Summary
Deze studie demonstreert de techniek om een minimaal invasieve en gemakkelijk reproduceerbaar model van ruggegraat-ischemie bij ratten te maken. Verschillende graden van motortekort van achterste ledematen kunnen worden geproduceerd door de aorta-occlusietijd te regelen.
Abstract
Ruggenmerg ischemie is een fatale complicatie na thoracabdominale aorta aneurysma operatie. Onderzoekers kunnen de strategieën voor het voorkomen en behandelen van deze complicatie onderzoeken met behulp van experimentele modellen van ruggenmerg ischemie. Het hier beschreven model demonstreert wisselende graden van paraplegie die betrekking hebben op de lengte van de okklusie na thoracale aorta-occlusie in een rattenwervel-ischemie-model.
Een 2-Fr. Ballonvormige katheter werd door de femorale slagader naar de aflopende thoracale aorta gevorderd totdat de katheterpunt in de linker subclaviale slagader in verdovende mannelijke Sprague-Dawley ratten werd geplaatst. Wervelkalk ischemie werd geïnduceerd door de katheterballon op te blazen. Na een bepaalde periode van occlusie (9, 10 of 11 minuten) werd de ballon ontlucht. Neurologische beoordeling werd uitgevoerd op 24 uur na de operatie met behulp van de motorstekortindex en het ruggenmerg werd geoogst voor histopathologisch onderzoek.
Ratten die 9 minuten aorta-occlusie hebben ondergaan, vertoonden milde en omkeerbare motorische aandoening in het achterste ledemaat. Ratten onderworpen aan 10 minuten aorta-occlusie, gepresenteerd met matige maar reversibele motorische aandoening. Ratten onderworpen aan 11 minuten aorta-occlusie bleken compleet en aanhoudend Verlamming. De motorneuronen in de ruggenmertsecties werden meer bewaard bij ratten onderworpen aan een kortere duur van aorta-occlusie.Onderzoekers kunnen een reproduceerbaar achterlipmotor tekort bereiken door thoracale aorta-occlusie met dit ruggenmerg-ischemie-model.
Introduction
Paraplegie is een fatale complicatie van thoracoabdominale aorta aneurysma operatie. Het komt door het letsel van het ruggenmerg-ischemie-reperfusie dat optreedt tijdens het kruisklampen en ontgrendelen van de aorta. 1 Verschillende strategieën, waaronder systemische hypothermie en cerebrospinale drainage, zijn ingevoerd om het ruggenmerg te beschermen, 2 , 3 , 4, maar veel patiënten blijven door het letsel aangetast.
Verscheidene dierlijke ruggengraat ischemie modellen zijn geïntroduceerd om haar pathogenese te onderzoeken en beschermende strategieën te ontwikkelen tegen het letsel. In het huidige onderzoek schetsen we een ratmodel van het ruggenmerg ischemie op basis van de methode van Taira en Marsala. 5 Het ruggengraatcirculatiesysteem bij ratten is zeer vergelijkbaar met het ruggenmerg- en collaterale systeem bij mensen, hoewel er een aantal verschillen zijn in de grootte enplaats. 6 , 7 Dus, een rat is een anatomisch geschikt dier om te gebruiken voor een experimenteel model dat de pathogenese, complicaties en behandeling van ruggenmerg ischemie onderzoekt. Bovendien produceert dit ruggenmerg-ischemie-model betrouwbare aorta-occlusie met minimale interventie door gebruik te maken van een intravasculaire ballon-occlusie van de thoracale aorta.
In deze studie hebben we aangetoond dat dit ratmodel van ruggenmerg-ischemie reproduceerbare motorische tekorten in de achterste ledematen veroorzaakt die variëren naar gelang van de aorta-occlusietijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol is goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van het Seoul National University Bundang Hospital. Dierenzorg en experimenten werden uitgevoerd volgens de Verenigde Naties National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren.
1. Chirurgische voorbereiding
- Vóór de operatie de katheters spoelen met steriele zoutoplossing om de patiënt te garanderen.
- Zet een verwarmingsdeken op de werktafel en bedek de tafel met een steriele drapering.
- Plaats Mannelijke Sprague-Dawley ratten (270-330 g) in een acryl doos met 3,0% -4,0% isofluraan in 100% zuurstof.
- Breng smeermiddel aan op de ogen van de rat.
- Plaats de rat op de werktafel in de rugpositie en houd de anesthesie onder gebruik van een gezichtsmasker met continue toediening van inhalatie isofluraan (1,0% -2,5 vol.%).
- Plaats een rectale sonde om de lichaamstemperatuur tussen 37,0-38,0 ° C te bewaken en te onderhouden.
2. Femoral Artery Catheterization
- Schud het juiste inguinsgebied met Betadine en 70% ethanol.
- Maak een 2 cm lange horizontale huidinsnijding met behulp van een schaar op het rechter ingewanden.
- Gebruik een retractor, laat het chirurgische veld bloot.
- Dissect de femorale slagader uit de omliggende ader en zenuw. Isoleer een 1 cm-sectie van de slagader met behulp van gebogen tang en stompe tang.
- Met een 4.0 zwarte zijde hechting, plaats een losse band op zowel de proximale als distale uiteinden van de slagader om de blootstelling te maximaliseren.
- Maak een incisie op de femorale slagader met behulp van micro-schaar.
- Plaats een 2-Fr. Ballonvormige katheter in de femorale slagader met behulp van micro-tang. Bevestig de katheter op het vat ongeveer 1 cm van de katheterkop met de proximale ligatuur, en bind de distale ligatuur dan aan.
3. Carotide Arterie Catheterisatie
- Schrob de rechter voorste nek met behulp van betadIne en 70% ethanol, en maak dan een huidinsnijding.
- Gebruik een retractor, laat het chirurgische veld bloot. Isoleer een 1 cm-sectie van de slagader en bind het losjes met een zijden hechting op zowel de proximale als de distale uiteinden van de slagader om de blootstelling te maximaliseren.
- Punctureer de halsslagader door gebruik te maken van een 24 G intraveneuze katheter en verplaats de proximale 1 cm van de katheter naar het hart.
- Bevestig de katheter met de proximale ligatuur en bind de distale ligatuur dan.
- Verbind het distale uiteinde van de katheter met de zoutopvulde microbuis en het externe reservoir met een 3-weg stopcock.
4. Tart Artery Catheterization
- Scrub het ventrale gebied van de staart met behulp van betadine en 70% ethanol, en maak een 2 cm snede van de huid.
- Dissecteer de staartartier uit de omliggende structuren en isoleer een 1 cm-sectie van de slagader met behulp van gebogen tang en stompe tang.
- Gebruik een 4.0 zwarte zijde hechting, plaats een losseBind aan zowel de proximale als distale uiteinden van de slagader om de blootstelling te maximaliseren.
- Punctureer de staartartier met behulp van een 24 G intraveneuze katheter, en verplaats de katheter naar de slagader.
- Bevestig de katheter aan het vat (ongeveer 1 cm van de katheterkop) met de proximale ligatuur en bind de distale ligatuur.
- Sluit het distale gedeelte van de katheter aan op de arteriële drukmonitor.
5. Inductie van wervelkolom ischemie
- Nadat de katheterisatie is voltooid, verplaats de 2 Fr. Ballonvormige katheter in de aflopende thoracale aorta zodat de punt van de katheter de linker subclavische slagader bereikt.
- Plaats een diepte van 10 cm vanaf de insertieplaats.
- Spuit 150 eenheden heparine in een concentratie van 100 eenheden / ml in de carotidkatheter.
- Blader de katheterballon met 0,05 ml zoutoplossing.
- Trek tegelijkertijd het bloed in de externe bloedhouder uit de cHartslagader om de proximale arteriële druk te regelen op 80 mmHg.
- Verbind het arteriële drukbewakingssysteem met het resterende lumen van de 3-voudige stopkraan en controleer de hoeveelheid bloedafvoer bij het controleren van de arteriële druk.
- Bevestig het succes van aorta-occlusie door een abrupte afname en continu verlies van distale arteriële druk.
- Na aorta-occlusie van 9, 10 of 11 minuten, ontlucht de Fogarty-katheterballon en reinig het gedreineerde bloed.
6. Post-chirurgische zorg en neurologische beoordeling
- Terwijl de arteriële druk door de staartslagader wordt gecontroleerd, verwijder de katheters van de femorale en halsslagaders en sluit de wonden met zijden hechten.
- Nadat u heeft bevestigd dat de arteriële druk wordt hersteld naar het normale bereik, verwijder u de katheter van de staartartier en sluit u de wond.
- Na herstel van de verdoving, ga de rat terug naar zijn kooi.
- Beoordelen hiNa een operatie met behulp van de motorstekortindex ( tabel 1 ). De motorstekortindex wordt gedefinieerd als de som van de ambulatietelling en de plaatsing / stepping reflex score. Een motorstekortindex van 6 duidt op het maximale tekort.
7. Histopathologische evaluatie
- Na de neurologische beoordeling anesthetiseren ratten met masker-afgeleverd isofluraan, offer ze door transcardiale perfusie met 100 ml gehardiniseerde zoutoplossing onder verdoving, en extract het ruggenmerg. 8
- Breng de snoer secties van het niveau van de lumbale wervels 3-5 in paraffine in.
- Vlek dwarsdoorsneden met hematoxyline en eosine (H & E).
- Let op de motor neuron letsel onder een microscoop. 9
8. Statistische analyse
- Voer statistische analyse uit met behulp van Statistisch pakket voor de Social Sciences versie 20. De motor defIcit index van de drie groepen werd vergeleken met de Kruskal-Wallis test, gevolgd door een Mann-Whitney U- test. Een P- waarde <0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdens een periode van ruggengraat ischemie werd aorta-occlusie uitgevoerd gedurende 9 minuten (n = 3), 10 minuten (n = 3) of 11 minuten (n = 3). De tekortindex van de motor in ratten wordt weergegeven in tabel 2. Ratten die 9 minuten aorta-occlusie hebben ondergaan, lieten een milde en omkeerbare motorstoornissen zien in het achterste ledemaat. Ratten onderworpen aan 10 minuten aorta-occlusie, met een matig motortekort, maar niet volledige verlamming. Ratten die 11 minuten van de occlusietijd hebben ondergaan, vertoonden volledige en aanhoudende verlamming.
Representatieve foto's van ruggengraat secties gekleurd met H & E worden getoond in Figuur 1 . De motorische neuronen in de ruggengraat secties werden meer bewaard bij ratten onderworpen aan een kortere duur van aorta-occlusie.
Figuur 1 . Histologisch examenInatie van ruggengraat secties
De motorische neuronen werden meer bewaard bij ratten onderworpen aan een kortere duur van aorta-occlusie (oorspronkelijke vergroting, 200x). Schaalbalk in alle afbeeldingen = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Ambulatie (lopen met de onderste ledematen) | Plaatsen / stappenreflex |
| 0: normale (symmetrische en gecoördineerde ambulatie) | 0: normaal |
| 1: tenen plat onder het lichaam wanneer lopen maar ataxia aanwezig | 1: zwak |
| 2: Knockle-walking | 2: geen stap |
| 3: beweging in de onderste ledematen, maar niet in staat om te lopen | |
| 4: geen beweging, sleept de onderste ledematen |
Tabel 1. Evaluatie van Ambulatie en het Placing / Stepping Reflex.
| Aortische occlusietijd | 24 uur na de operatie |
| 9 min (n = 3) | 2 (2 - 3) |
| 10 minuten (n = 3) | 4 (4 - 4) |
| 11 minuten (n = 3) | 5 (5 - 6) |
Tabel 2. Motorindexindex. Waarden worden gepresenteerd als mediaan (interkwartielbereik).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de huidige studie hebben we een ratmodel van het ruggenmerg-ischemie op basis van methode 5 van Taira en Marsala aangetoond die variabele graden van motortekort in het achterste led veroorzaakt afhankelijk van de aorta-occlusietijd.
De lengte van aorta-occlusie kan de mate van motortekort beïnvloeden. Als de aorta-occlusietijd langer is, wordt het motortekort ernstiger. Zo kunnen onderzoekers een bepaalde mate van motortekort bereiken door de aorta-occlusietijd in dit model te controleren.
Ons model omvat de ligatie van de gemeenschappelijke halsslagader en de femorale slagader, en de mogelijkheid van neurologische tekorten als gevolg van de ligatie van deze bloedvaten is een mogelijke zorg. Ratten hebben echter efficiënte collateral netwerk systemen. Wanneer de halsslagader of de femorale slagader geligeerd is, kan voldoende bloedstroom door het uitgebreide beveiligingsnetwerk worden verschaft. Unilaterale caroti D arteriële occlusie wordt gerapporteerd om slechts kleine effecten op cerebrale bloedstroom te produceren. 10 , 11 Hoewel de eenzijdige occlusie van een halsslagader in een ratten kan leiden, komt dit alleen voor bij combinatie met ernstige systemische hypoxie. 12 Tijdens ons experiment vond geen systemische hypoxie plaats en werd geen van de ratten gepresenteerd met neurologische tekorten die suggereert van cerebraal infarct. Bovendien, wanneer de femorale slagader van ratten geligeerd is, zorgt de collaterale circulatie voor voldoende bloedstroom naar de achterste ledematen. 13 Deze collaterale circulatie zorgt voor voldoende bloedstroom naar de spieren van de achterste ledematen wanneer ze rustig zijn, maar geven geen voldoende stroom tijdens de oefening. 14
Bovendien beïnvloedt de proximale arteriële druk tijdens het ruggenmerg-ischemie de ontwikkeling van motorische tekorten. Volgens een eerdere studie,Ref "> 5 bleef de collaterale bloedvoorziening bijna verdwenen bij de proximale arteriële druk van 40 mmHg tijdens aorta-klemmen in een rat-spin-ischemie-model. Zo bleven de proximale arteriële druk bij 40 mmHg tijdens de ruggengraat-ischemie in hun ruggengraatmodellen koord ischemie. 9, 15, 16 echter in dit protocol, behielden we de proximale arteriële druk bij 80 mmHg tijdens afsluiten van de aorta omdat het aanbeveling de gemiddelde arteriële druk bij 80 mmHg of hoger te handhaven voor het conserveren adequate ruggenmerg perfusie tijdens ruggenmerg Ischemie in de klinische praktijk, 17 hoewel er een verschil kan zijn in wat een voldoende proximale arteriële druk tussen mensen en knaagdieren vormt.
De ruggengraatvasculatuur en het onderpandstelsel van ratten en mensen zijn vergelijkbaar, 6 , 7 die ratten een geschikte keuze maakt voor een experimenteel ruggenmerg ischemie model. Er mag echter niet worden uitgegaan dat de resultaten verschillend kunnen zijn naargelang de soorten waarin het ruggenmerg ischemie optreedt.
Concluderend kunnen onderzoekers dit ratmodel van ruggenmerg ischemie gemakkelijk aannemen en zeer reproduceerbare bevindingen bereiken. Bovendien kunnen ze de aorta-occlusietijd wijzigen om de mate van gemotoriseerde tekort te variëren. Als zodanig kan dit model verder onderzoeken naar de onderliggende pathofysiologie van neurologische complicaties na thoracabdominale aorta-aneurysma, en de ontwikkeling van neuroprotectieve strategieën tegen deze complicaties mogelijk maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen. Dit werk werd ondersteund door toekenning 2012R1A1A3014010 van de National Research Foundation van de Koreaanse regering.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen erkenningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fogarty Arterial Embolectomy catheter | Edward Life Sciences | 120602F | a balloon-tipped catheter inserted into the femoral artery |
| BD Insyte-N Autoguard Shielded IV catheter | BD | 381411 | 24-gauge intravenous catheter |
| 50 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 50mL | Facial mask |
| 1 mL syringe | KOREA VACCINE | KOVAX-SYRINGE 1ml | |
| Recal probe | HARVARD APPARATUS | 50-7221F | Rectal probe for temperature monitoring |
| Micro dissecting spring scissor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-10 | Micro-scissor |
| SCISSOR (SHARP-SHARP) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-51-12-S | Scissors |
| Retractor | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-74A | Retractor |
| Micro forcep | Jeung do bio & Plant co.LTD. | JD-S-29 | Micro-forceps |
| MOSQUITO FORCEP (Curved) | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-44-CPK | Curved forceps |
| DRESSING FORCEP | Jeung do bio & Plant co.LTD. | S-37-16S | Blunted forceps |
| 4/0 black silk | Woori Medical | S431 | 4.0 black silk suture |
| 3-WAY STOCK | Seonwon Medcal | D-98-01 | 3-way stopcock |
| Patient monitor | PHILIPS | MP20 | The arterial pressure monitoring device. |
| Heating blanket | Self production | Heating blanket | |
| Microtube and external reservoir | Self production | Microtube and external reservoir | |
| Heparin | JW Pharmaceutical | Heparin | |
| 0.9% NS 1000ml | JW Pharmaceutical | Normal saline | |
| Isoflurane | Hana Med | Isoflurane |
References
- Greenberg, R. K., et al. Contemporary analysis of descending thoracic and thoracoabdominal aneurysm repair: a comparison of endovascular and open techniques. Circulation. 118 (8), 808-817 (2008).
- Okita, Y. Fighting spinal cord complication during surgery for thoracoabdominal aortic disease. Gen Thorac Cardiovasc Surg. 59 (2), 79-90 (2011).
- Fleck, T. M., et al. Improved outcome in thoracoabdominal aortic aneurysm repair: the role of cerebrospinal fluid drainage. Neurocrit Care. 2 (1), 11-16 (2005).
- Kouchoukos, N. T., et al. Hypothermic bypass and circulatory arrest for operations on the descending thoracic and thoracoabdominal aorta. Ann Thorac Surg. 60 (1), 67-76 (1995).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Tveten, L. Spinal cord vascularity. III. The spinal cord arteries in man. Acta Radiol Diagn (Stockh). 17 (3), 257-273 (1976).
- Woollam, D. H., Millen, J. W. The arterial supply of the spinal cord and its significance. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 18 (2), 97-102 (1955).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Umehara, S., Goyagi, T., Nishikawa, T., Tobe, Y., Masaki, Y. Esmolol and landiolol, selective β1 adrenoreceptor antagonists, provide neuroprotection against spinal cord ischemia and reperfusion in rats. Anesth Analg. 110 (4), 1133-1137 (2010).
- De Ley, G., Nshimyumuremyi, J. B., Leusen, I. Hemispheric blood flow in the rat after unilateral common carotid occlusion: evolution with time. Stroke. 16 (1), 69-73 (1985).
- Coyle, P., Panzenbeck, M. J. Collateral development after carotid artery occlusion in Fischer 344 rats. Stroke. 21 (2), 316-321 (1990).
- Levine, S.
- Prior, B. M., et al. Time course of changes in collateral blood flow and isolated vessel size and gene expression after femoral artery occlusion in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2434-H2447 (2004).
- Yang, H. T., Feng, Y., Allen, L. A., Protter, A., Terjung, R. L. Efficacy and specificity of bFGFincreased collateral flow in experimental peripheral arterial insufficiency. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (6), H1966-H1973 (2000).
- Kakinohana, M., Fuchigami, T., Nakamura, S., Sasara, T., Kawabata, T., Sugahara, K. Intrathecal administration of morphine, but not small dose, induced spastic paraparesis after a noninjurious interval of aortic occlusion in rats. Anesth Analg. 96 (3), 769-775 (2003).
- Horiuchi, T., et al. The effects of the delta-opioid agonist SNC80 on hind-limb motor function and neuronal injury after spinal cord ischemia in rats. Anesth Analg. 99 (1), 235-240 (2004).
- Griepp, R. B., Griepp, E. B. Spinal cord perfusion and protection during descending thoracic and thoracoabdominal aortic surgery: the collateral network concept. Ann Thorac Surg. 83 (2), S865-S869 (2007).
