Summary
이 논문은 'Clock Scan'이미지 분석을위한 두 가지 새로운 ImageJ 플러그인을 설명합니다. 이 플러그인은 원본 Visual Basic 6 프로그램의 기능을 확장하고, 가장 중요한 것은 ImageJ 무료 이미지 분석 소프트웨어 패키지와 함께 번들로 제공하여 대규모 연구 커뮤니티에 프로그램을 제공 할 수있게합니다.
Abstract
이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜은 클로즈 또는 세그먼트 화 된 볼록한 관심 영역을 테두리, 내부 및 외부 (배경) 내에서 평균 픽셀 강도를 정량화하는 효율적인 도구로서, 평균 적분 된 방사형 픽셀 - 강도 프로파일. 이 프로토콜은 원래 Visual Basic 6 스크립트로 2006 년에 개발되었지만 배포가 제한적이었습니다. 이 문제를 해결하고 다른 사람들의 비슷한 노력에 동참하기 위해 원본 시계 스캔 프로토콜 코드를 ImageJ 또는 피지 ImageJ와 같은 NIH가 후원하고 자유롭게 사용할 수있는 이미지 분석 프로그램과 호환되는 두 개의 Java 기반 플러그인으로 변환했습니다. 또한 이러한 플러그인에는 관심 영역 및 이미지 스택의 여러 분석과 같은 원래 프로토콜의 기능 범위를 확장하여 몇 가지 새로운 기능이 추가되었습니다. 프로그램의 후자의 기능은 변경 사항을 결정하는 것이 중요합니다 응용 프로그램에서 특히 유용합니다시간과 위치. 따라서 생체 이미지 스택의 시계 스캔 분석은 단일 세포 내에서의 Na + 또는 Ca ++ 의 확산뿐 아니라 시냅스 집단에서의 확산 활동 ( 예 : Ca ++ 파도) 분석에 잠재적으로 적용될 수 있습니다 - 연결 또는 갭 접합 - 결합 된 전지. 여기에서는 이러한 새로운 클럭 스캔 플러그인에 대해 설명하고 이미지 분석에서 응용 프로그램의 몇 가지 예를 보여줍니다.
Introduction
이 작업의 목표는이 유형의 이미지 분석에 관심이있는 모든 연구원이 플랫폼없이 무료로 사용할 수있는 클록 스캔 프로토콜을 제시하는 것입니다. 클럭 스캔 프로토콜은 2006 년 1 월에 개발되었으며 볼록형 관심 영역 (ROI) 내에서 기존의 픽셀 강도 정량화 방법을 개선하기위한 목적으로 개발되었습니다.이 방법은보다 우수한 통합 용량과 향상된 공간 해상도를 제공합니다. 수집하는 동안 프로토콜은 "배경"픽셀 강도를 측정 할 목적으로 ROI 센터에서 경계까지 스캔 한 여러 방사형 픽셀 강도 프로파일 또는 ROI 외부의 미리 결정된 거리를 순차적으로 수집합니다. 프로토콜은 스캔 방향으로 측정 된 셀 반경에 따라 이러한 프로파일의 크기를 조정합니다. 따라서 각 개별 방사형 스캔의 중심에서 ROI 경계까지의 거리는 항상 X 축의 100 %입니다. 마지막으로,이 프로그램은이 Individualu1 개의 통합 된 방사형 픽셀 - 강도 프로파일로 프로파일 링된다. 스케일링 때문에 "클럭 스캔"프로토콜에 의해 생성 된 평균 픽셀 강도 프로필은 ROI 크기 나 ROI 모양에 대한 합리적인 범위 내에서도 결정되지 않습니다. 이 방법을 사용하면 다른 ROI의 프로파일을 직접 비교하거나 필요할 경우 평균화 또는 뺄셈을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 물체 외부에 위치한 픽셀의 평균 강도를 간단히 뺄셈하여 배경 잡음에 대한 모든 물체의 적분 픽셀 강도 프로파일을 수정할 수있게합니다. 그것은 생물학적 샘플에서만 테스트되었지만, 우리의 프로토콜은 원점 (point source)에서 물질의 확산과 같은 물리적 또는 화학적 프로세스의 이미지를 연구하는 데 사용되는 기존의 다른 이미지 분석 도구에 가치있는 추가 기능을 제공합니다 ) 1 .
그러나 원본 이미지 분석 방법의 주요 한계는 프로토콜이비주얼 베이직 6 (VB6) (코드, 따라서 플랫폼에 따라 다르고 배포하기가 어려웠습니다 (VB6 필요).)이 문제를 해결하고 다른 수사관 2 와 비슷한 최근의 노력에 동참하기 위해 VB6 클록 스캔 프로그램 코드를 NIH가 후원하고 자유롭게 사용할 수있는 오픈 소스 및 플랫폼 독립적 인 이미지 분석 프로그램 인 ImageJ 3 및 Fiji ImageJ 4 와 호환되는 두 개의 Java 기반 플러그인으로 통합 할 수 있습니다. 여러 개의 ROI와 이미지 스택을 처리하기위한 원래의 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다. 많은 이미지 분석 애플리케이션은 여러 객체의 통계 분석을 수행하는 것과 관련하여 사용자 친화적이지 않으므로 종종 대표 데이터 만 표시됩니다. 다중 Clock Scan ImageJ 플러그인을 사용하면, 동시에 여러 객체의 분석을 용이하게 할 수 있습니다. 현미경 데이터의 견고한 통계적 평가,단일 셀 / 객체의 신호 강도 분포와 관련하여이 플러그인 확장을 사용하여 가능합니다. 여기에서는 클럭 스캔 플러그인을 설명하고 이미지 분석에서 해당 응용 프로그램의 예를 보여줍니다.
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Protocol
1. 소프트웨어 설치
- 번들로 제공되는 Java 및 ImageJ 또는 Fiji ImageJ의 최신 버전을 각 웹 사이트에 권장대로 설치하십시오 (해당 웹 사이트 링크는 자료 표 참조). 아래 텍스트에서 두 프로그램을 모두 "ImageJ"라고합니다.
- Materials 테이블에 제공된 링크를 사용하여 "Clock_Scan-1.0.1. jar"및 "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar"플러그인 파일을 복사하여 ImageJ 플러그인 디렉토리에 붙여 넣으십시오. 또는 "플러그인 | 플러그인 설치"메뉴 옵션을 사용하여 파일을 컴퓨터 하드 드라이브에 저장 한 후에 설치하십시오.
2. 클록 스캔 분석
- 표준 클럭 스캔 플러그인 ( 그림 1 ) :
- ImageJ "File | Open"메뉴 명령을 사용하여 관심있는 이미지를 엽니 다.
- '다각형'도구 또는 '세그먼트 선 선택'을 클릭하십시오.도구를 선택한 다음 이미지 위에 그려 전체 ROI 또는이 영역의 세그먼트를 윤곽으로 나타냅니다. 다각형 선택의 예는 그림 1A 를 참조하십시오 (내부 파선 테두리).
참고 : 소프트웨어에서 사용할 수있는 기타 선택 도구 (직사각형, 타원형 및 프리 핸드 라인 선택)도 사용할 수 있습니다. - 메뉴에서 "Plugins | Clock Scan"을 선택하여 표준 클럭 스캔 프로토콜 팝업 옵션 창을 엽니 다. 이 명령은 개요가 자동으로 추가 된 ROI 관리자 창을 엽니 다.
- 플러그인 옵션 창을 사용하여 다음을 수행하십시오.
- 스크롤 막대를 사용하거나 해당 입력 상자의 값을 변경하여 ROI 센터의 X 및 Y 좌표 (물리적으로 매스 센터의 좌표로 자동 계산 됨)를 검토하고 변경하십시오. 그림 1B 참조.
- 객체의 바깥 쪽 배경 영역의 양에 따라스캔으로 덮히려면 "스캔 제한"스크롤 막대를 사용하여 스캔 제한을 조정하십시오. 그림 1A를 참조하십시오.
참고 : 스캔 제한은 주어진 방향에서 개체의 경계를 넘어서 스캔이 진행되어야하는 거리를 나타내는 분수입니다. 기본값은 스캔 길이가 스캔 방향의 오브젝트 반경보다 20 % 길다는 것을 나타내는 1.20입니다. 도 1a , 바깥 쪽 점선 참조). - "실제 반지름", "배경 빼기", "극좌표 변환"및 / 또는 "표준 편차가있는 플롯"확인란을 사용하여 플러그인의 출력을 수정하십시오.
- "확인"을 클릭하여 플러그인을 실행하십시오. 그림 1 C-H를 참조하십시오.
참고 : "표준 편차"및 "극좌표 변환"또는 "실제 반경"및 "극좌표 변환"을 사용하는 프로토콜 출력의 예(SD) 값은 대상의 방사형 픽셀 강도 스캔 사이의 차이를 나타냅니다. 또한 "ROI 선택"에 유의하십시오. 또한 "ROI"선택 사항은 그림 1C 및 1D 와 그림 1E 및 1F 에 각각 표시됩니다. 픽셀 단위로 측정 된 ROI 개요 길이에 대한 정보를 표시하는 플러그인 창에서 "길이"행을 선택합니다.
- 생성 된 "Clock Scan Profile Plot"에서 "List"명령을 사용하여 그레이 스케일 이미지의 X, Y 열 두 개와 RGB 이미지의 X 및 Y 열 데이터에 표시된 값을 플롯합니다.이 중 Y0, Y1, Y2 및 Y3 열은 정수 및 개별 (빨강, 녹색 및 파랑) 색상 채널 픽셀 강도 값으로 채워집니다.
- 다중 ROI 클록 스캔 플러그인 - 다중 ROI (
) : - ROI가 여러 개인 이미지를 엽니 다.
- "Analyze | Tools | ROI Manager"를 클릭하여 ROI 관리자를 엽니 다.
- 순차적으로 개요 (단계 2.1.2 참조)하고 ROI 관리자 창에서 "추가"를 클릭하여 ROI 관리자에 각 ROI를 추가하십시오. 이미지 내의 모든 ROI에 대해이 작업을 수행하십시오. ROI 메트릭이 중요한 경우 "Analyze | Measure"명령을 사용하십시오.
- 다중 분할 라인 선택의 예는 그림 2A 를, 다중 다각형 선택의 예는 그림 2E를 참조 하십시오.
- "Plugins"메뉴에서 "Multi Clock Scan"을 선택하여 프로토콜 옵션 팝업 창을 엽니 다.
- 프로토콜 옵션 창을 사용하여 다음을 수행하십시오.
- 필요한 경우 단계 2.1.4.2에 따라 스캔 제한을 재설정하십시오. 기본값은 1.20입니다.
- 필요한 경우 opt를 선택하십시오.표준 편차로 플롯 (Plot with Standard Deviation) "상자를 선택하여 SD 막대를 사용하여 평균 클록 스캔 프로파일을 플롯합니다. 그림 2 C 와 D를 참조하십시오.
참고 : 계산 된 SD 값은 서로 다른 물체의 적분 클럭 스캔 프로파일 간의 편차를 나타냅니다. 또한 플러그인 창에서 "선택한 ROI 수"에 대한 정보가 표시된 행을 기록하십시오. - "확인"을 클릭하여 프로토콜을 실행하십시오.
- 생성 된 "Clock Scan Profile Plot"에서 "List"명령을 사용하여 "Plot Values"창에 표시된 값을 플로팅하십시오. 컬러 채널 별 열 지정에 대해서는 "멀티 클록 스캔 프로파일 플롯"창 범례를 참조하십시오.
- ROI에는 번호가 매겨지고 주어진 컬러 채널에 대한 클록 스캔 프로파일은 ROI가 윤곽이 그어지고 ROI 관리자에 추가 된 순서와 동일한 순서로 그려집니다.
- 멀ROI 클럭 스캔 플러그인 - 이미지 스택 작업 ( 그림 3 ) :
- 관심있는 이미지 스택을 엽니 다.
- "Analyze | Tools | ROI Manager"를 클릭하여 ROI 관리자를 엽니 다.
- 스택 내의 이미지의 ROI를 요약하고 2.1.2 및 2.2.3 단계에서 설명한대로 ROI 관리자에 추가하십시오. ROI 메트릭에 관심이 있다면 "Analyze | Measure"명령을 사용하십시오.
- "Plugins"메뉴에서 "Multi Clock Scan"을 선택하여 프로토콜 옵션 팝업 창을 엽니 다.
- 프로토콜 옵션 창을 사용하여 다음을 수행하십시오.
- 단계 2.1.4.2에서 설명한대로 스캔 제한을 재설정하십시오. 기본값은 1.20입니다.
- '표준 편차로 플롯 (Plot with Standard Deviation)'상자를 선택하여 SD 막대가있는 평균 시계 스캔 프로파일을 플롯하는 옵션을 선택하십시오.
참고 : 계산 된 SD 값은 이미지 sta에서 선택한 오브젝트의 서로 다른 인스턴스 간 차이를 나타냅니다ck. 또한, "스택의 이미지 수"에 대한 정보를 표시하는 플러그인 창에서 라인을 주목하십시오. - "확인"을 클릭하여 프로토콜을 실행하십시오.
- "Clock Scan Profile Plot"창에서 "Plot Values"창에 표시된 값을 플롯하려면 "List"를 클릭하십시오. 여기서 Y 열 번호는 스택 내의 이미지 위치를 나타냅니다 (1).
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Representative Results
설명 목적으로 여기에 사용 된 이미지는 이전 세포 및 조직 생물학 연구 5 , 6 , 7 및 Allen Mouse Brain Atlas 8 에서 작성된 데이터베이스에서 가져온 것입니다. 두 플러그인 모두 ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 및 피지 ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 프로그램 환경을 사용하여 성공적으로 테스트되었습니다.
그림 1 은 표준 클록 스캔 플러그인을 사용한 이미지 분석의 대표 결과를 보여줍니다. 두 플러그인 모두에 대해 시계 스캔 절차의 기본 코드와 주요 단계는 원래 프로토콜 1 에서 설명한 것과 기본적으로 동일합니다. 간단히 말해 ROI 또는 ROI 세그먼트가 이미지에 윤곽을 그린 후에 ( 그림 1 그림 1A , 직선 벡터 및 곡선 화살표). ROI 배경 강도를 정량화하기 위해, 각 방사형 스캔의 길이는 미리 설정된 소수점 수에 의해 스캔 방향으로 ROI의 반경을 초과하도록 설정 될 수 있습니다 (클럭 스캔 플러그인 값의 기본값 인 반경의 0.2 또는 20 % , 그림 1A의 바깥 쪽 노란색 선). 그런 다음 수집 된 반경 프로파일을 해당 반경으로 스케일링하여 정렬하고 2에서 적분 클록 스캔 강도 프로파일을 생성하기 위해 평균화합니다56 그레이 스케일 단위의 강도 수준 ( 그림 1 C ). RGB 이미지의 경우, 두 플러그인은 결합 된 색상 프로파일 외에도 각 색상 채널 (적색, 녹색 및 청색의 256 가지 강도 레벨)에 대해 독립적 인 통합 방사형 픽셀 강도 프로파일을 자동으로 생성합니다.
기본적으로 클럭 스캔 픽셀 강도 프로파일의 x 스케일은 정규화 된 ROI 반경을 나타내며 ROI 경계에 위치한 픽셀을 나타내는 100 % 스케일링을 나타냅니다 ( 그림 1 C ). 그림 1 C에 표시된 프로파일은 "표준 편차가있는 플롯"옵션이 선택되어 생성되었으므로 그래프는 프로파일의 X 스케일을 따라 각 데이터 포인트에 대해 계산 된 SD도 표시합니다. "배경 빼기"옵션을 선택하면 배경 전체에 대한 전체 강도 프로파일이 수정됩니다.ROI 경계와 스캔 한계 경계 ( 그림 1A 의 외부 노란색 선, 데이터는 표시되지 않음) 사이에있는 픽셀의 평균 강도를 점 대 점으로 뺀 값입니다. "폴라 변환"옵션을 선택하면 클럭 스캔 플러그인이 추가 출력 창을 생성합니다. 이것은 스캔 제한 영역을 포함하여 선택된 영역의 이미지의 극 변환을 포함하며, 이미지는 각 방사 스캔 방향으로 수정되어 객체의 중심에서 경계까지의 거리가 항상 100으로 정규화됩니다 %로 표시되고 100 픽셀로 표시됩니다. 물체의 실제 크기와 관계없이 극좌표 변환 이미지의 수직 및 수평 치수는 픽셀 단위로 스캔 한도의 두 배입니다 ( 그림 1 D에 표시된 예에서는 240 픽셀 x 240 픽셀). 마지막으로 "실제 반지름"옵션을 선택하면 클럭 스캔 pr이 생성됩니다ofile과 극좌표 변환 이미지로, 객체의 실제 평균 반경과 원 이미지의 공간 보정 단위로 스케일링됩니다 ( 각각 그림 1E 와 F ).
그림 1G 및 H 는 객체 크기 및 모양에 독립적 인 극 변환과 통합 된 ImageJ 명령 및 도구를 사용하는 추가 이미지 분석 옵션을 보여줍니다. 특정 유형의 이미지 분석에 유용 할 수있는 명령의 예는 세그먼트 선 도구 및 "Analyze | Plot Profile"명령 ( 그림 1 G )과 "Analyze | Surface Plot"명령 ( 그림 1 H )입니다.
그림 2와 3 은 Multi Clock Scan 플러그인을 사용한 이미지 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. 의 출력멀티 클럭 스캔 플러그인은 두 개의 그래프로 구성됩니다 : 첫 번째 그래프는 선택된 객체의 개별 클록 스캔 프로파일을 보여 주며 ( 그림 2C) 두 번째 그래프는 이러한 개별 클럭 스캔 프로파일의 평균을 표시합니다 (± SD, 옵션, 그림 2D ) . RGB 이미지 ( 그림 2 E )의 경우 각 개별 색상 채널에 대해 계산 된 클록 스캔 프로파일이 선택된 각 ROI ( 그림 2F)에 대해 표시되고 평균은 선택된 모든 오브젝트 ( 그림 2G )에 대해 주어진 채널 내에서 계산됩니다. . 유사하게, 이미지 스택 내의 객체에 대한 개별 및 평균 클록 스캔 프로파일은 스택의 클록 스캔 분석을 수행 한 후에 디스플레이된다 ( 도 3a 내지 3d , 평균 클럭 스캔 프로파일은 도시되지 않음). 앞에서 설명한 것처럼 숫자"List"명령을 실행하여이 플롯을 생성하는 데 사용됩니다.
그림 4 는 Clock Scan 플러그인의 극 변환 옵션의 추가 응용 프로그램 중 하나 인 이미지 등록 및 오버레이 작업에 대한 적합성을 보여줍니다. 이 그림에서 ROI의 크기와 모양에 독립적 인 극성 변환은 서로 다른 마우스 피질 영역에서 α3 sodium / potassium-ATPase 펌프를 발현하는 뉴런의 형광 라벨링 분포를 비교하는 데 사용되었습니다. 아틀라스 이미지에는 국경과 해부 조직이 표시됩니다. 이들 영역 ( 도 4A-4B ). 클록 스캔 프로토콜을 사용하면 참조 (아틀라스) 및 이러한 비교에 필요한 실제 이미지의 등록은 이미지를 정렬하고 두 이미지의 관심 구조를 요약 한 다음 ROI 크기 및 모양을 생성하는 간단한 절차로 제한됩니다. 독립적 인 극좌표 변환.도 4에 도시 된 예에서, 극성 변환의 비교는 마우스 피질의 표지 된 세포의 불균일 한 분포를 명확하게 나타내며, 이들의 밀도는 운동 피질의 2/3 층의 표면적, 지느러미 부분 ( 그림 4C-4D ), 외측 피질의 외측 피질 및 외측 피질의 심층에 분포한다.
그림 1 : 이미지 분석을위한 클럭 스캔 플러그인의 애플리케이션 예제 ( A ) Na + / K + - ATPase의 α3 isoform (α3 NKA, 조직 처리 및 염색법에 대한 자세한 내용은 Schneider 외 3 참조)에 대해 면역 염색 된 쥐의 후부 신경절 단면의 형광 이미지.신경 프로파일 중 하나는 α3 NKA (흰색)에 대해 많이 레이블링 된 경계선이 다각형 선 도구 (내부 노란색 선)를 사용하여 윤곽이 지정됩니다. 반경 스캔 (흰색 화살표) 제한 (외부 노란색 라인)은 패널 B (스캔 제한 스크롤 막대)에 표시된 것처럼 오브젝트 중심점 (흰색 점)에서 외곽선의 첫 번째 픽셀까지 오브젝트 반경의 120 %로 설정되었습니다. ( B ) 클럭 스캔 플러그인의 메인 옵션 창 스크린 샷. ( C ) 패널 A에 표시된 셀의 전체 픽셀 강도 프로필 플롯 (평균 706 방사형 스캔 프로파일, B에서 개요 길이 참조, 수직 막대는 SD 막대). ( D ) - 연구 된 세포 프로파일의 극좌표 변환 이미지. ( E ) "실제 반지름"옵션을 선택하여 얻은 동일한 셀의 클록 스캔 프로파일. C에 표시된 프로파일과 달리이 프로파일의 x 스케일은 실제 공간 보정 단위 (μm)를 표시합니다. ( F )와 동일한 세포의 극 변환 "실제 반지름"옵션이 선택되었습니다. 이 변환의 스케일은 이제 실제 공간 보정 단위 (μm)입니다. ( G ) D로 표시된 극좌표 변환의 경계선은 세그먼트 선 도구를 사용하여 윤곽을 그렸습니다 (선 두께는 방사형 스캔 길이의 10 픽셀 또는 10 %로 설정 됨). "Analyze | Plot Profile"명령은 객체의 경계를 따라 평균 라벨 강도의 변화를 측정하기 위해 실행되었습니다 (그래프의 각 데이터 포인트는 선택 선 너비에 걸친 모든 픽셀의 평균 강도를 나타냅니다). ( H ) "분석 | 표면 플롯"명령을 패널 D에 나타난 극 변환 화상에 적용하여 대상의 라벨 강도의 3-D 표현을 생성 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2 : 이미지 분석을위한 멀티 클럭 스캔 플러그인을 사용한 대표적인 예제 적용. ( A ) α3 NKA에 대해 면역 염색 된 쥐의 후부 신경절 절편 내에 4 개의 시야가 포착되었다 ( 도 1A 참조). 멀티 클럭 스캔 플러그인의 사용을 단순화하기 위해이 이미지를 스택에 넣은 다음 "Image | Stacks | Make Montage"명령을 사용하여 단일 이미지로 변환했습니다. 빨간색 선과 숫자는이 이미지에서 5 개의 관심 영역의 세그먼트 선 선택을 나타냅니다. ( B ) 플러그인을 사용하여 그레이 스케일 이미지를 분석 할 때 멀티 클록 스캔 윈도우의 스크린 샷이 표시됩니다. ( C ) 패널 A에 표시된 5 개의 ROI의 개별 클록 스캔 프로파일 ( D ) 선택된 ROI의 평균 클럭 스캔 프로파일 (패널A) SD bar (옵션 "plot with standard deviation"선택). ( E ) 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI, 핵 염색, 파란색) 및 β1- 인테그린 (녹색) 및 F- 액틴 (적색)에 대해 형광 표지 된 항체로 표지 한 배양 된 마우스 preBI- 림프구의 RGB 이미지 세포 배양 기술에 대해서는 Dobretsov 등 7 ) , 염색에 대해서는 Yuryev 등 11 ). 11 개의 셀 (번호 레이블 참조)은 ImageJ 다각형 선택 도구를 사용하여 윤곽이 그려졌습니다. 오른쪽의 패널은 "Image | Color | Split Channels"메뉴 기능이 실행 된 후 셀 # 7 (왼쪽 패널의 직사각형 선택)의 녹색 및 적색 채널보기를 표시합니다. ( F ) 개별 셀 클럭 스캔 프로파일 (컴포지트 및 레드, 그린 및 블루 컬러 채널 프로파일은 각각 검은 색, 빨간색, 녹색 및 청색 선으로 표시). ( G ) 패널에서 선택된 11 개의 모든 ROI에 대한 평균 클록 스캔 프로파일E. 패널 G와 같은 색상 지정 (다중 클럭 스캔 절차 중에 표준 편차 옵션이있는 플롯이 사용되지 않음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 다중 클록 스캔 플러그인 및 이미지 스택 분석 ( A ) 선택한 "스택으로 저장"이미지 프레임의 몽타주. 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경으로 포착 된 등쪽 뿌리 신경절 뉴런의 이미지가 첫 번째 프레임에 표시됩니다. 세포의 전기적 자극 전후의 상이한 시간 간격에서 세포 내 칼슘 농도를 모니터링하기 위해 연속 조명 형광 현미경을 사용하여 후속 프레임을 획득 하였다. 존경 옆의 수이미지는 ms 단위로 시간을 나타냅니다. 세포의 테두리는 스택의 DIC 이미지를 사용하여 윤곽을 잡았습니다 (상단 왼쪽 프레임, 별표는 칼슘에 민감한 염료 Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1)으로 세포를 채우고 채우는 데 사용 된 패치 클램프 피펫임을 나타냅니다) ), 남은 이미지에서 Multi Clock Scan 절차를 실행하는 데 사용됩니다. ( B ) 프로그램이 이미지 스택에서 실행될 때 다중 클록 스캔 창의 스크린 샷. ( C ) 전기 자극 전후의 다른 시간 (반경의 %)과 셀 중심으로부터의 거리가 다른 OGB-1 형광 신호의 클록 스캔 프로파일 (범례, ms). 이 그래프를 준비하기 위해 전문 그래프 소프트웨어가 사용되었습니다. ( D ) 하위 멤브레인과 깊은 세포질 세포 영역 (각각 빨간색과 검은 색 원과 라인)에서 OGB - 1 신호의 강도가 시간에 따라 변화합니다. 이 데이터를 얻기 위해 각 데이터 포인트 locat에 대해 평균 및 SD를 계산했습니다패널 C (음영 영역)에 표시된 각 클럭 스캔 프로파일의 x- 스케일의 20-40 %와 70-90 % 사이의 차이를 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 이미지 등록 및 오버레이에서 클록 스캔 플러그인 사용 예 ( A 및 B ) 관상 섹션 (앨런 마우스 브레인 아틀라스)에서 판 29의 스크린 샷과 아틀라스 이미지와 거의 동일한 수준으로 절단 된 젤라틴 내장 마우스 뇌에서 200 μm 두께의 vibratome 섹션. 이 예제에서 사용 된 형질 전환 마우스는 α3NKA의 발현하에 ZsGreen- 형광 단백질을 발현하여 α3NKA- 발현 뉴런 2 를 확인 하였다. 결정하기이 뉴런으로 특별히 농축 된 피질 영역 (패널 B의 이미지상의 밝은 점들), 동일한 피질 영역 (피질과 후각 사이의 중간 경계)에서 두 피질 영역으로 시작하는 전체 피질 영역이 윤곽이 그려져있다 (노란색 점선) 벌브; 화살표). ( C ) 패널은 (왼쪽에서 오른쪽으로) 다음을 나타냅니다 : Clock Scan polar은 마우스 두뇌 섹션 (패널 B)의 이미지와이 두 변환 이미지의 오버레이 ( "이미지") 내에서 아트라스 이미지 Overlay | Add Image "명령에 50 % 불투명도 설정). ( D ) 패널 C와 같은 이미지이지만 ImageJ 다각형, 세그먼트 선 선택 도구 및 "Analyze Tools | Synchronize Windows"를 사용하여 두 개의 다른 변환 이미지에서 윤곽이 잡힌 대뇌 피질의 경계선 (아틀라스에서 보여지는 것처럼) 명령. 약어는 원래의 두뇌 아틀라스 이미지와 동일합니다 : 모터 1 차 및 2 차 (MOp, MOs), 비경 구적 섬 모양, 도르래(ORBI, ORBv1, ORBm), prelimbic (PL), anterior cingulate, dorsal part (ACAd) 피질을 포함하는 다양한 유형의 외과 적 치료에 사용될 수있다. MO 영역의 숫자는 주요 피질 층을 지칭하며, 이는 적절한 코로나 뇌 수준에서 마우스 모터 피질에서 구별 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
클럭 스캔 프로토콜 : 클록 스캔 프로토콜은 이미지 분석의 빠르고 간단한 도구입니다. 선형 픽셀 강도 스캔 또는 ROI의 평균 픽셀 강도 계산과 같은 기존의 일반적인 이미지 분석 방법과 비교하여이 프로토콜의 이점은 이전 출판물 1 , 9 에 자세히 설명되어 있습니다. 간단히 말해서,이 프로토콜은 물체의 경계선과 같은 ROI 중심으로부터 다른 거리에 위치한 픽셀의 강도 또는 물체 외부의 사전 결정된 위치 (배경)를 정량화하여 적분 방사형 픽셀 강도 프로파일을 생성 할 수있게합니다. 후자 때문에 각 ROI의 클럭 스캔 프로파일은 (생물학적 응용에서)이 프로파일을 로컬, 샘플 내 또는 샘플 간 비 균일성에 덜 의존하게하는 즉각적인 배경에 대해 항상 보정 될 수 있습니다 라벨링 / 염색에서뿐만 아니라현미경 광원의 강도 또는 형광 노출 시간. 시계 스캔 프로파일의 객체 크기 및 형태 독립성은 "긍정적"및 "부정적인"제어 프로파일의 포인트 별 감산에 의한 수정뿐만 아니라 다른 객체의 비교를 가능하게함으로써이 프로토콜의 적용 영역을 더욱 확장시킵니다 사물.
클럭 스캔 플러그인 : 원래 프로토콜을 배포하고 공유하는 데있어 주요 제한 사항은 Visual Basic 6.0 (VB) 1 , 9 로 개발 된 코드의 플랫폼 의존성이었습니다. 이 문제는 비슷한 후지 ImageJ 클록 스캔 플러그인 2 를 개발하여 Leibniz 분자 의약 연구소 (Institute of Molecular Pharmacology)의 연구 그룹 중 한 명이 최근에 다루어졌습니다. Leibniz Institute의 플러그인은 원래의 시계 스캔 기능을 사용하여 inte를 생성하는 기능을 재현합니다.둘러싸인 볼록 형상 ROI에 대한 gral 방사형 스캔 프로파일을 제공하고 외곽선 (호) 세그먼트를 처리 할 수 있습니다. 그러나 플러그인에서 생성 된 프로필의 스캔 제한은 100 % (개체의 테두리)로만 설정할 수 있습니다. 즉, 배경 픽셀 강도를 정량화 할 수 없습니다. 또한 극좌표 변환을 생성하거나, RGB 이미지에서 다른 색상 채널로 작업하거나, 이미지 스택으로 작업하고 여러 ROI를 처리 할 수있는 역량이 없습니다. 비교해 보면, 여기에 설명 된 두 개의 새로운 플러그인은 원본 VB 코드의 기능을 완전히 재현합니다 ( 예 : SD 및 / 또는 배경 빼기를 선택적으로 표시하는 적분 클록 스캔 픽셀 강도 프로파일 생성, RGB 이미지). 또한 Leibniz Institute of Molecular Pharmacology 2 에서 개발 된 Fuji ImageJ 플러그인에서 소개 된 세그먼트 / 아크 모양의 ROI를 분석 할 수 있습니다. 또한, these 플러그인은 이미지 등록이 필요한 응용 프로그램에서 사용할 수있는 ROI 크기 및 모양에 독립적 인 극좌표 ROI 이미지 변환을 생성하여 이전 프로그램의 유틸리티를 확장합니다. 마지막으로 멀티 클럭 스캔 플러그인은 동일한 이미지 또는 이미지 스택에있는 여러 ROI의 클럭 스캔을 효과적으로 수행합니다. 프로그램의 후자의 새로운 기능은 시간과 위치와 관련된 변경 사항을 확인하는 것이 중요한 응용 프로그램에서 특히 유용합니다.
제한 사항 및 문제 해결 : 클록 스캔 방법의 주요 제한 사항은 볼록한 ROI를 선택해야한다는 것입니다. 방사형 스캔이 ROI 개요를 두 번 이상 넘는 상황에서는 클럭 스캔 프로파일이 의미가 없습니다. 이것은 중심에서 ROI 경계까지의 거리에 대한 그러한 방사형 스캔의 길이의 정규화를 불가능하게 할 것이다. 또 다른 한계는 시계 스캔 프로파일 정보가 프로그 램방사형 대칭이없는 ROI가 감소했습니다. 그러나 적어도 부분적으로 이러한 두 가지 제한은 복잡한 모양의 ROI와 비대칭 ROI의 선택된 세그먼트 (호) 분석을 통해 극복 될 수 있습니다. 세그먼트 스캔을 사용하면 백그라운드 영역의 섹션에 레이블이 지정된 기능이 포함되어있어 백그라운드 빼기 절차에 영향을 줄 수 있으므로 권장됩니다 ( 그림 2A 에서는 다른 레이블이있는 셀이 아닌 셀 세그먼트를 분석하는 예제를 보여줍니다). 마지막으로 3 개 이상의 컬러 채널이 포함 된 합성 이미지 분석이 필요한 경우 플러그인을 실행하기 전에 이러한 이미지의 색상 채널을 분할해야합니다.
향후 방향 : 이러한 플러그인 기능의 향후 개선에는 클록 스캔 및 멀티 클럭 스캔 플러그인의 기능을 하나의 플러그인으로 결합하도록 코드를 업데이트하는 것이 포함되지만 이에 국한되지는 않습니다. 컬러 공동 지역화 알고리즘 (알고리즘 기반Pearson의 상관 관계 또는 Manders 분할 계수 계산), 이미지 스택의 다른 이미지 나 다른 슬라이스에서 선택된 여러 ROI로 작업 할 수있게하는 플러그인 개발 (현재 버전의 플러그인은 여러 하나의 이미지 내에서 선택된 ROI 또는 스택의 모든 이미지에 대해 선택된 ROI)가 구현됩니다. 저자는 또한 기존 플러그인을 사용하는 동안 발생하는 문제에 대한 플러그인 사용자 및 보고서의 제안을 감사하게 생각합니다.
결론 : 클럭 스캔 분석은 다양한 마커를 이용한 정적 세포 라벨링 분석부터 단일 세포 내에서뿐만 아니라 Na + 또는 Ca ++ 의 확산 연구까지, 생물학의 여러 분야에서 이미징 연구를위한 유망한 도구입니다 시냅스 연결 세포 집단의 확산 활동 ( 예 : Ca ++ 파) 분석 10 (11) 또는 갭 접합 - 결합 셀 (12)을 포함한다. 클럭 스캔 분석의 다른 잠재적 인 응용 분야로는 의료 영상 분석 (혈관의 초음파 영상, CT 스캔 영상 및 뼈 단면), 천문학 (나선형 및 방사상 은하 영상), 화학 (점 광원으로부터의 확산) (회절 패턴 분석), 임업 (건조한 날씨와 비옥 한시기뿐만 아니라 나무의 나이를 결정하기위한 나무 줄기 고리 분석), 엔지니어링 (금속 파이프 부식) 및 기후학 (기상 레이더 이미지 분석) 등이 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 금전적 이해 관계 또는 다른 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
Fuji ImageJ Clock Scan 플러그인 버전을 우리와 공유하고이 프로그램 버전을 개발하도록 고무시켜 준 Tanja Maritzen 박사와 Fabian Feutlinske 박사 (Leibniz Institute of Molecular Pharmacology, Berlin, Germany)에게 감사드립니다. 우리는 또한 플 뢰즈 멜 처 박사 (Max Plck Institute for Infection Biology) 림프구 개발 부서 (Department of Fritz Melchers)에게 플러그인 테스트 및 개선 목적으로 그의 부서의 데이터베이스에서 이미지를 사용하는 것에 대한 허락감에 감사드립니다. 지원 : Translational Neurosciences 센터; NIH 교부금 : P30-GM110702-03.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer | Any | compatible with software listed below | |
| ImageJ or Fiji ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/ | bundled with Java 1.8 or higher |
| Clock-scan plugins | freeware | https://sourceforge.net/projects/clockscan/ | Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar |
| Origin 9.0 | OriginLab | Northampton, MA, USA | This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function |
References
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