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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

Published: June 15, 2017 doi: 10.3791/55765
Automatic Translation
1, 1
1Transgenic Animal Unit, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

Summary

La microinezione di ovociti del mouse è comunemente utilizzata sia per il transgenesi classico ( cioè l'integrazione casuale dei transgeni) sia per il targeting del gene mediato da CRISPR. Questo protocollo riesamina gli ultimi sviluppi della microinjection, con particolare attenzione alle strategie di controllo della qualità e genotipizzazione.

Abstract

L'uso di topi geneticamente modificati ha contribuito in maniera significativa agli studi sui processi fisiologici e patologici in vivo . L'iniezione pronucleare di espressioni del DNA in oociti fecondati rimane la tecnica più comunemente utilizzata per generare topi transgenici per sovraespressione. Con l'introduzione della tecnologia CRISPR per il targeting genico, l'iniezione pronucleare in oociti fecondati è stata estesa alla generazione di topi di knockout e knockin. Questo lavoro descrive la preparazione del DNA per l'iniezione e la generazione di guide CRISPR per il targeting genico, con particolare attenzione al controllo di qualità. Le procedure di genotipizzazione necessarie per l'identificazione dei potenziali fondatori sono critiche. Le strategie innovative di genotipizzazione che sfruttano le funzionalità "multiplexing" di CRISPR sono qui presentate. Sono inoltre descritte procedure chirurgiche. Insieme, i passaggi del protocollo consentiranno la generazione di genI topi eticamente modificati e per la successiva istituzione di colonie del mouse per una pletora di campi di ricerca, tra cui immunologia, neuroscienza, cancro, fisiologia, sviluppo e altri.

Introduction

I modelli animali, sia in vertebrati che in invertebrati, sono stati strumentali ad esaminare la fisiopatologia delle condizioni umane come la malattia di Alzheimer 1 , 2 . Sono anche strumenti preziosi per la ricerca di modificatori della malattia e per sviluppare in ultima analisi nuove strategie di trattamento nella speranza di una cura. Sebbene ogni modello abbia limiti intrinseci, l'uso degli animali come interi modelli sistemici è fondamentale per la ricerca biomedica. Questo perché l'ambiente fisiologico metabolico e complesso non può essere interamente simulato nella cultura del tessuto.

Fino ad oggi, il topo rimane la specie mammiferi più diffusa per la manipolazione genetica perché presenta diversi vantaggi. I processi fisiologici e i geni associati alle malattie sono altamente conservati tra topi e esseri umani. Il topo è stato il primo mammifero a sequenziare il proprio genoma (2002), un anno prima del genoma umanoMe (2003). Oltre a questa ricchezza di informazioni genetiche, il mouse ha buone capacità di allevamento, un veloce ciclo di sviluppo (6 settimane dalla fecondazione allo svezzamento) e una dimensione ragionevole. Tutti questi vantaggi, accoppiati con indicatori fisiologici, come i colori del cappotto distinti (richiesti per le strategie di attraversamento), hanno reso il topo un modello attraente per la manipolazione genetica. Soprattutto, nella prima età della genetica moderna, Gregor Mendel ha iniziato a lavorare sui topi prima di passare alle piante 3 .

Le tecniche di trasferimento del gene hanno determinato la generazione del primo topo transgenico più di tre decenni fa 4 , inizialmente creato usando la consegna virale. Tuttavia, i ricercatori hanno subito capito che una delle principali sfide del transgenesi del mouse era l'incapacità di controllare il destino del DNA esogeno. Poiché la consegna virale di transgeni nei oociti del mouse ha portato a copie multiple integrate casualmente nel genoma, la possibilitY di stabilire linee transgeniche successive era limitata.

Una tale limitazione è stata superata quando Gordon et al. Ha generato la prima linea del mouse transgenica mediante microinjection 5 , 6 . Ciò ha inizio l'epoca della tecnologia del DNA ricombinante ei parametri che influenzano l'esito di una sessione di microinjection sono stati ampiamente studiati 7 . Sebbene la microinjection non consente di controllare il sito di integrazione del transgene (che alla fine determina livelli di espressione specifici per ogni mouse fondatore), il vantaggio principale della microinjection pronucleare rimane la formazione di concatenanti ( cioè, array di copie multiple del transgene, Collegati in serie) prima dell'integrazione genomica 5 . Questa caratteristica è stata utilizzata nel corso degli anni per stabilire migliaia di linee di topi transgenici che sovraespressionano un gene di interesse. Da allora, la transgenesis, l'aModificazione rtificale del genoma di un organismo, è stata ampiamente utilizzata per identificare il ruolo dei geni singoli nel verificarsi di malattie.

Un altro successo chiave nella manipolazione del genoma del mouse è stato raggiunto quando Mario Capecchi ha interrotto con successo un singolo gene nel topo, aprendo l'era del gene targeting 8 . Tuttavia, i principali inconvenienti sono emersi rapidamente dal targeting genico basato su cellule ES, incluse le sfide di coltura delle cellule ES, il grado di chimerismo un po 'variabile e la durata del processo ( ovvero 12-18 mesi, minimo per ottenere il topo) .

Recentemente, i metodi alternativi per le nuove tecnologie, come le endonucleasi ingegnerizzate ( es. Le nucleasi a dito di zinco (ZFN), le nucleasi efficace di attivazione della trascrizione (TALEN) e le cluster ripetute palindromiche brevi (CRISPR / Cas9) Accelerare il processo di targeting genico nel micE 9 , 10 . Queste endonucleasi possono essere facilmente iniettate in oociti del mouse mediante microinjection, permettendo la generazione di topi mirati per il gene in appena 6 settimane.

Dalla prima relazione sull'utilizzo di CRISPR per la modifica del genoma 11 , questo sistema immunitario adattativo batterico ha sostituito ZFN e TALEN a causa dei suoi molti vantaggi, tra cui la facilità di sintesi e la capacità di individuare contemporaneamente più loci (indicati come "multiplexing "). CRISPR è stato utilizzato per l'individuazione genica nei topi 12 e da allora è stato applicato a innumerevoli specie, dalle piante agli esseri umani 13 , 14 . Ad oggi non esiste alcuna relazione di una singola specie resistente al montaggio del genoma CRISPR.

Le due principali fasi di limitazione della generazione di topi transgenici sono l'iniezione di oociti e la reimplantazioneDi questi oociti in femmine pseudo-incinte. Anche se questa tecnica è stata descritta da noi 15 e altri 16 , i recenti miglioramenti tecnici nell'embrione del topo e nelle tecniche di trasferimento del gene hanno rivoluzionato il processo di generazione di topi geneticamente modificati. Questi miglioramenti saranno descritti qui.

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Protocol

Tutte le procedure sono state approvate dall'Università del Nuovo Galles del Sud.

1. Preparazione del transgene (integrazione casuale)

  1. Elettroforesi analizzante per gel agarosio.
    1. Digestare il plasmide per accise il transgene usando enzimi appropriati (1 h di incubazione) o enzimi digestivi (15-30 minuti di incubazione) in un termociclista seguendo le raccomandazioni del produttore (vedere la figura 2A e la sua leggenda).
    2. Condurre un agarosio di 1% di tris-acetato-etilendiammeto-tetraacetico (EDTA) (TEA), colorato con 0,5-1,0 μg / ml di etidio bromuro (EtBr).
      NOTA: usare cautela quando si utilizza EtBr; È un mutageno potente. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale (consultare la scheda di sicurezza dei materiali).
    3. Caricare un marker molecolare di 1 kb.
    4. Caricare i frammenti linearizzati ( cioè transgene e spina dorsale). Eseguire l'elettroforesi a 100 V per 45 minuti.
    5. Visualizzare il gel su un transilluminatore ultravioletto (UV) per verificare che la digestione sia completa e confermare la giusta dimensione del transgene ( vale a dire 7.338 bp; vedere la figura 2A ).
  2. Elettroforesi preparato con agarosio gel.
    1. Portare un gel agarosico di TAE 1% macchiato con una macchia di gel a bassa tossicità. Caricare 8 aliquote (1 μg ciascuna) di transgene linearizzato senza marcatore di peso molecolare e eseguire l'elettroforesi a 100 V per 45 minuti. Utilizzare un bisturi per accise tutte le 8 bande corrispondenti al transgene linearizzato.
    2. Estrarre il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel seguendo le raccomandazioni del produttore (vedere la tabella dei materiali ).
      1. Sciogliere i frammenti di gel a 50 ° C in tubi da 1,5 ml per almeno 15 minuti. Precipitare con isopropanolo e quindi aggiungere il tampone di legame.
      2. Combina l'intero DNA pipettandolo tutto in una colonna. Eluire nel tampone di microinjection senza nucleasi (8 mM Tris-HCl e 0,15 mM EDTA). Filtrare attraverso un filtro da microfiltrazione da 0,22 μm e centrifugare per 60 s a 12,000 x g.
    3. Misurare la concentrazione e la qualità del DNA utilizzando uno spettrofotometro. Controllare che il rapporto A260 / A280 sia di circa 1,8 ( cioè, nessuna contaminazione da proteine) e il rapporto A260 / A230 sia almeno 2,0 ( cioè nessuna contaminazione da solventi organici). Diluire fino a 3 ng / μl in tampone di microinjection privo di nucleasi, aliquota (20-50 μL) e congelare a -20 ° C.

2. Sintesi dei componenti CRISPR (targeting del gene)

  1. Cas9 mRNA.
    1. Diluire l'mRNA Cas9 (ottenuta da una fonte commerciale, vedere la Tabella dei Materiali ) ad una concentrazione di 1 μg / μl in tampone di microinjection privo di nucleasi.
    2. Aliquota in 2 μL e libera Ze a -80 ° C.
  2. Single-guide RNA (SgRNA).
    1. Identificare le sequenze genomiche a due bersodi (guide) usando uno strumento di progettazione computazionale che consenta l'attività minima potenziale fuori bersaglio 17 .
      1. Per il knockout genico, selezionare sistematicamente due guide situate in centinaia di coppie di base (bp), in direzioni opposte, e includere il codone iniziale del gene di interesse. Per la riparazione diretta dell'omologia, selezionare due guide sovrapposte (ove possibile), in direzioni opposte.
        NOTA: ad esempio, le seguenti guide sono state recentemente co-iniettate per interrompere il primo esone del gene TPM4.2 :
        Guida 1: 5 'CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3';
        Guida 2: 5 'CAGAACGATTGAGCTATGGC 3'
    2. Ordinare un insieme di primer come descritto nella tabella 1 .
    3. Sintetizzare un modello DNA lineare.
      1. Dilute px330Ref "> 12 plasmidi a 10 ng / μl in acqua priva di nucleasi.
      2. Preparare il mix master come indicato nella tabella 1 . Aggiungere la polimerasi alla fine e mantenere il mix master sul ghiaccio.
      3. Mescolare e suddividere questo in 8 tubi PCR (19 μL / tubo). Aggiungere 1 μL di px330 per tubo e eseguire il PCR nelle seguenti condizioni: 1 min a 98 ° C; 40 cicli di 98 ° C per 10 s, 64 ° C per 30 s e 72 ° C per 15 s; E un allungamento finale a 72 ° C per 5 min. Tenere a 4 ° C.
      4. Purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione PCR (vedi tabella dei materiali ), un collettore e una sorgente di vuoto (per una più veloce elaborazione). Applicare la forza di vuoto massima ( vale a dire, 8 mbar).
        1. Aggiungere 5 volumi (100 μL) di buffer di legame a 1 volume del campione PCR e mescolare.
        2. Posizionare una colonna di spin di membrana di silice (in dotazione) in un tubo di raccolta da 2 mL fornito (per la centrifugazione) o sul collettore per il processo di vuotoing. Per legare il DNA, successivamente applicare tutti e 8 i campioni alla colonna e sottovuoto o centrifugare per 60 s a 12.000 xg per ogni carico.
        3. Per lavare, aggiungere 0,75 ml di tampone di lavaggio (tampone PE) alla colonna e sottovuoto o centrifugare per 60 s a 12.000 x g. Centrifugare la colonna per 60 s a 12.000 xg per eliminare l'etanolo residuo.
        4. Collocare la colonna in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Per eluire il DNA, aggiungere al centro della membrana 30 μL di acqua priva di nucleasi, lasciare la colonna per 1 min e centrifugare per 60 sec a 12.000 g.
      5. Misurare la concentrazione usando uno spettrofotometro; Tipicamente, la concentrazione dovrebbe essere di 100 ng / μL o superiore. Controllare che il rapporto A260 / A280 sia di circa 1,8 ( cioè, nessuna contaminazione da proteine) e il rapporto A260 / A230 sia almeno 2,0 ( cioè nessuna contaminazione da solventi organici).
    4. Trascrizione in vitro utilizzando un kit di sintesi T7 RNA.
      1. Preparare tMasterizzare come indicato nella tabella 1 e incubare per 3 ore a 37 ° C in un termociclatore. Aggiungere 28 μl di acqua priva di nucleasi e 2 μL di DNasi I e incubare per altri 15 minuti a 37 ° C in un termociclatore.
    5. RNA purificazione utilizzando colonne di spin.
      1. Sciogliere la polvere contenuta nella colonna di centrifuga fornita in 650 μl di tampone di microinjection senza nucleasi, rimuovendo con attenzione tutte le bolle d'aria. Coprire il tubo e l'idrato per 5 - 15 minuti a temperatura ambiente.
      2. Rimuovere il tappo blu in basso e collocare la colonna in un tubo da 2 ml. Centrifugare per 2 min a 750 xg e temperatura ambiente. Collocare la colonna in un nuovo tubo da 1,5 ml e applicare 50 μL di soluzione RNA in goccia al centro senza toccare la parete della colonna. Spin la colonna per 2 minuti a 750 x g.
      3. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro (la resa tipica di una reazione è di 30-50 μg). Controllare che il rapporto A260 / A280 sia aIl tondo 2,0 ( cioè, nessuna contaminazione da proteine) e il rapporto A260 / A230 è almeno 2,0 ( cioè nessuna contaminazione da solventi organici). Conservare i sgRNA a -80 ° C fino all'uso.
      4. Valutare la qualità dell'RNA utilizzando i gel TAE dell'1% usati normalmente per l'elettroforesi del DNA. Eseguire 200-400 ng del modello DNA e il corrispondente sgRNA in parallelo. La banda RNA (≈ 100 bp) dovrebbe essere leggermente più grande della fascia del DNA (vedi figura 3A ).

3. Modello del donatore

  1. Ordinare oligonucleotidi a singolo filamento sintetizzato commercialmente (ssOligos, vedere la tabella dei materiali ) per mutazioni puntuali o per l'integrazione di piccole sequenze fino a 50 bp; Le armi di omologia sono tipicamente 60-90 bp lunghe.
  2. Per gli inserimenti più grandi, utilizzare un plasmide donatore come modello. Generare un plasmide adatto utilizzando il metodo classico di clonazione o la sintesi de novo da unFonte commerciale.
    NOTA: Si consiglia un minimo di 800 bp per braccio di omologia. La dimensione della spina dorsale non ha alcuna influenza sull'efficienza della riparazione diretta dell'omologia (HDR).

4. Mix di iniezione

  1. Diluire l'mRNA di Cas9 a 50 ng / μL e gli sgRNA a 12,5 ng / μL (25 ng / μL in totale) utilizzando tampone di microinezione privo di nucleasi per esperimenti di eliminazione dei geni. Aggiungere il template del donatore (ssOligo o plasmide) ad una concentrazione di 200 ng / μL per esperimenti di modifica del genoma basati sulla riparazione diretta dell'omologia.
    NOTA: I volumi di diluizione possono essere facilmente determinati utilizzando strumenti online, come un calcolatore di resuspension 18 .
  2. Tenere ogni aliquota sul ghiaccio durante la seduta di microinjection e scartare dopo (non ri-congelare il mix di iniezione).

5. Vasectomia Scrotal

NOTA: due tipi di vasectomia vengono comunemente eseguiti nei topi: addominali e scrotal. L'ultimoÈ meno invasivo e è stato precedentemente descritto 15 .

  1. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici in acciaio inox.
  2. Determinare il peso del mouse utilizzando una scala di peso e anestetizzare i maschi mediante iniezione intraperitoneale (ip) con anestetici iniettabili (ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg).
  3. Monitorare la perdita del riflesso del pizzico del piede e una volta che il topo è sedato, posizionarlo sopra un tappetino di riscaldamento.
  4. Disinfettare la pelle intorno ai testicoli con salviette alternate di antisettico topico come la clorexidina e il 70% di etanolo.
  5. Spingere i testicoli nel sac scrotal e fare un'incisione cutanea con un bisturi.
  6. Visualizzare il testis, cauda epididymis e vas deferens.
  7. Afferrare i vas deferens con le pinze, tenerlo e cauterizzare su ogni lato della pinza per rimuovere 3 mm dei vas deferens.
  8. Eseguire la stessa procedura sul secondo testicolo.
  9. Chiudere le incisioni della pelle con le clip della ferita e controllareTopo da vicino fino al completo recupero.

6. Superovulazione (donatori di Oociti) e Time-accoppiamento (Pseudo-pregnant Females)

NOTA: è stata descritta altrove la tecnica per generare un numero adeguato di ovociti fecondati e femmine da femmine collegate per la reimplantazione.

  1. Iniettare 10 femmine ip con 5 IU di gonadotropina sierica (PMSG) in mare di gravidanza, in circa 100 μL, intorno alle 12 del giorno 1.
  2. Iniettare le femmine ip con 5 UI di gonadotropina corionica umana (hCG; in 100 μL) 46-48 h più tardi (intorno alle 11 del mattino il giorno 3).
  3. Collegare immediatamente le femmine con i singoli maschi durante la notte.

7. Iniezioni pronucleari (integrazione casuale) e citoplasmatiche (targeting gene)

  1. Togliere i topi superovulati dalla dislocazione cervicale, esporre l'addome e accedere alle ovaie e agli ovuli, come descritto in precedenza 15 . Dissect the oPresenta e raccoglie i complessi cumulo-oociti (COC) sotto uno stereomicoroscopio 15 . Metterli in una goccia di mezzo di ottimizzazione di potassio simplex integrato con amminoacidi (KSOMaa) seguendo il metodo tradizionale 15 .
  2. Purificare gli oociti aggiungendo approssimativamente 1 μL di ialuronidasi (10 mg / ml) alla goccia del mezzo KSOMaa usando un pezzo di bocca dell'aspirazione e posizionare il piatto in un incubatore di CO 2 di 37 ° C / 5% per 30 s a 1 min.
  3. Lavare gli oociti con 4 gocce di mezzo di KSOMaa usando il pezzo della bocca dell'aspirazione e trasferirle in una goccia finale di mezzo KSOMaa sovrapposto ad olio minerale (circa 2 ml). Mettere il piatto nel incubatore di CO 2 di 37 ° C / 5% finché gli oociti sono pronti per l'iniezione.
  4. Iniezione pronucleare (integrazione casuale).
    1. Visualizzare le uova sotto il microscopio stereoscopico e trasferire circa 50 uova alla camera di iniezione (un droP di media M2 sovrapposti con olio minerale) utilizzando il pezzo di bocca dell'aspirazione.
    2. Trasferire la camera di iniezione al microscopio invertito e iniettare gli oociti fecondati (due pronuclei visibili) con pochi picolitri del mix di iniezione, puntando su un pronucleo (qualsiasi pronuclei può essere mirato). Visualizzare un'iniezione di successo osservando il gonfiore del pronucleo.
  5. Iniezione citoplasmatica (targeting gene).
    1. Trasferire circa 50 uova a una goccia di KSOMaa contenente 5 μg / mL di Cytochalasin B usando la bocca e incubare per 5 minuti nel 37 ° C / 5% CO 2 incubatore.
    2. Trasferire le uova alla camera di iniezione usando la bocca.
    3. Iniettare pochi picolitri del mix di iniezione nel citoplasma a una pressione molto bassa (50-100 hPa), utilizzando la pressione di compensazione del microinjector automatico, ove possibile.
    4. Dopo l'iniezione, trasferire gli oociti in una goccia di KSOMaa (usando la bocca) e tenerli nel incubatore di CO 2 di 37 ° C / 5% fino a caricare per reimplantare nell'ovulità delle femmine pseudo-incinte.

8. Reimplantazione

  1. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici in acciaio inox.
  2. Determinare il peso del mouse utilizzando la bilancia di peso e anestetizzare le femmine mediante iniezione intraperitoneale (ip) con anestetici iniettabili (ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg).
  3. Monitorare la perdita del riflesso del pizzico del piede e una volta che il topo è sedato, posizionarlo sopra un tappetino di riscaldamento.
  4. Clip una grande area della pelliccia intorno alla linea mediana dorsale del mouse femminile.
  5. Disinfettare la pelle esposta con salviette alternate di antisettico topico come la clorexidina e il 70% di etanolo.
  6. Esporre il tratto riproduttivo seguendo il metodo tradizionale 15 . Fai un'incisione della pelle lunga 1 cm parallela alla linea mediana dorsale, taglia il muscolo e afferra il pad grasso wiUna pinza, quindi estrarre delicatamente l'ovario fino a quando il relativo oviduct attaccato e l'utero sono chiaramente visibili.
  7. Fissare il pasticcio grasso con un morsetto per vaso. Visualizzare l'ovidotto sotto il microscopio stereoscopico ed usando una coppia di micro-forbici effettuare un'incisione nella parete dell'ovidotto pochi millimetri a monte dell'ampolla.
  8. Sotto il microscopio stereoscopico, caricare 25 uova microinjected nel capillare di vetro collegato alla bocca pezzo (il diametro interno del capillare dovrebbe essere circa 120 μm di larghezza). Introdurre il capillare di vetro nell'ovidotto e espellere fino a quando una bolla d'aria è visibile all'interno dell'ampolla.
  9. Rimuovere delicatamente il capillare di vetro e posizionare il tratto riproduttivo nell'addome. Sutura l'incisione con 3-0 suture chirurgiche non assorbibili, quindi chiudere con le clip della ferita. Monitorare attentamente il mouse fino al completo recupero.

9. Strategie di Genotipizzazione / Sequencing

NOTA: Isolare la genomicaDNA da biopsie di coda o orecchie da 2 mm, seguendo le normative relative all'etica degli animali.

  1. Estrazione del DNA genomica veloce (integrazione casuale).
    1. Lyse i campioni di tessuto (~ 2 mm) a 95 ° C per 1 h in 100 μl di reagente alcalino di lisi (25 mM di sodio idrossido e 0,2 mM EDTA, pH = 12).
    2. Aggiungere 100 μl di reagente neutralizzante (40 mM Tris-HCl, pH 5).
    3. Centrifugare per 5 minuti a 12.000 g e 4 ° C.
  2. Estrazione genomica di DNA di alta qualità (targeting del gene).
    1. Aggiungere 500 μl di tampone di coda (50 mM Tris, pH 8, 100 mM EDTA, pH 8, 100 mM NaCl, SDS 1% e 0,5 mg / mL proteinasi K, aggiunto di nuovo).
    2. Incubare per una notte a 55 ° C.
    3. Mescolare per 5 minuti invertendo (non vorticarsi).
    4. Aggiungere 250 μl di NaCl saturo (6 M) e mescolare per 5 minuti invertendo (non vortice).
    5. Spin per 5-10 min a 12.000 xg e 4 ° C e versare il supernatante in un nuovo tubo. Aggiungere 500 μl di isopropanolo e mescolare per 5 minuti invertendo (non vortice).
    6. Spin per 10 min a 12.000 xg e temperatura ambiente.
    7. Decanta il surnatante (il pellet è invisibile e si attacca al tubo).
    8. Lavare con 1 mL di etanolo al 70%.
    9. Spin per 5-10 min a 12.000 xg e temperatura ambiente. Rimuove con attenzione il surnatante, poiché il pellet bianco non è più appiccicoso e può essere perso.
    10. Asciugare l'aria per ~ 1 h.
    11. Aggiungere 400 μl di tampone TE (10 mM Tris e 1 mM EDTA, pH = 8).
    12. Sciogliere il DNA a 55-60 ° C per 2 ore.
  3. Design primer.
    1. Progettare i primer per un minimo di 20 bp lungo utilizzando uno strumento di calcolo 19 .
      NOTA: Per l'integrazione casuale, i primers dovrebbero ibridizzare con il transgene, generando un frammento distinto di 200-800 bp. Per il targeting del gene, progettare i primer in modo che ibridizzino con il DNA genomico, generando una distinta fRagmentare qualche centinaio di bp intorno ai siti tagliati. Per i grandi inserimenti, i primers possono sedere sul transgene, ma la conferma dell'integrazione mirata dovrebbe essere successivamente eseguita usando il camminatore a primer o una tecnica simile.
  4. Genotipizzazione PCR.
    1. Per ogni modifica genomica, progettare un nuovo protocollo PCR e testarlo empiricamente. Si consideri la lunghezza del frammento generato e la temperatura di fusione (Tm) di ciascuna coppia di primer.
  5. Sequencing.
    1. Per il targeting gene, inviare i prodotti PCR a un fornitore di servizi di sequenziamento di Sanger.

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Representative Results

Di seguito sono descritti i flussi di lavoro per la microinjection in caso di integrazione casuale e CRISPR-mediated gene targeting ( Figura 1 ).

Figura 1
Figura 1: flusso di lavoro tipico per la generazione di topi modificati geneticamente. Per l'integrazione casuale, il transgene purificato viene iniettato nel pronucleo di ovociti fecondati prima del trasferimento di ovidotto in femmine affine. L'analisi della progenie è fatta da PCR dopo una rapida estrazione genomica del DNA. Per il targeting del gene CRISPR, i sgRNAs sono sintetizzati usando il metodo non clonato descritto qui e due guide vengono co-iniettate (insieme a Cas9 mRNA) nel citoplasma di oociti fecondati. Questa strategia è usata per l'analisi successiva di PCR della progenie, che richiede altamente purificata gDNA enomico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sebbene la microinjection di ovociti e la reimplantazione di queste uova iniettate siano i due limiti principali che richiedono competenze tecniche e formazione, la qualità del mix di iniezione è di fondamentale importanza per generare con successo i topi geneticamente modificati. La qualità della purificazione del transgene ( Figura 2A ) e la sintesi di sgRNAs ( Figura 3A ) dovrebbero essere sistematicamente valutate sui gel agarosici analitici. Le contaminazioni potenziali del mix devono essere verificate anche quando si misura la concentrazione con uno spettrofotometro, in quanto i diversi valori di assorbimento dipendono direttamente dal grado di purezza della soluzione (vedere punti 1.2.3, 2.2.3.5 e 2.2.5.3).

Figura 2B ) sia per il targeting genico ( Figura 3B ). I protocolli di estrazione del DNA sono anche differenti a seconda del tipo di esperimenti; I PCR successivi si basano su primers che ibridano rispettivamente sul transgene o sul DNA genomico. Le strategie presentate qui consentono la facile risoluzione dei problemi e la razionalizzazione di ogni fase richiesta per produrre topi geneticamente modificati.

Sebbene l'esito quantitativo di una sessione di microinjection varia a seconda dell'esperienza dello sperimentatore, una volta che ogni passo del protocollo è ottimizzato, la percentuale di cuccioli transgenici ottenuti deve tipicamente raggiungere il 10-25% per l'integrazione casualeCome illustrato nella Figura 2B (4 fondatori su 15 cuccioli nati = 26,6%). Questa efficacia un po '"bassa" contrasta con la capacità affidabile dei componenti CRISPR di modificare il genoma del mouse. Infatti, il numero dei fondatori generati è generalmente maggiore quando si utilizza CRISPR per il targeting del gene e varia da 25 a 100% (vedi figura 3B ; 3 fondatori su 13 cuccioli = 23%). Non è raro ottenere un'intera progenie che sia correttamente omozigote quando vengono modificati usando CRISPR.

figura 2
Figura 2: Strategia di controllo della qualità e di genotipizzazione per la produzione di successo di topi transgenici per sovraespressione. ( A ) Il plasmide viene digerito per 1 ora con PvuI e NotI. Digestione completa e dimensioni corrette ( cioè, transgene = 7.338 bp, spina dorsale = 1.440+ 896 bp) sono controllati su un gel analitico (1). L'estrazione di diversi prodotti di digestione dal gel preparativo (2) genera una maggiore concentrazione del transgene. È necessario evitare l'esposizione prolungata a UV, e si consiglia l'uso di una luce blu in sostituzione di un transilluminatore UV. (B) Strategia di genotipizzazione (1): i primer dovrebbero essere seduti sul transgene e dovrebbero essere progettati per generare un frammento di 200-800 bp. Quando viene eseguita la genotipizzazione (2), si raccomanda di includere un controllo positivo ( cioè il mix di iniezione utilizzato per la microinezione) e un controllo negativo ( cioè, DNA genomico da un topo WT). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Controllo della qualità e genotipizzazione StraTegy per la produzione di successo di topi per il gene (KO). ( A ) La qualità dei sgRNA prodotta dalla trascrizione in vitro è valutata eseguendo il modello DNA e l'RNA generato in parallelo per ciascuna guida. La dimensione dell'RNA è leggermente più grande del DNA. Se la qualità sia soddisfacente ( cioè non ci sono strisce di smear) le concentrazioni vengono misurate. ( B ) (1) Progettazione delle due guide (direzioni opposte) che comprendono il codone di inizio in Exon 1. I primers sono selezionati per ibridizzare con il DNA genomico al di fuori della regione eventualmente esclasti dalle due guide. Tipicamente, questa strategia permette di identificare direttamente eterozigoti (# 5 e 9) e omozigoti (# 3) KO fondatori utilizzando PCR (2). I prodotti PCR di animali omozigoti non mostrano alcuna fascia WT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Reazione componenti Volume Nota Sintesi del modello DNA lineare
(2,5) Acqua libera da nucleasi 97,2 μL Tampone HF 5x 36 μL MgCl2 9 μL 10 mM dNTPs 9 μL 10 μM primer fwd 9 μL 5'TTAATACGACTCACTATAGN 20
gttttagagctagaaatagcaagttaaaata
Aggctagtc 3 ' Primer di 10 μM 9 μL 5 'AAAAGCACCGACTCGGTGCC 3' PrLa polimerasi di lettura 1,8 μL IVT utilizzando un kit di sintesi T7 RNA
(2,6) Acqua libera da nucleasi X μL Portare fino a 20 μL di volume totale Mix di buffer NTP 10 μL Template DNA ≈ 300 ng T7 RNA polimerasi 2 μL

Tabella 1: Composizione delle miscele master diverse utilizzate in questo studio. Sintesi del modello DNA lineare: La sequenza minima del promotore T7 (TTAATACGACTCACTATAG) è a monte della sequenza a 20 bp (guida, N 20 identificata usando lo strumento di progettazione CRISPR) e una sequenza complementare al vettore di espressione (gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtc). In vitroTrascrizione (IVT): A seconda della concentrazione del modello DNA, il volume finale deve essere regolato a 20 μL con acqua priva di nucleasi.

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Discussion

Fasi critiche all'interno del protocollo

La generazione di topi geneticamente modificati è noto per essere tecnicamente impegnativa. Tuttavia, il protocollo qui presentato è un metodo ottimizzato e semplificato che consente di masterizzare e risolvere la tecnica in tempo record. Ci sono due fasi necessarie per il completamento della tecnica. In primo luogo, la sintesi di modelli lineari del DNA (per la sintesi di sgRNAs) può essere ottenuta senza cloruro di magnesio (MgCl2). Tuttavia, è altamente raccomandato aggiungere sistematicamente MgCl 2 al mix master poiché l'ibridazione parziale del primer avanzato viene spesso impedita in assenza di MgCl 2 . Inoltre, è fondamentale che la sequenza genomica mirata non sia presente in nessuna parte del template del donatore (in caso di integrazione mirata) altrimenti la casola di Cas9 lo taglierà, impedendo la presenza di HDR.

modificheE risoluzione dei problemi

Anche se questo protocollo per la generazione di topi geneticamente modificati è stato ottimizzato e semplificato nel corso degli anni, ci sono alcune considerazioni relative alla resa di ovociti di buona qualità per la microinezione e al tasso di inserimento delle femmine in fetta. La scelta del ceppo di fondo è critica per quanto riguarda il numero di cuccioli vivi risultanti da una sessione di microinjection. C57BL / 6 è lo sfondo più utilizzato per i modelli di malattie del mouse. Tuttavia, è anche uno degli sfondi meno efficienti in termini di resistenza alla microinjection 20 . Inoltre, l'età della femmina è anche fondamentale per produrre un gran numero di ovociti; Si raccomanda di evitare i topi 5-8 settimane di età, indipendentemente dal background, in quanto questo è il periodo meno favorevole di risposta alla stimolazione ormonale 21 . Nella nostra esperienza, i topi da 3 a 4 settimane C57BL / 6 rendono affidabile 20-30 uova per femmina. È importanteSi noti che una nuova tecnica (chiamata ultra-superovulazione) ha prodotto fino a 100 uova per femmina e recentemente è stato usato per generare oociti per microinezione 22 . Tuttavia, l'uso di ultra-superovulazione per microinjection è generalmente ostacolato dalla necessità di concimare artificialmente (fecondazione in vitro ) un così grande numero di uova.

Per ottenere le femmine adattate adattate per la reimplantazione, i topi femminili sono accoppiati con maschi vasectomizzati (lo sfondo di questi topi non è critico). Per aumentare il numero di destinatari inseriti, è possibile eseguire attentamente l'esame dello stadio dell'estrus e la selezione di femmine adatte 23 . La sincronizzazione dei cicli delle femmine può anche essere indotta esponendo le femmine ai maschi vasectomizzati due giorni prima dell'accoppiamento (il cosiddetto "effetto Whitten") 24 .

Limitazioni della tecnica

Modifiche genomiche molto piccole, come mutazioni puntuali, sono relativamente facili da generare, ma sono difficili da identificare. Quando viene eseguita la genotipizzazione, i prodotti PCR vengono sequenziati direttamente dalla sequenza di Sanger. Tuttavia, la microinezione diretta dei componenti CRISPR in oociti del mouse genera spesso animali mosaici perché il Cas9 rimane attivo per un bel po 'di tempo e diverse modificazioni genomiche possono verificarsi dopo la prima divisione dell'oocyte. Questo effetto confondibile complica l'identificazione di mutazioni discrete tra i vari alleli, e la sequenza di nuova generazione (NGS) può aiutare con le letture impegnative. Tecniche sensibili, come il tetra-primerARMS-PCR, 25 può anche aiutare a genotipizzare la colonia dopo l'identificazione dei fondatori mediante sequenziamento.

Al contrario, l'inserimento di grandi pezzi di DNA in modo mirato rimane impegnativo. Maggiore è il DNA esogeno, minore è l'efficienza di HDR. Di conseguenza, sono in fase di sviluppo nuove strategie, come ad esempio l'uso di donatori a lungo termine (in sostituzione di plasmidi) o di integrazione mirata indipendente da HDR 27 .

Significato del protocollo

Questo protocollo presenta notevoli progressi perché i nostri quattro passaggi principali ( cioè la preparazione dei componenti transgene o CRISPR, microinjection, reimplantation e genotyping) sono stati ottimizzati, testati e convalidati nel nostro laboratorio.

L'integrazione casuale dei transgeni è ampiamente utilizzata per studi di sovraespressione per due ragioni principali. In primo luogo, per evitareId "potenziale" effetto di posizione ", l'integrazione mirata di un transgene utilizzando CRISPR in" safe harbor "loci, come il Rosa26 28 e il Col1a 29 loci, rimane notoriamente impegnativo, in quanto l'efficienza di HDR è basso. Le strategie per superare questo problema sono 26 , 27 , ma l'integrazione casuale è finora dimostrata più efficiente. Inoltre, la generazione di più righe transgeniche che esprimono lo stesso transgene con diversi livelli di espressione è di interesse per studi che implicano strategie di trattamento per invertire un fenotipo 30 . I transgeni a base di plasmidi vengono generati per mezzo di clonazione, utilizzando enzimi di restrizione ad hoc per assemblare frammenti essenziali per l'espressione di una proteina di interesse. In genere, un transgene è costituito da almeno tre elementi: un promotore adatto (a volte vengono aggiunte regioni di miglioramento); La codificaSequenza (cDNA), con o senza regioni introniche; E una coda PolyA per stabilizzare l'espressione di mRNA 31 .

Una volta assemblato, il transgene viene inserito in un plasmide contenente elementi di replicazione batterica e ampliato in coltura dopo la trasformazione (in genere a caldo shock). Il metodo di purificazione dei transgeni per la microinezione è fondamentale. Questo lavoro descrive l'uso di macchie di DNA di nuova generazione (bassa tossicità) per la visualizzazione più accurata del frammento di interesse sul gel (rispetto al violetto di cristallo tradizionale) e di un'esposizione bassa mutagena (rispetto all'etidio bromuro).

Il metodo di non clonazione descritto qui per il targeting del gene è molto veloce e consente la sintesi di diversi sgRNA in soli 5-6 h. Sono necessari solo quattro passaggi: l'identificazione della sequenza mirata, la sintesi di un modello DNA lineare contenente un promotore T7 e la sequenza bersaglio scelta, la sintesiF sgRNA mediante trascrizione in vitro (IVT) e la purificazione del sgRNA mediante colonne di spin.

All'età precoce del montaggio del genoma del mouse di CRISPR, il potenziale effetto off-target è stato sistematicamente valutato, anche se è stato dimostrato essere molto limitato negli embrioni di topo 32 e può essere facilmente diluito per mezzo di un regime di riproduzione in cui i topi selezionati portano solo La modificazione genomica desiderata. L'attività a destinazione è stata sistematicamente pre-valutata in vitro , utilizzando guide differenti e selezionando quelli più attivi12. Questa pratica è ora meno comune, per diversi motivi. In primo luogo, l'attività a destinazione viene valutata usando la trasfezione di linee di cellule del mouse immortalizzate (tipicamente N2a o NIH3T3) con i plasmidi CRISPR-codificanti. Questo è un metodo diverso da quello dell'iniezione di componenti CRISPR RNA in oociti del mouse. Pertanto, i risultati trovati in vitro non sempre tradursi ugualmenteA oociti. Inoltre, gli esperimenti di alto throughput hanno mostrato che la maggior parte delle guide sono attive 33 . Di conseguenza, l'attività a destinazione non viene valutata e finora non è stata dimostrata alcuna indicazione di una guida che non mostra alcuna attività nei oociti del mouse. Insieme al metodo di non clonazione per sintetizzare gli sgRNA, presentato qui, semplifica e semplifica notevolmente il flusso di lavoro e più guide attive possono essere sintetizzate senza soluzione di continuità in un solo giorno.

CRISPR è considerata una "tecnologia disruptiva", un'innovazione che modifica le modalità di esecuzione delle tecniche. Quando è stata stabilita la microinezione, Brinster et al. Ha mostrato che la transgenesia citoplasmatica, pur raggiungibile, è rimasta per lo più inefficiente 7 . Di conseguenza, la microinjection pronucleare è rimasta l'unica pratica comune per quasi 30 anni, fino alla prima dimostrazione di un successo di CRISPR gene mirato nei topi. Questo studio ha dimostrato che il microinject citoplasmatico Ion potrebbe generare un risultato simile o superiore rispetto alla consegna pronucleare 12 . Ovviamente, poiché i componenti CRISPR sono tipicamente costituiti da RNA, è evidente che il citoplasma è mirato. Tuttavia, anche quando iniettato nel citoplasma, i modelli di donatore possono anche indurre con successo HDR. Una elevata concentrazione citoplasmatica dei templati permette la loro diffusione nel nucleo. Inoltre, l'uso di microinjection citoplasmatico piezo-driven 16 non è un requisito. Una breve incubazione degli oociti con un inibitore del citoscheletro, come il Cytochalasin B, aumenta la sopravvivenza degli oociti 34 , 35 , rendendolo sufficiente per eseguire iniezioni citoplasmatiche senza un sistema di azionamento piezo. Allo stesso modo, l'uso di un mezzo di coltura migliorato, come KSOMaa, riduce il blocco alla fase a due celle e migliora le capacità di sviluppo degli embrioni rispetto al mezzo M16Xref "> 36.

Gli embrioni di una cellula o due cellule (quando coltivati ​​durante la notte) possono essere trasferiti all'ovidotto. La procedura convenzionale è piuttosto invasiva, in quanto richiede la strappo della bursa che protegge l'ovaia. È anche tecnicamente impegnativo, perché il capillare di vetro deve essere inserito nell'infundibolo 15 . Il metodo presentato qui è molto più facile da imparare, non indurisce potenziali sanguinamenti e preserva l'integrità dell'ovaio. Si basa sul lavoro sviluppato all'università di Kumamoto 37 .

Le strategie di genotipizzazione e le tecniche di sequenziamento sono critiche per identificare i potenziali fondatori. Per l'integrazione casuale, l'estrazione del DNA genomico si basa su un metodo semplice adattato da Truett et al. 38 . Tale metodo di estrazione rapida è sufficiente per identificare i potenziali fondatori, poiché i primers sono progettati per ibridizzare con il transgene (spesso integratiCome copie multiple). Al contrario, il targeting genico richiede un DNA genomico altamente purificato, in quanto il prodotto PCR comprende la regione genomica modificata.

Per il knockout gene, il metodo tradizionale di iniezione di un singolo sgRNA genera piccole delezioni (indels) o inserzioni, eliminando il gene di interesse 12 . Queste piccole modifiche sono difficili da identificare e richiedono spesso clonazione e sequenziamento indipendenti dalla ligasi, che richiedono molto tempo per confermare la natura di queste mutazioni.

In questo protocollo abbiamo approfittato del multiplexing CRISPR per sviluppare la co-iniezione sistematica di due sgRNA che comprendono il codone iniziale di un gene di interesse. Questo non solo aumenta la probabilità di eliminazione di un gene, ma anche l'escissione di un pezzo di DNA genomico di una dimensione predefinita (100-300 bp), permettendo la facile identificazione dei fondatori mediante semplici PCR. Da notare, i cuccioli che non hanno la genomica attesa eLa xcision potrebbe ancora essere analizzata per piccole mutazioni frameshift, quando solo un sgRNA si dimostrò attivo. Allo stesso modo, nel caso di editing genico, la co-iniezione sistematica di due sgRNA sovrapposti in direzioni opposte dovrebbe aumentare l'efficienza di HDR, in quanto i meccanismi di riparazione delle celle preferiscono utilizzare uno dei due filamenti 39 .

Applicazioni future

Il presente protocollo approfitta degli sviluppi più recenti nell'embrione del topo e nel targeting del gene 40 per semplificare e semplificare il processo di generazione di vari modelli sofisticati del topo delle condizioni umane. Questi modelli svolgono un ruolo fondamentale per contribuire a sviluppare la nostra comprensione dei pathomechanisms, contribuendo in ultima analisi allo sviluppo di strategie terapeutiche 2 . L'ottimizzazione e la razionalizzazione dei reagenti necessari per il targeting genico o l'integrazione casuale sono ampiamente e facilmente applicabiliLe a qualsiasi altra specie di mammiferi, come ratti, conigli, e anche ad animali di grandi dimensioni come il bestiame.

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Disclosures

Gli autori forniscono servizi accademici di transgenesis nei topi attraverso l'Università del Nuovo Galles del Sud Mark Wainwright Analytical Center.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il personale della struttura animale (BRC) per il loro sostegno continuo. Questo lavoro è stato finanziato dal National Health and Medical Research Council e dal Australian Research Council.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Micropipette 0.1-2.5 μL Eppendorf 4920000016
Micropipette 2 - 20 μL Eppendorf 4920000040
Micropipette 20 - 200 μL Eppendorf 4920000067
Micropipette 100 - 1,000 μL Eppendorf 4920000083
Molecular weight marker  Bioline BIO-33025 HyperLadder 1 kb
Molecular weight marker  Bioline BIO-33056 HyperLadder 100 bp
Agarose Bioline BIO-41025
EDTA buffer Sigma-Aldrich 93296 10x - Dilute to 1x
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific 15585011
SYBR Safe gel stain Invitrogen S33102
Gel extraction kit Qiagen 28706
PCR purification kit (Qiaquick) Qiagen 28106
Vacuum system (Manifold) Promega A7231
Nuclease-free microinjection buffer  Millipore MR-095-10F
Ultrafree-MC microcentrifuge filter  Millipore UFC30GV00
Cas9 mRNA Sigma-Aldrich CAS9MRNA
CRISPR expressing plasmid (px330) Addgene 42230
Nuclease free water Sigma-Aldrich W4502
Phusion polymerase New England Biolabs M0530L
T7 Quick High Yield RNA kit New England Biolabs E2050S
RNA purification spin columns (NucAway) Thermo Fisher Scientific AM10070
ssOligos Sigma-Aldrich OLIGO STANDARD
Donor plasmid Thermo Fisher Scientific GeneArt
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884
KSOMaa embryo culture medium Zenith Biotech  ZEKS-100
Mineral oil Zenith Biotech  ZSCO-100
M2 Medium Sigma-Aldrich M7167
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762
Mouthpiece Sigma-Aldrich A5177
Glass microcapillaries Sutter Instrument BF100-78-10
Proteinase K Applichem A3830.0100
Dumont #5 forceps Fine Science Tools  91150-20
Iris scissors Fine Science Tools  91460-11
Vessel clamp Fine Science Tools  18374-43
Wound clips  Fine Science Tools  12040-01
Clips applier  Fine Science Tools  12018-12
Micro-scissors  Fine Science Tools  15000-03
Cauterizer Fine Science Tools  18000-00
Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0) Ethicon 1691H
5% CO2 incubator MG Scientific Galaxy 14S
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000c
Thermocycler Eppendorf 6321 000.515
Electrophoresis set up BioRad 1640300
UV Transilluminator BioRad 1708110EDU
Thermocycler Eppendorf 6334000069
Stereoscopic microscope Olympus SZX7
Inverted microscope Olympus IX71
2x Micromanipulators Eppendorf 5188000.012
Oocytes manipulator Eppendorf 5176000.025
Microinjector (Femtojet) Eppendorf 5247000.013
Mice C57BL/6J strain Australian BioResources C57BL/6JAusb 

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References

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Biologia dello sviluppo Numero 124 Mouse microinjection pronucleare citoplasmatico CRISPR transgenico editing del genoma ovociti
Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes
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Delerue, F., Ittner, L. M. Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes. J. Vis. Exp. (124), e55765, doi:10.3791/55765 (2017).

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