Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ plugins

Summary

I dette papir beskrives to nye ImageJ plugins til 'Clock Scan' billedanalyse. Disse plugins udvider funktionaliteten af ​​det oprindelige Visual Basic 6-program og vigtigst af alt gør programmet tilgængeligt for et stort forskningsmiljø ved at kombinere det med ImageJ gratis billedanalyseprogrampakke.

Abstract

Ur-scanningsprotokollen til billedanalyse er et effektivt værktøj til at kvantificere den gennemsnitlige pixelintensitet inden for, ved grænsen og udenfor (baggrund) en lukket eller segmenteret konveksformet region af interesse, hvilket fører til dannelsen af ​​en gennemsnitlig integreret radial pixel- Intensitetsprofil. Denne protokol blev oprindeligt udviklet i 2006 som et visuelt grundlæggende 6-script, men som sådan havde det begrænset distribution. For at løse dette problem og for at deltage i lignende nylige bestræbelser fra andre konverterede vi den oprindelige urskanningsprotokolkode til to Java-baserede plugins kompatible med NIH-sponsorerede og frit tilgængelige billedanalyseprogrammer som ImageJ eller Fiji ImageJ. Desuden har disse plugins flere nye funktioner, der yderligere udvider kapaciteten i den oprindelige protokol, såsom analyse af flere regioner af interesse og billedstabler. Sidstnævnte træk ved programmet er især nyttigt i applikationer, hvor det er vigtigt at bestemme ændringer relateretTil tid og sted. Således kan urensøgningsanalysen af ​​stabler af biologiske billeder potentielt anvendes til spredning af Na ⁺ eller Ca ⁺⁺ inden for en enkelt celle, såvel som til analysen af ​​spredningsaktivitet ( f.eks . Ca ^++- bølger) i synaptisk populationer -forbundne eller mellemrumskoblede celler. Her beskriver vi disse nye ur-scan-plugins og viser nogle eksempler på deres applikationer i billedanalyse.

Introduction

Målet med dette arbejde er at præsentere en Clock Scan-protokol, der er platformfri og frit tilgængelig for enhver forsker, der er interesseret i denne type billedanalyse. Clock Scan-protokollen blev oprindeligt udviklet i 2006 ¹ med det formål at forbedre eksisterende metoder til pixelintensitets kvantificering inden for konvekse formede interesseområder (ROI), en metode, der har bedre integrationsevne og forbedret rumlig opløsning. Under overtagelsen samler protokollen sekventielt flere radiale pixelintensitetsprofiler, scannet fra ROI-centeret til dets grænse eller til en forudbestemt afstand uden for investeringsafkastet med det formål at måle pixelintensiteten "baggrund". Protokollen skalerer disse profiler i overensstemmelse med cellens radius målt i retning af scanningen. Således er afstanden fra midten til ROI-grænsen for hver enkelt radial scan altid 100% af X-skalaen. Endelig er programmet gennemsnitligt for disse personerAl profiler i en integreret radial pixel-intensitetsprofil. På grund af skalering afhænger den gennemsnitlige pixelintensitetsprofil, der produceres af "Clock Scan" -protokollen, hverken på ROI-størrelsen eller inden for rimelige grænser på ROI-formen. Denne metode giver mulighed for direkte sammenligning eller om nødvendigt gennemsnittet eller subtraktion af profiler af forskellige ROI'er. Protokollen tillader også korrektion af integral pixelintensitetsprofiler, af ethvert objekt til baggrundsstøj, ved simpel subtraktion af den gennemsnitlige intensitet af pixels placeret uden for objektet. Selv om det kun er blevet testet i biologiske prøver, giver vores protokol en værdifuld tilsætning til andre eksisterende billedanalyseværktøjer, der anvendes til undersøgelser af billeder af fysiske eller kemiske processer, der er arrangeret omkring et oprindelsessted (såsom diffusion af stoffer fra en punktkilde ) ¹ .

Hovedbegrænsningen af ​​den oprindelige billedanalysemetode var imidlertid, at protokollen var devFremkaldt som Visual Basic 6 (VB6) (kode og derfor var det platformafhængigt og vanskeligt at distribuere (kræver VB6). For at løse dette problem og tilslutte sig lignende nylige forsøg fra andre efterforskere ² konverterede vi VB6 Clock Scan Programkode til to Java-baserede plugins, kompatible med NIH-sponsorerede og frit tilgængelige open source og platform-uafhængige billedanalyseprogrammer, ImageJ ³ og Fiji ImageJ ^4. Desuden har disse plugins nu flere nye funktioner, der udvider kapaciteten Af den oprindelige protokol til at behandle flere ROI'er og billedstabler. Mange billedanalyseprogrammer er ikke brugervenlige med hensyn til udførelse af statistisk analyse af flere objekter, og derfor vises kun repræsentative data. Med multi-programmet Clock Scan ImageJ, Det er muligt at lette analysen af ​​flere genstande samtidigt. En robust statistisk vurdering af mikroskopi data,Med hensyn til signalintensitetsfordeling i enkeltceller / objekter er det nu muligt med denne pluginudvidelse. Her beskriver vi Clock Scan plugins og viser eksempler på deres applikationer i billedanalyse.

Protocol

1. Software Installation

1. Installer de nyeste versioner af bundtet Java og enten ImageJ eller Fiji ImageJ som anbefalet på de respektive websteder (se materialetabellen for links til de tilsvarende websteder). I nedenstående tekst benævnes begge programmer som "ImageJ".
2. Kopier "Clock_Scan-1.0.1. Jar" og "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" plugin-filer ved hjælp af linket, der findes i materialetabellen, og indsæt dem i ImageJ-pluginmappen. Alternativt kan du bruge menuen "Plugins | Install plugin" til at installere disse filer, når de er gemt på computerens harddisk.

2. Clock Scan analyse

1. Standard Clock Scan-plugin ( Figur 1 ):
   1. Brug menuen ImageJ "File | Open" til at åbne et billede af interesse.
   2. Klik på 'polygon'-værktøjet eller' segmenteret linjevalg 'Værktøj, og træk derefter på billedet for at skitsere hele investeringsafkastet eller et segment af denne region. Se Figur 1 A for et eksempel på polygonvalg (indvendig punkteret omrids).
      BEMÆRK: Andre valgværktøjer, der er tilgængelige i softwaren (rektangulært, ovalt og frie linjevalg), kan også bruges.
   3. Vælg "Plugins | Clock Scan" fra menuen for at åbne standard vinduet for skanningsprotokol popup-vindue. Bemærk, at denne kommando også åbner vinduet ROI Manager med omridsen, der automatisk tilføjes til den.
   4. Brug plugin-vinduet til at gøre følgende.
      1. Gennemgå og ændre X-og Y-koordinaterne for ROI-centret (automatisk beregnet som koordinater for det fysiske massecentrum) ved hjælp af rullepaneler eller ændring af værdierne i de tilsvarende indtastningsfelter. Se figur 1 B.
      2. Afhængigt af hvor meget baggrundsområdet uden for objektet skinnerUld være dækket af scanning, juster scanningsgrænserne ved hjælp af rullefeltet "Scan limit". Se figur 1 A.
         BEMÆRK: Scangrænse er det brøkdele, der repræsenterer, hvor langt scanningen skal gå ud over objektets grænse i en given retning; Standardværdien er 1,20, hvilket indikerer at scanningslængden vil være 20% længere end objektets radius i scanningsretningen; Se figur 1 A , yderst streget linje).
      3. Modificer udgangen af ​​plugin'et ved hjælp af "reel radius", "subtraher baggrund", "polar transformation" og / eller afkrydsningsfelterne "plot med standardafvigelse".
      4. Klik på "OK" for at køre plugin. Se figur 1 C-H .
         BEMÆRK: Eksempler på protokolets output med "plot med standardafvigelse" og "polar transformation" eller "reel radius" og "polar transfOrm "-valg er vist i henholdsvis Figur 1 C og 1D og Figur 1 E og 1F . Bemærk, at de beregnede standardafvigelser (SD) -værdier repræsenterer variationen mellem individuelle radiale pixelintensitetsscanning af objektet. Bemærk også" ROI-valg Længde "-linjen i plugin-vinduet, som viser oplysningerne på ROI-omridslængden målt i pixels.
   5. I den genererede "Clock Scan Profile Plot" bruger kommandoen "List" til at plotte værdier vist i to, X og Y kolonner af data for gråskala billeder og i X og fire Y kolonner af data for RGB billeder, hvoraf Y0, Y1, Y2 og Y3 kolonner vil blive fyldt med integrerede og individuelle (rød, grøn og blå) farvekanal pixel intensitetsværdier.
2. Flere ROI Clock Scan-plugin - der arbejder med flere investeringsafkast ( ):
   1. Åbn et billede, der indeholder flere afkast.
   2. Åbn ROI Manager ved at klikke på "Analyse | Værktøjer | ROI Manager".
   3. Sequentially outline (se trin 2.1.2) og tilføj hvert ROI til ROI Manager ved at klikke på "Add" i vinduet ROI Manager Gør dette for alle ROI'er i billedet. Brug kommandoen "Analysér | Mål", hvis ROI-beregninger er af interesse.
      1. Se Figur 2 A for et eksempel på flere segmenterede linjevalg og Figur 2 E for et eksempel på flere polygonvalg.
   4. Vælg "Multi Clock Scan" i menuen "Plugins" for at åbne popup-vinduet til protokolvalg.
   5. Brug protokollens valgfelt til at gøre følgende.
      1. Om nødvendigt skal du nulstille scanningsgrænsen som i trin 2.1.4.2; Standardværdien er 1,20.
      2. Vælg eventuelt optIon for at plotte middelkloks scanprofilen med SD-søjler ved at markere feltet "Plot with standard deviation". Se figur 2 C og D.
         BEMÆRK: De beregnede SD-værdier vil repræsentere variationen mellem integrerede ur-scanningsprofiler af forskellige objekter. Bemærk også linjen i plugin vinduet, der viser oplysninger om "antallet af udvalgte ROI'er".
      3. Klik på "OK" for at køre protokollen.
   6. I den genererede "Clock Scan Profile Plot" bruger kommandoen "List" til at plotte de værdier, der vises i vinduet "Plot Values". Se skærmbilledet "Multi Clock Scan Profile Plot" for kolonnebetegnelse efter farvekanal.
   7. Bemærk, at ROI'erne er nummererede, og deres klokkeoverskriftsprofiler for en given farvekanal er tegnet i samme rækkefølge, som ROI'erne blev skitseret og tilføjet til "ROI Manager".
3. MulTiple ROI Clock Scan plugin - arbejder med en billedstabel ( Figur 3 ):
   1. Åbn en billedstabel af interesse.
   2. Åbn ROI Manager ved at klikke på "Analyse | Værktøjer | ROI Manager".
   3. Beskriv ROI for billederne i stakken og tilføj det til ROI-manager som beskrevet i trin 2.1.2 og 2.2.3. Brug kommandoen "Analysér | Mål", hvis ROI-metrics er af interesse.
   4. Vælg "Multi Clock Scan" i menuen "Plugins" for at åbne popup-vinduet til protokolvalg.
   5. Brug protokollens valgfelt til at gøre følgende.
      1. Nulstil scanningsgrænsen som beskrevet i trin 2.1.4.2; Standardværdien er 1,20.
      2. Vælg indstillingen for at markere den gennemsnitlige urskanningsprofil med SD-søjler ved at markere feltet "Plot med standardafvigelse".
         BEMÆRK: De beregnede SD-værdier repræsenterer variation mellem forskellige forekomster af objektet valgt i billedet stack. Bemærk også linjen i plugin-vinduet, der viser oplysninger om "antal billeder i stakken".
      3. Klik på "OK" for at køre protokollen.
   6. Klik på "List" i vinduet "Clock Scan Profile Plot" for at plotte de værdier, der vises i vinduet "Plot Values", hvor Y-kolonnenummer repræsenterer billedpositionen i stakken - 1.

Representative Results

De billeder, der bruges her til illustration formål, er taget fra databaser oprettet under vores tidligere celle og vævsbiologiske undersøgelser ^{5 , 6 , 7} og fra Allen Mouse Brain Atlas ⁸ . Begge plugins blev testet korrekt ved hjælp af ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 og Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 programmiljø.

Figur 1 viser repræsentative resultater af billedanalyse med et standard Clock Scan-plugin. For begge plugins er den grundlæggende kode og de vigtigste trin i ur-scanningsproceduren i det væsentlige den samme som beskrevet i den oprindelige protokol ¹ . Kort efter beskrives ROI eller et segment af ROI på billedet ( Figur 1 A , indvendig gul omrids) og et centrum af omridset bestemmes (automatisk eller manuelt ved hjælp af pluginoptionsvinduet, Figur 1 B ) starter den radiale scanning af pixelintensitet i en retning fra midten til den første pixel af Celleoversigt og fortsætter med uret pixel-for-pixel langs omridset (henholdsvis figur 1 A ; henholdsvis lige vektor og buet pil), indtil alle ROI-radierne er scannet. For at kvantificere ROI baggrundsintensiteten kan længden af ​​hver radial scan indstilles til at overstige ROI'ens radius i retning af scanningen med et forudindstillet fraktionstal (0,2 eller 20% af radiusen som standard for Clock Scan-pluginets værdi , Den ydre gule linje i figur 1 A ). Indsamlede radiale profiler justeres derefter ved skalering til de tilsvarende radii og i gennemsnit for at frembringe integral ur scanningsintensitetsprofilen i 256 intensitetsniveauer af gråskalaenheder ( figur 1 C ). For RGB-billeder producerer begge plugins automatisk uafhængige integrerede radiale pixelintensitetsprofiler for hver farvekanal (256 intensitetsniveauer af røde, grønne og blå farver) udover en kombineret farveprofil.

Som standard repræsenterer x-skalaen for urets scannings pixelintensitetsprofil normaliseret ROI-radius med 100% af skalaen, der repræsenterer pixels, der ligger ved grænsen for ROI ( figur 1 C ). Profilen vist i figur 1 C blev genereret med valgmuligheden "plot med standardafvigelse" valgt, og derfor viser grafen også SD'en beregnet for hvert datapunkt langs profilens X-skala. Når valgmuligheden "subtract background" er valgt, korrigeres hele intensitetsprofilen for baggrunds nrIse ved punkt-for-punkt-subtraktion af den gennemsnitlige intensitet af pixels placeret mellem ROI-grænsen og grænsen for scanningsgrænse (den ydre gule linje i figur 1A; data ikke vist). Hvis "Polar Transformation" er valgt, genererer Clock Scan plugin et ekstra output vindue. Den indeholder en polær transformation af billedet af det valgte område, herunder scanningsgrænseområdet, hvor billedet er modificeret i hver radial scanningsretning på en sådan måde, at afstanden fra midten til grænsen af ​​objekterne altid normaliseres til 100 % Og repræsenteret med 100 pixel. Uanset objektets faktiske størrelse er de vertikale og vandrette dimensioner af dets polære transformationsbillede to gange scanningsgrænsen i pixels (240 pixels x 240 pixels i eksemplet vist i Figur 1 D ). Endelig vil valg af "real radius" -optionen resultere i genereringen af ​​kloksøgningen prOfile og et polært transformationsbillede, skaleret pr. Objektets faktiske middelradius og i enhederne for rumlig kalibrering af det originale billede (henholdsvis fig. 1E og F ).

Figur 1G og H illustrerer yderligere billedanalysemuligheder ved hjælp af objektstørrelses- og formuafhængig polartransformation og de integrerede ImageJ-kommandoer og værktøjer. Eksempler på kommandoer, som kan betragtes som nyttige til bestemte typer billedanalyser, er kommandoen segmenteret linieværktøj og "Analysér | Plotprofil" ( Figur 1 G ) og "Analysér | Overfladeplot" -kommandoen ( Figur 1 H ).

Figur 2 og 3 viser repræsentative resultater af billedanalyse med Multi Clock Scan plugin. Udgangen afMultiklip scan plugin består af to grafer: Den første graf viser individuelle ur scanningsprofiler for de valgte objekter ( Figur 2 C ), og den anden graf viser middelværdien af ​​disse individuelle ur scanningsprofiler (± SD, valgfri; Figur 2 D ) . For RGB-billeder ( Figur 2 E ) vises også klokskanneprofilen beregnet for hver enkelt farvekanal for hver valgt ROI ( figur 2 F ), og gennemsnittet beregnes inden for en given kanal for alle valgte objekter ( figur 2 G ) . På samme måde vises de individuelle og gennemsnitlige urskanningsprofiler for objekter i billedstakken efter at have udført klokkens scanningsanalyse af stakken ( Figur 3A-3D , den gennemsnitlige urskanningsprofil vises ikke). Som nævnt før, den numeriskeAl data bruges til at generere disse plots ved at udføre plot "List" kommandoen.

Figur 4 illustrerer en yderligere anvendelse af den polære transformeringsmulighed i Clock Scan-pluginet: dets egnethed til billedregistrering og overlejringsoperationer. I denne figur blev ROI-størrelses- og formuafhængige polære transformationer anvendt til at sammenligne fordelingen af ​​fluorescensmærkning af neuroner, der udtrykker a3 natrium / kalium-ATPase-pumpe mellem forskellige musekortikale regioner, med atlasbilledet, der viser grænserne og den anatomiske organisering af Disse regioner ( fig. 4A-4B ). Med en clock-scanningsprotokol er referencens registrering (atlas) og de faktiske billeder, der kræves til en sådan sammenligning, begrænset til en simpel procedure til justering af billederne, der beskriver strukturen af ​​interesse for begge billeder og derefter genererer ROI-størrelse og form- Uafhængige polære transformationer.I eksemplet vist i figur 4 demonstrerer en sammenligning af polære transformationer klart en ikke-ensartet fordeling af mærkede celler i hjernecortexen i musen, hvor deres tæthed er specifikt høj i overfladiske områder af lag 2/3 af motorcortexen, dorsaldelen Af den agranulære økulære cortex, den laterale orbitale cortex og i dybe lag af motorcortexen ( fig. 4C-4D ).

Figur 1 : Repræsentativt eksempel på anvendelse af Clock Scan Plugin til billedanalyse. ( A ) Fluorescerende lysbillede af en del af en rotte-dorsalrotganglion immunostainet for a3-isoformen af ​​Na + / K + -ATPasen (a3 NKA, se Schneider et al. ³ for detaljerne om vævsbehandling og farvning).En af neuronprofilerne, med sin grænse tungt mærket for α3 NKA (hvid), er skitseret ved hjælp af et polygonlinjeværktøj (indre gule linje). Radiale scan (hvide pil) grænser (yderste gule linje) blev sat til 120% af objektradiusen, fra objektets center (hvid prik) til den første pixel af omridset, som vist i panel B (scanningsgrænsefladestang). ( B ) Skærmbillede af hovedvinduet i Clock Scan-plugin. ( C ) Plot af integreret pixelintensitetsprofil for cellen vist i panel A (middelværdi af 706 radiale scanningsprofiler, se konturlængde i B; lodrette stænger er SD-søjler). ( D ) - Polar transformationsbillede af den studerede celleprofil. ( E ) Ur-scan-profil af den samme celle opnået med den valgte "reelle radius" indstilling. Bemærk, at i modsætning til profilen vist i C viser x-skalaen for denne profil reelle rumlige kalibreringsenheder (μm). ( F ) Polær transformation af den samme celle opnået med Valgmuligheden "rigtig radius" valgt. Bemærk, at skalaen af ​​denne transformation nu er i reelle rumlige kalibreringsenheder (μm). ( G ) Grænsen for den polære transformation, der er vist i D, blev skitseret ved hjælp af det segmenterede linieværktøj (linjetykkelsen blev sat til 10 pixels eller 10% radial scanningslængde) og analyseret. Kommandoen "Analysér | Plotprofil" blev udført for at måle ændringerne i den gennemsnitlige mærkeintensitet langs objektets grænse (hvert datapunkt i grafen repræsenterer den gennemsnitlige intensitet af alle pixler på tværs af valglinjens bredde). ( H ) Kommandoen "Analyse | Overfladeplot" blev påført det polære transformationsbillede vist i panel D for at skabe 3-D-repræsentation af objektets mærkeintensitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

E 2 "class =" xfigimg "src =" / filer / ftp_upload / 55819 / 55819fig2.jpg "/>
Figur 2 : Repræsentativt eksempel Anvendelse af brug af Multi Clock Scan Plugin til billedanalyse. ( A ) Fire synsfelt blev indfanget inden for sektionen af ​​rotte dorsal rodganglion immunostained for α3 NKA (se figur 1 En legende). For at forenkle brugen af ​​multi-clock scan plugin, blev disse billeder anbragt i en stak og derefter konverteret til et enkelt billede ved hjælp af "Image | Stacks | Make Montage" kommandoen. Røde linjer og tal angiver en segmenteret linjevalg af fem områder af interesse i dette billede. ( B ) Et skærmbillede af vinduet Multi Clock Scan vises, når plugin bruges til at analysere et gråskala billede. ( C ) Individuelle klokkescanningsprofiler med fem ROI'er 'vist i panel A. ( D ) Gennemsnitlig klokkescanningsprofil for udvalgte ROI'er (panelA) med SD-barer (valgmulighed "plot med standardafvigelse" valgt). ( E ) RGB-billede af dyrkede mus-preBI-lymfocytter mærket med 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, nuklear plet, blå) og med fluorescensmærkede antistoffer for β1-integrin (grøn) og F-actin Se Dobretsov et al. ⁷ for cellekultursteknikken og Yuryev et al. ¹¹ til farvningsdetalier). Elleve celler (se nummeretiketter) blev skitseret ved hjælp af ImageJ-polygonevalgværktøjet. Paneler til højre viser grøn og rød kanal visning af cellen # 7 (rektangulært valg på venstre panel), efter at menuen "Image | Color | Split Channels" blev udført. ( F ) Individuelle celleurskanningsprofiler (sammensatte og røde, grønne og blå farvekanalprofiler vises henholdsvis med henholdsvis sorte, røde, grønne og blå linjer). ( G ) Middelklokke-scanprofiler for alle elleve investeringsafkast, der er valgt i paneletE. Farvebetegnelser som i panel G (ingen plot med standardafvigelsesindstilling blev brugt under Multi Clock Scan-proceduren). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3 : Multi Clock Scan Plugin og analyse af billedstabler. ( A ) Montage af udvalgte og "gemt som stak" billedrammer. Et billede af en dorsal rod ganglion neuron fanget med differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi er vist i den første ramme. Efterfølgende rammer blev erhvervet under anvendelse af epi-belysningsfluorescensmikroskopi til overvågning af intracellulær calciumkoncentration ved forskellige tidsintervaller før og efter elektrisk stimulering af cellen. Numre ved siden af ​​respektivE billede angiver tid i ms ⁶ . Cellens grænse blev skitseret ved hjælp af DIC-billedet af stakken (øverste venstre ramme; asterisk angiver patch-clamp-pipetten anvendt til optagelse og påfyldning af cellen med det calcium-følsomme farvestof Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1) ), Og derefter bruges til at køre Multi Clock Scan-proceduren på de resterende billeder. ( B ) Skærmbillede af Multi Clock Scan vindue, når programmet køres på en stak af billeder. ( C ) Ur-scanprofiler af OGB-1 fluorescerende signal på forskellige afstande fra cellecentret (% af radius) og på forskellige tidspunkter før og efter elektrisk stimulering (legenden i ms). For at forberede disse grafer blev professionel grafiksoftware brugt. ( D ) Ændringer i intensiteten af ​​OGB-1 signalet med tiden i sub-membran og dybere cytoplasmatiske celleområder (henholdsvis røde og sorte cirkler og linjer). For at opnå disse data blev gennemsnittet og SD beregnet for hvert datapunktlokatEd mellem 20-40% og 70-90% af x-skalaen af ​​hver ur-scan-profil vist i panel C (skyggede områder). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4 : Eksempel på at bruge Clock Scan Plugin i billedregistrering og overlay. ( A og B ) Skærmbilleder af plade 29 fra koronalsektionen (Allen Mouse Brain Atlas) og en 200 μm tyk vibratomsektion fra den gelatinebelagte musehjerne skåret på omtrent det samme niveau som atlasbilledet. Den transgene mus, der blev anvendt i dette eksempel, udtrykte ZsGreen-fluorescerende protein under promotoren af ​​a3NKA for at identificere α3NKA-udtrykkende neuroner ² . At bestemmeKortikale områder, der er specifikt beriget med disse neuroner (lyse prikker på billedet i panel B), blev hele det kortikale område skitseret (gule punkterede linjer), der startede i begge billeder med samme referencepunkt (midtergrænsen mellem cortex og olfactory Pære; pile). ( C ) Paneler repræsenterer (fra venstre mod højre): Clock Scan polar omdanner ROI, valgt inden for atlasbilledet (panel A), inden for billedet af musens hjerneafsnit (panel B) og overlejring af disse to transformationsbilleder ("Billede | Overlay | Add Image "kommando med 50% opacitet indstilling). ( D ) Samme billede som i panel C men med grænserne af de store kortikale regioner (som vist i atlaset) skitseret i to andre transformationsbilleder ved hjælp af ImageJ-polygonet, segmenterede linjevalgværktøjer og "Analyser | Værktøjer | Synkroniser Windows" kommando. Forkortelser er de samme som i det originale hjerneatlasbillede: Motor primær og sekundær (MOp, MOs), agranulær øulær, dorSal-del (AId), orbital lateral, ventro-lateral og medial (ORBI, ORBvl, ORBm), prelimbisk (PL), anterior cingulat, dorsal del (ACAd) cortex. Tal i MO-området refererer til de vigtigste kortikale lag, som kan skelnes mellem i musemotorcortexen på det passende koronale hjerneniveau. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Clock Scan Protocol: Clock Scan-protokollen er et hurtigt og enkelt værktøj til billedanalyse. Fordelene ved denne protokol sammenlignet med eksisterende fælles tilgange til billedanalyse (såsom lineære pixelintensitetsscanning eller beregning af ROI's gennemsnitlige pixelintensitet) er beskrevet i detaljer i tidligere publikationer ^{1 , 9} . Kort sagt tillader denne protokol generering af integrerede radiale pixelintensitetsprofiler ved at kvantificere intensiteten af ​​pixels placeret på forskellige afstande fra ROI-centret såsom objektets grænse eller en forudbestemt placering uden for objektet (baggrunden). På grund af sidstnævnte kan urets scanningsprofiler for hvert ROI altid korrigeres for sin umiddelbare baggrund, hvilket (i biologiske applikationer) gør denne profil mindre afhængig af lokal, inden for prøve eller prøve-til-prøve, ikke-ensartethed I mærkning / farvning, samt ustabilitet iIntensiteten af ​​mikroskop lyskilden eller fluorescerende lys eksponering gange. Objektets størrelse og form uafhængighed af urets scanningsprofiler udvider yderligere anvendelsesområdet for denne protokol ved at muliggøre sammenligninger af forskellige objekter såvel som korrektion ved punkt-for-punkt-subtraktion af profiler af "positiv" og "negativ" kontrol objekter.

Clock Scan Plugins: Hovedbegrænsningen for distribution og deling af den oprindelige protokol var platformafhængigheden af ​​sin kode, som blev udviklet med Visual Basic 6.0 (VB) ^{1 , 9} . Dette problem er for nylig blevet behandlet af en af ​​forskergrupperne ved Leibniz Institute of Molecular Pharmacology, Tyskland, ved at udvikle et lignende Fuji ImageJ Clock Scan plugin ² . Leibniz Instituttets plugin gengiver den oprindelige urskannings grundlæggende funktionalitet i sin evne til at generere ikkeGral radiale scanprofiler til det vedlagte konvekse formede ROI, og desuden kan det behandle segmenter af konturer (buer). Skanningsgrænsen for profilen, der genereres af deres plugin, kan dog kun indstilles til 100% (objektets grænse), hvilket betyder, at baggrundspixelintensiteten ikke kan kvantificeres. Desuden har den ikke kapacitet til at generere polære transformationer, arbejde med forskellige farvekanaler i RGB-billeder eller arbejde med stakke af billeder og behandle flere ROI'er. Til sammenligning reproducerer de to nye plugins, der beskrives her, fuldt ud evnen til den originale VB-kode ( dvs. generering af integrerede klokscanings pixelintensitetsprofiler med valgfri visning af SD'er og / eller baggrundsintertraktion samt behandling af forskellige farvekanaler af RGB-billeder). Derudover kan de analysere et segment / bueformet ROI (funktionalitet indført i Fuji ImageJ plugin udviklet hos Leibniz Institute of Molecular Pharmacology ² ). Desuden er thEse plugins udvide anvendeligheden af ​​tidligere programmer ved at generere ROI-størrelse og formuafhængige polære ROI-billedtransformationer, som kan bruges i applikationer, der kræver billedregistrering. Endelig letter multi-clock scan plugin effektivt kloksøgning af flere ROI'er placeret inden for samme billede eller i en billedstabel. Den sidstnævnte nye funktion af programmet er især nyttig i applikationer, hvor det er vigtigt at bestemme ændringer i forbindelse med tid og placering.

Begrænsninger og fejlfinding: Hovedbegrænsningen af ​​Clock Scan-metoden er kravet om at vælge en konveks formet ROI. Urskanningsprofilen ville være meningsløs i situationer, når nogen af ​​de radiale scanninger krydser investeringsoversigten mere end én gang. Dette ville gøre normaliseringen af ​​længden af ​​en sådan radial scanning i forhold til afstanden fra midten til ROI-grænsen umulig. En anden begrænsning er, at urets scanningsprofiloplysninger er progressiveSively faldt i ROI mangler radial symmetri. Men i det mindste delvist kan disse to begrænsninger overvindes ved analysen af ​​udvalgte segmenter (buer) af komplekse og asymmetriske ROI'er. Anvendelse af segmentscanning anbefales også i tilfælde, hvor dele af baggrundsområdet indeholder mærket funktioner, hvilket kan påvirke baggrundsintertraktionsproceduren (se figur 2A for et eksempel på udvælgelse til analyse af de cellesegmenter, der ikke står over for andre mærkede celler). Endelig, hvis analyser af sammensatte billeder indeholdende mere end 3 farvekanaler er påkrævet, skal farvekanalerne i disse billeder deles, før du kører plugin'et.

Fremtidige retninger: Fremtidig forbedring af funktionaliteten af ​​disse plugins vil inkludere, men er ikke begrænset til opdatering af koden for at kombinere funktionaliteten af ​​ur-scan og multi-clock-scan plugins i et plugin. Farve co-lokaliseringsalgoritmer (såsom algoritmer basEd på beregninger af Pearson korrelation eller Manders split koefficienter), og udviklingen af ​​plugin for at blive i stand til at arbejde med flere ROI'er, der er valgt i forskellige billeder eller i forskellige skiver i en billedstabel (nuværende version af plugins muliggør analyse af flere ROI'er, der er valgt inden for et billede eller et ROI, der er valgt for alle billeder i stakken), vil blive implementeret. Forfatterne vil også sætte pris på eventuelle forslag fra plugin-brugere og rapporter om eventuelle problemer, der opstår under brugen af ​​eksisterende plugins.

Konklusion: Urskanningsanalysen er et lovende redskab til billeddannelse inden for mange områder af biologi, fra analysen af ​​statisk celle mærkning med forskellige markører til undersøgelser af spredning af Na ⁺ eller Ca ⁺⁺ inden for en enkelt celle såvel som for Analyse af spredningsaktivitet ( fx Ca ⁺⁺ bølger) i populationer af synaptisk forbundne celler ¹⁰ , ¹¹ eller mellemrumskoblede celler ¹² . Andre potentielle anvendelsesområder for urets scanningsanalyse omfatter medicinsk billedanalyse (ultralydsbilleder af blodkar, CT-scanbilleder og knogle tværsnit), astronomi (spiral og radial galakse billeddannelse), kemi (diffusion fra en punktkilde), Fysik (diffraktionsmønsteranalyse), skovbrug (træstam ring analyse for at bestemme alder af træet samt perioder med tørt vejr og dårlig befrugtning), ingeniørvidenskab (metalrør korrosion) og klimatologi (vejrradar billedanalyse).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Any		compatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/	bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan plugins	freeware	https://sourceforge.net/projects/clockscan/	Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0	OriginLab	Northampton, MA, USA	This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function