmikroskop ved hjælp af 20X objektivlinsen.
  9. Trim musklerne med aSkarpt knivblad til fjernelse af dele uden fluorescens. Skær dele med stærk rød fluorescens i ca 9 mm 3 terninger.
  10. Embed hver terning i optimal snitstemperaturmedium (OCT), sænk det i flydende nitrogen i 5 minutter, og opbevar det i en -20 ° C fryser indtil brug.
  11. Skær de frosne sektioner i stykker 20 μm tyk ved hjælp af en kryostat og klæb hvert afsnit til en glasskinne. Skyl sektionen en gang med PBS.
  12. Tegn en cirkel rundt om sektionen med en plet cirkel pen og tilføj 100 μL DAPI (1 μg / ml). Aspirer DAPI-opløsningen efter 10 minutters inkubation ved stuetemperatur i mørke og vask tre gange med PBS.
  13. Sæt monteringsolie over prøven, dæksel den med en glideskive, og forsegl glideren med neglelak. Undersøg sektionen under et konfokalmikroskop ved brug af 100X-objektivlinsen.
  14. For at registrere CM-DiI skal du tænde laser 543 nm og indsamle signal ved 560-615 nm. For at registrere DAPI skal du tænde 405Nm laser og indsamlingssignal ved 420-480 nm. Indstil pinholeværdien til ca. 1,4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nøglen til en vellykket forberedelse af PMV'er afhænger meget af den korrekte samling af filterenheden ( Figur 1 ), som kan testes ved at skubbe 1 ml PBS gennem membranen. Hvis der opstår lækage, skal filterenheden monteres igen og testes igen. Lækage kan dog kun testes pålideligt, når cellerne skubbes gennem membranen. Hvis der kun registreres et par PMV'er under et regelmæssigt mikroskop ved hjælp af 10X-objektivet, eller hvis størrelsen af ​​PMV'erne hovedsagelig er omkring 1 μm, vil det tyde på, at de fleste celler er fanget inde i enheden på grund af forkert samling. PMV'er med en størrelse i området omkring 3 μm i diameter var overvejende, når de blev undersøgt under et fasekontrastmikroskop ved anvendelse af 20X-målet ( figur 2 ). Da PMV'er af nanometerstørrelse ikke var let visualiseret, var procentdelen af ​​store PMV'er i antal tal lave. Det viste sig at være nyttigt at trykke hurtigt på sprøjten for at komme igenDuce mængden af ​​membranaffald, som tilsyneladende undlader at danne sfæriske PMV'er. Endvidere blev PMV'er med mindre størrelser (mindre end 1 μm) fundet i det første ekstruderingsmedium, med større PMV'er udvundet i den anden ekstrudering.

Det mest unikke aspekt af PMV'erne var indkapslingen af ​​cellulære komponenter bortset fra kernen 12 . BMSC'er blev transficeret med en ekspressionskassette af EGFP i 48 timer, før de blev anvendt til PMV-præparation. Resultaterne viser, at cytoplasmatisk lokaliseret EGFP-protein kan indkapsles i PMV'er ( Figur 3A ). Indkapslingen af ​​mitokondrier blev påvist ved farvning af mitokondriske farvestoffer, hvilket viser, at en stor del af, men ikke alle, PMV'er indeholder grønne fluorescerende prikker, der indikerer mitokondrier ( figur 3 ). Nogle af PMV'erne, selv dem med en diameter så stor som 3 μm, viste ikke tegn på at indeholde mitokondrier, hvilket tyder påVed nogle mekaniske begrænsninger kan det forhindre indkapsling af mitokondrier i PMV'er. Membranpotentialet for mitokondrier blev detekteret ved JC-1-farvning, hvilket udsender rød fluorescens, når mitokondrier har et normalt potentiale. Resultatet viser, at rød fluorescens faktisk blev detekteret i PMV'er ( Figur 3 ), mens den grønne fluorescens ikke var detekterbar (data ikke vist), hvilket tyder på, at mitokondrierne i PMV'erne var funktionelle.

En koncentrationsproces for PMV'er er nødvendig, især til in vivo applikation for at reducere volumen såvel som at fjerne de cellulære komponenter frigivet under ekstrudering. Efter centrifugering ved 1200 xg i 5 minutter ved stuetemperatur blev meget få PMV'er af mindre størrelse fundet i supernatanten. For at lette resuspensionen af ​​pelleten blev et 2 ml rundbundet rør anvendt til centrifugeringen. Imidlertid aggregeredes de fleste PMV'er i pelleten, især PMV'er med mindre størrelser ( Figur 4 ). Dette skyldes sandsynligvis adhesionsmolekyler på membranen. Mediet blev derfor suppleret med PEI (2 μg / ml), hvis koncentration var skræddersyet til ikke at have nogen mærkbar cytotoksicitet. Den positive ladning af PEI bundet til cellemembranen forhindrede aggregeringen af ​​PMV'er under centrifugering ( Figur 4 ).

Endelig blev membranerne af BMSC'er mærket med CM-DiI-farvestof inden fremstillingen af ​​PMV'erne ( Figur 5 ). Efter koncentration blev PMV'er injiceret i musklerne gastrocnemius muskler, som blev høstet 12 timer efter operationen og undersøgt under et konfokalt mikroskop. Frosne sektioner af gastrocnemius muskel blev undersøgt for tilstedeværelsen af ​​rød fluorescens, som blev detekteret inden for myofiberen ( Figur 5 ), hvilket viste, at PMV'er blev leveret til cytoplasma, sandsynligvis via endocytose. Bemærk, røde fluorerCens blev fundet omkring periferien af ​​myofiberen (data ikke vist), hvilket indikerer, at en stor del af PMV'er enten ikke var endocytose eller var lige ved begyndelsen af ​​endocytose 12 timer efter injektion.

figur 1
Figur 1: Montering af filterenheden. ( A ) Kommercielt tilgængelige polycarbonatmembraner. ( B ) Spor-ætsede porer med en diameter på 3 μm, set under et optisk mikroskop med et 20X objektiv. Målestang = 50 μm. ( C ) Membranen blev anbragt oven på bærermatrixen af ​​en engangsfilterenhed. ( D ) Den samlede filterenhed med en membran indeni. Klik her for at se en større version af denne figur.

side = "1"> Figur 2
Figur 2: Generering af PMV'er fra BMSC'er. ( A ) BMSC'er fra mus blev dyrket i en 6-brønds plade. ( B ) BMSC'er (5 x 105) blev høstet ved trypsinfordøjelse og monodisprimeret i 500 μl dyrkningsmedium. Billeder af vedhæftede og resuspenderede BMSC'er blev taget under et optisk mikroskop med et 20X objektiv. ( C ) Celler blev fyldt i en insulinsprøjte, inden de blev fastgjort til filterenheden. ( D ) PMV'er genereret fra BMSC'er blev fyldt i en 35 mm glasbunds skål og undersøgt under et inverteret fase kontrastmikroskop ved anvendelse af en 20X objektivlins. Skalestænger = 40 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Les / ftp_upload / 55741 / 55741fig3.jpg "/>
Figur 3: Påvisning af PMV-indhold ved konfokal mikroskopi. PMV'er blev genereret fra ( A ) BMSC'er transficeret med pEGFP-N1 i 48 timer for at spore det cytoplasmatisk lokaliserede EGFP-protein, ( B ) BMSC'er farvet med mitochondrialt farvestof (1 μM) i 30 minutter for at spore eksistensen af ​​mitokondrier eller BMSC'er farvning med JC-1 (10 μg / ml) i 30 minutter for at bekræfte mitochondriernes membranpotentiale. PMV'er, der blev genereret fra BMSC'er, blev fyldt på en 35 mm glasbunds skål og undersøgt af konfokal mikroskopi ved brug af en 100x olie objektivlinsen. Skalestænger = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Koncentration af PMV S ved centrifugering. BMSC'er (5 x 105) blev høstet ved trypsinfordøjelse og resuspenderet i 0,5 ml dyrkningsmedium, som blev suppleret med eller uden 2 μg / ml PEI. Genererede PMV'er blev spundet ved 1200 g i 5 minutter, resuspenderet i 100 μl dyrkningsmedium og undersøgt under et konfokalt mikroskop med et 40X oliemål. ( A ) Skematisk af PMV-aggregering skyldes sandsynligvis interaktionen af ​​adhæsionsmolekyler efter centrifugering. ( B ) Skematisk af PMV'er, der opretholder monodispersion efter at være blevet ladet med PEI. ( C ) Aggregerede PMV'er efter centrifugering. ( D ) PMV'er viser mindre aggregering efter centrifugering på grund af positiv opladning med PEI. Skalestænger = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Gure 5 "src =" / files / ftp_upload / 55741 / 55741fig5.jpg "/>
Figur 5: Levering af CM-DiI-mærkede PMV'er til gastrocnemius muskelen. PMV'er blev genereret fra 5 x 10 5 BMSC'er, koncentreret ved centrifugering i et volumen på 100 μl og injiceret langsomt i gastrocnemius muskel af en BALB / c-mus. ( A ) Skematisk af PMV injektion. ( B ) BMSC'er mærket med CM-DiI; Skalbjælke = 20 μm. ( C ) PMV'er frembragt fra CM-DiI-mærkede BMSC'er og undersøgt ved konfokal mikroskopi; Skalestang = 10 μm. ( D ) Gastrocnemius muskel høstet 12 timer efter operationen; Skalbjælke = 20 μm. ( E - H ) Frosne afsnit af gastrocnemius muskel undersøgt ved konfokal mikroskopi; Skalestang = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Li Ka Shing Foundation, Guangdong High Level University Project "Grønne Technologies for Marine Industries", Natural Sciences Foundation of China (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) og Education Department of Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IsoporeTM membranes Millipore TSTP04700 3 mm pore
Disposable filter unit Xinya, Shanghai, China 25 mm Medical grade polypropylene
Insulin syringe BD 328446 1 mL
pN1-EGFP Clontech  6085-1
MitoTracker Molecular Probes M7514 Green FM, 1 μM
JC-1 Beyotime, Haimen, China C2006 10 mg/mL
CM-DiI Beyotime, Haimen, China C1036 10 mM
PEI Sigma P3143 Mn = 75,000
Fluorescence Microscope Nikon Eclipse TE 2000 With CCD camera
Confocol Microscope Carl Zeiss LSM 510 Meta
PolyJet SigaGen SL100688 For cell transfection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
  2. Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
  3. Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
  4. Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
  5. López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  6. Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
  7. Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
  8. Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
  9. Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
  10. Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
  11. Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
  12. Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
  13. Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
  14. Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
  15. Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, Unit 22F.12 (2013).
  16. Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , [Epub ahead of print (2017).
  17. Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
  18. Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
  19. Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
  20. Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
  21. Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 123 plasmamembranvesikler mitokondrier cytoplasm-erstatningsterapi celleekstrudering knoglemarvstamceller aldersrelaterede sygdomme foryngelse
Fremstilling af plasmamembresvesikler fra knoglemarv Mesenkym stamceller til potentiel cytoplasm erstatningsterapi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, L. q., Lin, M. j., Li, Y. p.,… More

Xu, L. q., Lin, M. j., Li, Y. p., Li, S., Chen, S. j., Wei, C. j. Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy. J. Vis. Exp. (123), e55741, doi:10.3791/55741 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter