Summary
Qui dimostriamo un nuovo approccio all'utilizzo di tomografia a coerenza ottica spectral-domain ad alta risoluzione (HR-SD-OCT) per assistere la consegna degli agenti di terapia genica nello spazio subretinal, valutare la sua copertura area e caratterizzano la vitalità del fotoricettore.
Abstract
HR-SD-OCT è utilizzata per monitorare la progressione della degenerazione dei fotorecettori in modelli murini dal vivo, valutare la consegna degli agenti terapeutici nello spazio subretinal e per valutare la tossicità e l'efficacia in vivo. HR-SD-OCT utilizza nel vicino infrarosso (800-880 nm) e ha ottica specificamente progettato per l'unica ottica dell'occhio del mouse con risoluzione assiale sub-2 micron. Modelli murini transgenici di degenerazione retinica esterna (fotorecettori) e i controlli erano imaged per valutare la progressione di malattia. Vetro tirato microaghi erano usati per fornire sub retiniche iniezioni di virus adeno-associato (AAV) o nanoparticelle (NP) tramite un approccio trans-sclerale e trans-coroideale. Attento posizionamento dell'ago nello spazio subretinal è stato richiesto prima di un'iniezione di pressione calibrata, che trasporta il fluido nello spazio retinico sub. Tempo reale subretinal chirurgia è stato condotto su nostro retinica imaging system (RIS). HR-SD-OCT ha dimostrato la progressiva degenerazione retinica uniforme dovuto l'espressione di un tossico rodopsina mutante umano mutante (P347S) (RHOP347S) transgene in topi. HR-SD-OCT permette rigorosa quantificazione di tutti gli strati della retina. Strato nucleare esterno (ONL) del fotoricettore e spessore segmento esterno (OSL) misure di lunghezza si correlano con la vitalità dei fotorecettori, degenerazione o salvataggio. Il sistema di consegna RIS consente la visualizzazione in tempo reale delle iniezioni subretinal in neonatale (~ P10-14) o topi adulti e HR-SD-OCT immediatamente determina il successo di consegna e mappe estensione areale. HR-SD-OCT è un potente strumento che può valutare il successo della chirurgia subretinal in topi, inoltre a misurare la vitalità di fotorecettori in vivo. HR-SD-OCT consente anche di identificare coorti uniforme animale per valutare l'entità della degenerazione retinica, la tossicità e soccorso terapeutico in studi di ricerca di terapia genica preclinici.
Introduction
I ricercatori stanno sviluppando terapie geniche per una varietà di malattie degenerative della retina e della retina con la speranza di tradurre approcci terapeutici in trattamenti per la malattia umana1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. tempo dominio o tomografia a coerenza ottica dominio spettrale (SD-OCT) è stata utilizzata per indagare gli aspetti di degenerazione retinica esterna in modelli murini specifici di malattia12,13,14 . HR-SD-OCT non, tuttavia, è stato ampiamente utilizzato nel contesto della valutazione di modelli murini di ottimizzazione per determinare il tasso e l'omogeneità spaziale di degenerazione retinica, o nel contesto della valutazione preclinica di gene base terapeutica, ad esempio, a valutare l'estensione spaziale di vettore consegna8,15,16, tossicità o salvataggio. Una volta che un modello del topo è completamente caratterizzato, i dati di HR-SD-OCT possono servire come una risorsa informativa e affidabile per misurare l'impatto di terapeutica di esercitare tossicità in modelli murini di degenerazione retinica17o salvataggio. Molti gruppi sono tramite iniezione subretinal come metodo di consegna del vettore grazie alla sua efficienza alle transducing fotorecettori e cellule del pigmento retinico epitelio (RPE). Tuttavia, questo rimane un metodo difficile da padroneggiare, dato che essa viene in genere eseguita dalla chirurgia mano libera dalla superficie cornea e spesso è irto di cataratta, emorragia e le separazioni retiniche non intenzionali che accadono semplicemente tramite manipolazione del posteriore vitreo. Molti gruppi ancora tentano subretinal iniezioni ciecamente e consegnare il virus utilizzando iniezioni manuali con diametro relativamente grande in acciaio inox aghi (34G)8,17,18,19 ,20,21,22e alcuni usi tomografia a coerenza ottica (OCT) imaging per confermare la corretta consegna del vettore al retina8,17, 20 , 22. alcuni miglioramenti nel metodo recentemente sono state descritte usando gli aghi su microscala, guidati da un micromanipolatore22.
Vi presentiamo un approccio integrato che agevola il posizionamento dell'ago e le iniezioni sono facilitate da un oftalmoscopio stereo diretto personalizzato progettato in laboratorio specificamente per la visualizzazione all'interno dell'occhio piccolo del mouse17, 23. l'uso di micro aghi di vetro tirato in combinazione con il micromanipolatore stereotassiche forniscono un miglior controllo del posizionamento dell'ago con alcun taglio chirurgico giù richiesto (vale a dire, attraverso la congiuntiva e del tessuto connettivo) prima di iniezione. L'uso della pressione regolata iniettore micro aiuta a consegnare volumi di iniezione coerente, e l'iniezione può essere fatto con maggiore stabilità, precisione e molto più lenta di iniezioni manuali eseguite da una siringa portatile, diminuendo in tal modo la avvenimento di iniezione bolla nell'occhio. L'ago più piccolo aiuta a prevenire perdite dopo ritiro di ago perché il percorso è autosigillante. Per valutare la portata dell'iniezione/consegna, molti gruppi investigativi si basano sulla ricerca e la valutazione dell'estensione area di fluorescenza verde avanzata espressione della proteina (EGFP) nella retina (costrutto di espressione consegnato dal vettore) all'estremità sperimentale punto (eutanasia) per confermare il successo iniezioni11,19,20,24. Questo approccio (che non utilizzano OCT) per verificare il successo chirurgico rifiuti una quantità enorme di risorse in tempo chirurgico procedurale e gli animali, dato che tutti gli animali con guasti chirurgici (sconosciuti) devono essere mantenuti, seguita con misure ripetitive fino al eutanasia e occhio vendemmia (quando EGFP è misurata). Conferma della posizione di iniezione nella retina può essere migliorata utilizzando HR-SD-OCT per dimostrare che l'iniezione è situato tra gli strati corretti della retina (cioè lo spazio subretinal). HR-SD-OCT è utilizzabile anche per delineare immediatamente tentativi infruttuosi (guasti chirurgici) per identificare le variabili rilevanti in tempo reale chirurgico per migliorare l'approccio. Abbiamo trovato che HR-SD-OCT fornisce numerosi vantaggi nel gene preclinici terapia studi consentendo la rapida valutazione quantitativa della degenerazione retinica esterna, consentendo l'identificazione/abbattimento di animali di studio che non soddisfano i criteri sperimentali ( ad esempio, iniezione subretinal non corretto) e a dirigere la formazione immagine di follow-up nella regione dell'occhio dove il vettore è stato consegnato (dove è più probabile effetto preclinico) così come le aree dove non è stato recapitato vettoriale controlli. Dal suo sviluppo, l'uso di SD-OCT ha continuato ad essere accettati e utilizzati da ricercatori di oftalmologia ed è ora considerato lo standard di imaging retinico in studi scientifici retinici in mouse o roditore modelli13,25. HR-SD-OCT e le sue capacità di software sono stati utilizzati in modi unici integrati per portare avanti l'obiettivo di successo quantitativa di terapia genica in modelli murini in ogni fase del processo, tra cui selezione modello animale, caratterizzazione di degenerazione nella vostra modelli di malattia, consegna terapeutico, mappatura di consegna del vettore e la valutazione di efficacia/tossicità. L'uso di HR-SD-OCT permette per la scoperta di nuovi farmaci più efficiente ad ogni livello del processo. Qui descriviamo questi approcci che vengono utilizzati nel nostro programma di RNA Drug Discovery.
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Protocol
Protocolli di animali erano esaminati e approvati dalle commissioni di utilizzo VA WNY HCS e dall'Università di Buffalo-SUNY e istituzionali Animal Care. Gli animali sono stati utilizzati secondo le disposizioni dell'associazione per la ricerca in Oftalmologia (ARVO) e la visione e la dichiarazione di Helsinki.
1. Mouse modelli
- Identificare i modelli di mouse da valutarsi includendo i controlli.
Nota: Imaging è stata eseguita per un C57BL/6(J), mWT hC1/hC1 / / / mWT, un modello di degenerazione retinica parzialmente umanizzato del topo omozigotico per alleli mutanti umani hC1P347S di RHOil wild-type (WT) mouse RHO+ + genotipo26 , 27, hC1 x BL/6(J), un modello parzialmente umanizzato con una singola copia dell'allele del mutante umano RHOP347S hC1 sul mouse WT RHO+ + genotipo (hC1 /-/ / mWT/mWT) (ottenuta incrociando mWT hC1/hC1 / / / mWT con (C57BL/6 Topi J)). Il sopra pigmentosa dominante autosomal di retinite (adRP) modelli sono sullo sfondo C57BL/6(J). Un modello del mouse che è omozigotico per due copie del gene WT RHO umano del mouse sfondo knockout RHO era anche usato28,29. Questa linea è sullo sfondo 129Sv. Quando questa riga è stata attraversata con un ko di RHO del mouse sullo sfondo 129Sv, una singola dose di umana RHO si verifica sul mouse RHO sfondo. - Mantenere gli animali seguendo le condizioni pertinenti al disegno sperimentale.
Nota: Gli animali sono stati mantenuti in unità medica veterinaria (VMU) presso il VA WNY HCS. Topi sono stati alimentati lab standard chow e coltivati sotto 12 h:12 h luce: cicli scuri con lavagna luminosa fluorescente morbido bianco luci con circa 300 lux a livello della gabbia a circa 72 ˚ f.
2. Mouse Eye Gel
- Preparare il gel ottico utilizzato per imaging retinico30 e procedure chirurgiche.
- Combinare 2 mg/mL w/v ad alto peso molecolare (4 x 106 g/mol carbomer sterile 1 x soluzione salina tampone fosfato (PBS).
- Mescolare a temperatura ambiente fino a quando il gel forma un gel viscoso otticamente trasparente.
- Trasferire il gel in piccole bottiglie sterili e centrifugare in una centrifuga da tavolo oscillante di benna a 350 x g per rimuovere le bolle d'aria intrappolate.
- Applicare il gel direttamente alla cornea per creare un'interfaccia tra la cornea di mouse e un vetro di copertura premium (18 x 18 mm).
3. HR-SD-OCT Imaging
- Vedere il dispositivo HR-SD-OCT (Figura 1).
- Pesare l'animale per determinare la corretta dose di anestetico. Anestetizzare il mouse usando 25 µ l/g del peso corporeo della soluzione 2,5% di buffer 2,2,2-tribromo alcool (Avertin) soluzione tramite l'iniezione intraperitoneale (IP), quindi aggiungere che il collirio per dilatare le pupille dopo che l'animale è immobilizzato.
- Confermare che l'animale è anestetizzato completamente da un pizzico di punta ed essere certi che l'animale non reagisce.
- Tagliare i baffi e posizionare il mouse sulla slitta HR-SD-OCT.
- Posizione dell'occhio del mouse direttamente davanti all'obiettivo di copricapo e manipolare i controlli di fase fino a quando la cornea e l'iride si trovano. Mantenere la cornea idratata applicando le lacrime artificiali.
Nota: I micromanipolatori di regolazione fine sulla slitta HR-SD-OCT vengono utilizzati per posizionare il mouse in modo tale che l'apertura della pupilla è centrato e orientato. Il copricapo ottico allora è avanzato fino a quando la retina diventa visibile e l'animale è ulteriormente regolato per ottenere la migliore immagine possibile. - In primo luogo, aprire il programma software "Mouse" e fare clic su "paziente/esame". In secondo luogo, fare clic su "Aggiungi paziente" e immettere le informazioni pertinenti per identificare l'animale nella finestra del nuova paziente e "salvare e uscire". In terzo luogo, fare clic su "Aggiungi esame" seguita da "inizio esame". In quarto luogo, cliccare su "Aggiungi scansione personalizzata" e selezionare "volume rettangolare", scegliete OD e OS per l'occhio essere imaged, quindi fare clic su "Aggiungi esame". Infine, avviare con l'obiettivo dello strumento e posizionamento dell'animale per ottenere la regione di interesse. Dopo trovando la regione desiderata, rimuovere il liquido in eccesso dalla superficie dell'occhio usando un cotone sterile con punta applicatore appena prima dell'acquisizione dell'immagine al fine di migliorare ulteriormente la qualità dell'immagine, quindi fare clic su "avvia istantanea", e se si ottiene una buona immagine, fare clic su "salvare scansione".
Nota: Parametri tipici per immagini HR-SD-OCT rettangolari sono 900 a-scansioni/b-scan e b-scansioni/immagine 90. Immagini acquisite sono 1,4 x 1,4 mm. La regione della retina imaged dipende l'esperimento specifico, ma la maggior parte delle immagini sono centrate sulla testa del nervo ottico (ONH).
4. valutare la presenza, tasso e l'uniformità delle degenerazioni retiniche esterno modello
- Valutazione del modello di degenerazione retinica esterna di HR-SD-OCT
- Ottenere gli animali con un ampio spettro di età per il controllo e soggetti sperimentali per valutare la presenza, la frequenza e l'uniformità di degenerazione retinica esterna.
- Eseguire imaging HR-SD-OCT sugli animali più in ogni età da entrambi coorti (malattia e normale). Utilizzare il metodo descritto in 3.1.6 per ottenere le immagini OCT.
Nota: I dati possono essere raccolti da un grande gruppo degli animali tutti in una volta, che hanno distribuito compleanni che abbracciano un ampio periodo di tempo (1 anno), o un piccolo gruppo di animali può essere utilizzato per raccogliere più immagini per un lungo periodo di tempo (1 anno) per ottenere risultati simili. - Aprire un'immagine di volume rettangolare HR-SD-OCT registrata e identificare il prima b-scan da misurare (idealmente includerà il ONH o altro punto di riferimento identificabile) dall'insieme di immagini. Ingrandire l'immagine per riempire lo schermo utilizzando la funzionalità di zoom nel software.
- Aprire il numero desiderato di pinze facendo clic destro sull'immagine del b-scan e poi cliccando su "Pinze" e infine su come molti calibri come desiderato (essi sono numerati da 1 a 10). Garantire che le pinze presentarsi nell'angolo inferiore destro dell'immagine. Utilizzando la funzionalità di "Configurare pinza", assegnarli tutti come "verticale" nella colonna di blocco di angolo e accendere la "Display pinza posizione" per facilitare il posizionamento uniforme in tutta la retina e infine fare clic su Applica.
Nota: 1 pinzast deve essere posizionata sul lato sinistro dell'immagine durante l'elaborazione l'oculus dexter occhio destro (OD) e l'1st pinza deve essere collocato sul lato destro dell'immagine durante l'elaborazione di immagini oculus sinistre (OS) occhio di sinistra. Questo provoca una nasale all'orientamento temporale di tutti i dati per entrambi gli occhi destro e sinistro durante la stampa. - Utilizzando il mouse del computer, spostare ciascuna pinza nella posizione desiderata (distanza 2,0 mm) attraverso il b-scan, assicurandosi di posizionare una pinza al centro della testa del nervo ottico, in b-scan immagini che includono (impostare questa pinza a zero). Quindi utilizzare il mouse per fare clic e trascinare la pinza alla lunghezza per estendere l'area di interesse. Fissato arbitrariamente pinze che non misurabili regioni della b-scansione alla massima lunghezza di sovrapposizione e ignorare durante l'analisi dei dati.
- Misurare lo spessore ONL utilizzando gli strumenti di pinza, posizionando la parte superiore della pinza la membrana di limitazione esterna (olmo) e parte inferiore della pinza nella parte inferiore dello strato plexiform esterno (OPL). Ripetere questa operazione per ogni pinza attraverso la retina a incrementi di 0,2 mm. Salvare le misurazioni.
- Dopo tutte le pinze sono state posizionate e regolate alla dimensione, fare clic con il pulsante destro sull'immagine e scegliere "Salva dati pinza".
- Ripetere le misurazioni su b-scansioni successive (ogni 10th scansione funziona bene) dallo stesso volume rettangolare immagine OCT che abbracciano l'intera retina da inferiore a superiore regioni. Pinze dovrebbero rimanere aperta e nella stessa posizione nell'asse x. Regolare la lunghezza delle pinze senza spostarli in direzione X.
- Aprire il salvataggio file di dati facendo clic sull'icona di file di piccole dimensioni accanto la trasformati b-scansione immagine e clicca su "Vai ai dati". Fare clic su "modifica data per organizzare i file in ordine basato su tempo risparmiato e aprire tutti i file per ogni b-scan misurato.
- Compilare i dati grezzi da ogni b-scansione in un unico file in ordine dal più basso al più alto basato sul numero di telaio. Selezionare le colonne di dati tra cui "Nome di pinza", "Lunghezza" e "Centro X".
- Assicurarsi che il centro X è lo stesso per tutti i b-scan misurato per ogni volume rettangolare OCT immagine elaborata. Elimina tutti i dati dai calibri che non erano abituati a registrare misurazioni e impostare la pinza che si trova al centro della testa del nervo ottico a zero.
- Tracciare i dati per X vs più set di dati di Y per ottenere una funzione 3D trama per tracciare lo spessore complessivo della ONL o altro misurato strato retinico.
- Confrontare le misure ONL tra controllo e animali da esperimento con età corrispondente per determinare il tasso e l'omogeneità di qualsiasi potenziale degenerazione retinica.
- Ripetere il processo per misurazioni di OSL utilizzando le stesse immagini b-scan. Seguire la stessa metodologia utilizzata per misurare la ONL, ad eccezione di immissione le pinze tra ELM e di Bruch membrana (BM).
Nota: Nella sezione risultati rappresentante (Figura 3B) è riportato un esempio di come posizionare la pinza. Questo dovrebbe essere fatto su un'immagine ingrandita per diminuire l'errore. - Ripetere l'analisi dei dati per più animali per ogni compleanno per entrambi sperimentale e coorti di controllo.
- Misurazione completa e mappatura 3D dello spessore ONL o OSL utilizzando lo strumento software di pinze
- Rivedere le immagini OCT di post iniezione e prendere nota di qualsiasi identificabili luoghi d'interesse, come il ONH o vasi sanguigni nella retina. Quindi posizionare il mouse per ottenere un follow-up SD-OCT dalla stessa regione e assicurarsi di includere i punti di riferimento stessi identificabili.
Nota: Assicurarsi che la regione della retina imaged e coinvolti nella separazione retinica viene identificata nelle immagini post iniezione SD-OCT. Registrare un'immagine di volume rettangolare SD-OCT e salvarlo. - Elaborare le immagini registrate come descritto in precedenza nei passaggi 4.1.3. per 4.1.14. Salvare i dati di pinza e trama come descritto sopra.
Nota: La matrice risultante delle misurazioni ONL è utilizzata per creare una trama 3D raffigurante lo spessore ONL. La posizione delle pinze lungo l'asse x permettono di replot grafico ponendo il nervo ottico all'origine (0) lungo l'asse x. L'asse y viene tracciata utilizzando il numero di b-scan e il nervo ottico viene quindi utilizzato per definire il punto di partenza, che permette di posizionare correttamente il nervo ottico all'origine sull'asse y. Identificare il nervo ottico in ogni set di dati consente di follow-up immagini essere allineati in modo affidabile.
- Rivedere le immagini OCT di post iniezione e prendere nota di qualsiasi identificabili luoghi d'interesse, come il ONH o vasi sanguigni nella retina. Quindi posizionare il mouse per ottenere un follow-up SD-OCT dalla stessa regione e assicurarsi di includere i punti di riferimento stessi identificabili.
- Mappatura nella misura dell'iniezione sull'immagine del fondo
- Eseguire post iniezione volume rettangolare OCT per confermare il successo dell'iniezione. Seguire il metodo descritto 3.6.
- Utilizzare la funzionalità di pinza nel software per identificare il punto di flesso al bordo della retina distaccata da un certo numero di b-scan che abbracciano l'intera immagine OCT. Utilizzare il metodo per aprire pinze descritti 4.1.4.
- Registrare le immagini del fondo con percorso mappato del OCT b-scan e posizione di corrispondente pinza sull'immagine del fondo, che corrisponde alla sua posizione.
- Compilare tutte le immagini del fondo in un'immagine composita, incluse le posizioni di pinza, che si traduce in una mappa precisa del sito di iniezione, sull'immagine del fondo (esempio nella sezione risultati rappresentante Figura 5A).
5. intraoculare iniezioni
Nota: Dettagli sull'uso del RIS sono ulteriormente elaborate in un recente studio23.
- Preparazione di vetro aghi per iniezione
- Autoclave capillare tubi con filamenti in piccoli lotti, utilizzando il ciclo asciutto.
- Utilizzare una pipetta puller e messa a punto un programma che produrrà una punta di vetro con l'angolo più tagliente e un diametro nella gamma di 2-5 µm.
Nota: Un programma di passaggio di campione 5 che prodotto efficaci aghi sul nostro estrattore pipetta è mostrato nella tabella 1. - Conservare gli aghi di vetro tirato in un vaso di ago pipetta sterile a temperatura ambiente.
- Riempire l'ago per iniezione con la soluzione desiderata per iniezione
- Montare l'ago nel supporto dell'ago, lasciando circa 5/8" che si sporgono oltre l'estremità del supporto.
Nota: A distanza inferiore a 5/8" renderà difficile raggiungere la soluzione di iniezione per riempire l'ago, perché il supporto dell'ago non si adatta facilmente nell'apertura di provette da 0,2 mL. Inoltre, avendo l'ago sporgere più di 5/8" risultati significativamente più grande oscillazione o precessione della punta, rendendo tempo reale imaging difficile dato che la punta lascia il piano focale o il campo visivo (FOV), durante il tentativo di bucare l'occhio. - Preparare la soluzione per iniezione in una provetta sterile 0,2 mL. Aggiungere un 01:10 diluizione di solfato sterile della fluorescina (10 mg/mL in PBS 1X) per la soluzione di iniezione per ottenere una concentrazione finale di fluorescina a 1 mg/mL.
Nota: L'esatto colorante usato è specifico per l'utente e può essere tutto ciò che è non tossico e visibile ad occhio nudo sotto illuminazione a luce bianca per facilitare il posizionamento preciso della punta dell'ago a livello del RPE e spazio subretinal. - Visualizzare l'ago attraverso il microscopio stereo mentre usando le manopole di controllo del micromanipolatore di 3 assi per posizionare l'ago in modo che è allineato con il centro del tubo contenente la soluzione di iniezione per essere utilizzato per riempire l'ago.
- Guidare con attenzione la punta dell'ago nel tubo di 0,2 mL fino a quando la punta dell'ago è sommerso nel liquido. Aspirare il volume desiderato di iniezione liquido (ad es. 1 µ l) nell'ago necessaria per una singola iniezione. Mantenere la soluzione rimanente nel tubo messo in ghiaccio.
- Montare l'ago nel supporto dell'ago, lasciando circa 5/8" che si sporgono oltre l'estremità del supporto.
- Preparare l'animale per l'iniezione
Nota: il microscopio RIS è tenuto pulito ed è un sistema senza contatto. La piastra riscaldante è coperto con un tampone pulito adsorbente e gli aghi sono sterilizzati in autoclave prima di essere tirato. Dopo che sono tirati da una striscia di metallo riscaldata auto-sterilizzazione, sono tenuti in una camera sterile chiusa progettata per contenere aghi di vetro tirato. Gli aghi sono curati solo con le mani guantate e cura viene utilizzato per evitare di toccare la punta dell'ago mentre montarlo con il titolare. Le soluzioni iniettate sono preparate utilizzando una tecnica sterile e sono testate per contaminazione da striature un campione delle preparazioni virus su piastre di agar LB e incubarle tutta la notte a 37 ˚ c.- Pesare l'animale (g) per determinare la dose appropriata di anestetico analgesico.
- Amministrare anestetico (soluzione al 2,5% di alcool nel buffer 2,2,2-tribromo (Avertin)) tramite l'iniezione intraperitoneale (IP).
- Applicare immediatamente le droghe anticolinergiche (ad esempio, cyclopentylate) in entrambi gli occhi per dilatare le pupille.
- Tagliare i baffi dell'animale e l'animale usando orecchio punch o altro metodo il numero.
- Lavare l'occhio e la zona circostante con betadine diluito.
Nota: Evitare che qualsiasi soluzione intorno al naso, poiché ciò può comportare annegamento accidentale. - Posizionare il mouse sul tappetino riscaldamento, mantenuto a 39 ˚ c, in tasca per mouse argilla di modeler pre-modellato con l'occhio deve essere iniettato verso l'ago.
- Assicurarsi che il mouse non risponde usando una prova di pizzico del piede posteriore.
- Esecuzione di iniezione subretinal
- Usare un paio di pinze sterili iris smussato per indurre delicatamente la proptosi del globo posizionando le punte della pinza alle 7 e 10 posizioni sulle palpebre mentre si spinge verso il basso e aperto allo stesso tempo.
- Utilizzare le pinze per persuadere le palpebre sotto il globo oculare a tenerlo fuori dalla presa di corrente durante il processo di iniezione.
Nota: Animali 10 a 14 giorni di vita spesso tenere l'occhio dalla presa di corrente più facilmente di più vecchi animali. - Dirigere la punta dell'ago circa 1-1,5 mm sotto il bordo del limbus corneale e guidare con attenzione nell'occhio attraverso la congiuntiva fino a quando crea una depressione sclerale come l'ago penetra nel tessuto della sclera e consente la manipolazione dell'occhio.
- Ruotare l'occhio verso il basso con il micromanipolatore visualizzare la depressione sclerale attraverso la pupilla dilatata con il microscopio stereo di RIS.
- Applicare una goccia di gel occhi sterile o 1 x soluzione PBS e coprire con un vetrino coprioggetto sterile.
- Concentrarsi sulla depressione scleral creata dalla punta dell'ago (2-5 µm) e unità l'ago avanti fino a un picco acuto delle forme retina al sito di iniezione.
- Ruotare l'ago utilizzando il titolare fino a quando la punta di fori attraverso la sclera e la fluoresceina nell'ago è visibile sotto la retina nelle immediate vicinanze del monostrato di cellule RPE.
- Guidare la punta dell'ago, quindi è tangente al globo e quindi attivare la pompa di iniezione con il pedale footswitch.
- Dopo che è stato consegnato il volume desiderato (0,5-1 µ l) per lo spazio subretinal, ritirare l'ago e controllare se la vescichetta è stabile e che il fluido non ci siano perdite fuori del sito di iniezione, che è il primo criterio di un'iniezione di successo.
Nota: Mantenere un diametro di punta adeguata (2-5 micron di diametro) è fondamentale per evitare perdite dal sito di iniezione. - Posizionare l'animale sulla piattaforma imaging dello strumento OCT. Seguire le indicazioni per HR-SD OCT Imaging per registrare un'immagine di volume rettangolare.
- Confermare che il liquido iniettato si trova nello spazio subretinal e salvare le immagini per la determinazione del limite della vescichetta.
- Rimuovere l'animale dal supporto e applicare un'ampia quantità di pomata antibiotica agli occhi iniettati.
- Metti l'animale su un blocchetto di riscaldamento fino a quando non recupera completamente, quindi inserire nuovamente la gabbia originale da dove venisse.
Nota: I nostri animali sono solitamente iniettati prima dello svezzamento, pertanto gli animali devono essere restituiti alla gabbia con la madre.
- L'entità della vescichetta subretinal utilizzando strumenti di OCT strumento software di mappatura.
- Ottenere un'immagine di volume rettangolare OCT, utilizzando i metodi descritti in precedenza, della vescichetta e posizionarlo per includere un simbolo riconoscibile all'interno dell'occhio come la ONH.
Nota: Registrazione 90 b-scan funziona bene per il mapping la vescichetta, ma poteva essere utilizzati a seconda della risoluzione desiderata. - Aggiungere una singola pinza alla figura e posizionarlo presso il punto di flesso dove la retina si stacca dalla RPE e coroide.
Nota: Il software esegue automaticamente il mapping di un punto corrispondente ad una linea sull'immagine del fondo che rappresenta la pinza e il b-scan in corso di valutazione. - Catturare lo schermo dopo la disposizione delle pinze e compilare le immagini per mappare in modo efficace il bordo della vescichetta di iniezione sull'immagine del fondo, che associa proprio il sito di iniezione. Salvare l'immagine compilata per riferimento aiutare a localizzare le regioni di interesse durante la formazione immagine di follow-up.
Nota: In alternativa, i dati di pinza possono essere salvati, rispettato e tracciati utilizzando un metodo simile per set di dati 3D plotting di spessore ONL.
- Ottenere un'immagine di volume rettangolare OCT, utilizzando i metodi descritti in precedenza, della vescichetta e posizionarlo per includere un simbolo riconoscibile all'interno dell'occhio come la ONH.
- Iniezione intravitreale
- Posizionare la punta dell'ago usando un simile approccio chirurgico come iniezione retinica sub, tranne per il fatto che l'ago è guidato interamente attraverso la sclera a pars plana circa 0,25 mm dietro il limbus cornea e nel corpo vitreo.
- Dopo il posizionamento dell'ago, è possibile applicare l'impulso di iniezione con il comando a pedale.
Nota: Si osserva una rapida diffusione del colorante fluoresceina in tutto il vitroso dell'oculare, riempiendo l'apertura della pupilla dilatata con fluorescenza.
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Representative Results
Valutazione della presenza, tasso e uniformità del modello di degenerazione retinica per esterno
Misurazioni della ONL sono stati registrati dall'OPL a Olmo, definire i limiti di ONL utilizzando lo strumento pinza fornito nel software dello strumento. L'obiettivo era di mappare la progressione della degenerazione retinica esterna in un modello murino di adRP parzialmente umanizzato. Immagini comparabili da un C57BL/6(J) di controllo mouse e un mWT hC1/hC1 / / / modello del topo di mWT, esprimendo due copie dei geni mutanti umani asta opsina (RHOP347S), sono stati indicati per esibire sia i risultati retinici di controllo e quelli di una grave e rapidamente progressiva condizione degenerativa della retina. Il 3-settimana-vecchio adRP (hC1 x BL/6(J)) animale, avendo una sola copia del gene mutante umano RHOP347S e due copie dei geni del mouse WT RHO , era vicino a spessore normale ONL. Tuttavia, il follow-up HR-SD-OCT scansioni a 10 e 37 settimane ha dimostrato progressivo temporalmente e spazialmente uniforme degenerazione retinica che ha provocato circa il 60% perdita dei fotorecettori riconosciuto come ONL diradamento nel corso di questo lasso di tempo. In hC1 x BL/6(J) adRP modello, la degenerazione retinica ha una costante di tempo approssimativo (1/e) di 13 settimane. Gli animali omozigoti hC1, con due dosi del transgene umano mutante tossico del mouse sullo sfondo WT RHO , soffrono una degenerazione molto più rapida, come dimostrato dalla vasta assottigliamento retinico e la perdita essenzialmente completa di tutti i fotorecettori di 3 settimane di età (Figura 2).
La misura ONL è solo una componente di normalità retinico esterno come un indice di vitalità del fotoricettore. L'OSL di fotorecettori e del segmento segmento interno/esterno (IS / OS) linea o ellissoide fornire prove a sostegno della vitalità del fotoricettore e la funzione. I confronti in animali che sono stati allevati per contenere uno (N129R - x 129R-) o due (2HRho 1T1T) copie (dosi) dei geni umani WT RHO sullo sfondo knockout mouse WT RHO sono stati misurati per lo spessore della retina esterna. In topi con due copie del gene umano di WT RHO rispetto ai topi con la sola copia del gene umano è stato osservato un aumento statisticamente significativo di ~ 8 µm nella ONL. In topi con due vs una copia del gene umano di WT RHO sullo sfondo knockout mouse WT RHO è stato osservato un aumento statisticamente significativo di ~ 5 µm nell'OSL. Nella Figura 3è riportato un esempio di come sono state fatte misurazioni ONL e OSL. L'alta risoluzione delle immagini catturate con il sistema HR-SD-OCT consentono misurazioni precise della ONL o OSL permettendo discriminazione delle piccole differenze con solida affidabilità statistica nei modelli del mouse WT RHO umanizzati.
Gamma di chirurgica risultati dettagliata entro ottobre quando tentativo Subretinal iniezione
HR-SD-OCT valutazione delle iniezioni subretinal tentate ha prodotto una varietà di esiti. In primo luogo, l'esperienza più comune era la conferma che il liquido iniettato è stato recapitato correttamente all'interno dello spazio sub-retinico. L'apertura dello spazio subretinal implicito (che chiude durante lo sviluppo) ha creato una vescichetta che poteva essere chiaramente visualizzata sia nella visualizzazione face it di HR-SD-OCT e nelle immagini b-scan. Il fluido IPO-riflettente confinava con la retina neurale di sopra e lo strato di cellule RPE iper-riflettente ancora contrario a BM, sotto (Figura 4). La misura dell'iniezione subretinal potrebbe essere determinata se l'animale è stato ripreso da HR-SD-OCT immediatamente dopo l'iniezione (Vedi sotto). In secondo luogo, potrebbe verificarsi l'iniezione nello spazio della coroide (sotto BM) piuttosto che nello spazio subretinal. Ciò ha provocato uno strato iper-riflettente (RPE) delimitazione la cupola della regione fluido spostato della retina, e non iper-riflettività al limite posteriore dell'occhio nei PTOM b-scan. Terzo, un altro risultato potenziale che poteva verificarsi durante il tentativo di iniezione subretinal era una schisi retinica (spaccare) a strato delle fibre nervose. Questo risultato ha reso un'anatomia normale retina esterna, ma lo strato interno della retina incapsulato la vescichetta, che può o può non hanno invaso il vitroso. In linea di principio, un tale modello di schisis potrebbe verificarsi con iniezione ovunque entro le laminazioni di retina neurale corretta, ma abbiamo visto solo tra schisi strato di fibre nervose fino ad oggi. In quarto luogo, un'iniezione intravitreal può anche accadere, che non influisce sulla personalizzazione di Office. Tutti i questi fallimenti dovuti l'iniziale errato posizionamento della punta dell'ago di vetro, o forse qualche piccolo movimento dell'ago durante l'iniezione, a causa della testa di pressione del dispositivo di iniezione di flusso switched.
Che caratterizza la posizione di iniezione Subretinal
Un fattore critico nel determinare l'efficacia o la tossicità delle terapie del candidato è la capacità di confrontare aree retiniche che hanno ricevuto vettoriale vs quelli che non hanno. Siamo indirizzati sforzi significativi nello sviluppo di un mezzo per contrassegnare la regione della retina partecipano le iniezioni subretinal in modo che durante gli esami di follow-up, potremmo identificare l'estensione areale della retina dove le terapie sono state applicate, e quindi dove trasduzione era fattibile. Oro dei criteri di rete ha permesso un elevato livello di fiducia nell'identificazione di regioni della retina sono stati o non sono state iniettate. Tuttavia, le particelle specifiche o la loro formulazione è sembrato essere tossica ed ha provocato una grave degenerazione retinica localizzata nel sito di iniezione subretinal di 24 ore dopo l'iniezione (dati non mostrati). Di conseguenza, abbiamo sviluppato un metodo alternativo di mappatura del sito di iniezione direttamente dai dati di imaging HR-SD-OCT. Un metodo per identificare con precisione i confini del sito di iniezione è stato sviluppato utilizzando gli strumenti di misurazione (pinze) nel pacchetto software dello strumento (Figura 5). Potremmo identificare il bordo della vescichetta proprio esaminando il b-scansioni individuali (dall'inferiore al superiore retina) utilizzate per creare l'immagine del fondo. Quando si inserisce una pinza nel punto dove la vescichetta interseca la retina allegata, la posizione della pinza viene automaticamente mappata nella corrispondente b-scansione dell'immagine del fondo face it presso l'esatta posizione lungo l'asse x, dove era la pinza sul b-scan. Ripetendo questo processo permette di seguire il bordo di vescichetta su un'immagine di fundus face it . Il processo di allineamento richiede che simili regioni della retina sono ripreso ogni volta, rispetto al nervo ottico costante potrebbe essere necessario essere ruotato per allineare i vasi sanguigni della retina da immagini multiple prima dati segregazione testa e le immagini. In seguito il processo di allineamento dell'immagine di iniezione post e le immagini successive di follow-up, la regione di iniezione era sovrapposta sopra la griglia di punti dati per identificare la posizione delle misurazioni all'interno della regione coinvolta nella separazione retinica. Questi dati potrebbero essere tracciati sulla mappa di superficie, che ha fornito uno strumento visivo per identificare i punti dati comprensivi dell'iniezione rispetto a regioni di fuori del sito di iniezione.
Mappatura dello spessore ONL in 3D
Infine, abbiamo registrare misurazioni il ONL, OSL o altri strati retinici da tutta la regione imaged della retina e quindi tracciare i dati utilizzando una trama superficiale (Figura 5). Sovrapponendo al confine la mappa del sito di iniezione consente la separazione dei due insiemi di dati, tra cui la regione iniettata e la regione che non è stata scollegata durante il processo di iniezione. Ulteriore elaborazione e analisi dei dati potrebbe quindi essere eseguita su questi due insiemi di dati per testare l'ipotesi che specifici agenti terapeutici possono salvare la degenerazione retinica o indurre tossicità. Potenzialmente, questo approccio consente sperimentale e controllo dati da raccogliere da un singolo occhio, confronto tra regioni iniettato vs non-iniettato dell'occhio stesso.
Figura 1 : Dispositivo UHR-SD-OCT. Viene visualizzato il dispositivo di HR-SD-OCT. Il rack strumento (A) contiene il monitor del computer (un), la tastiera e mouse (b), la scatola di interfaccia sonda (c), il motore di OCT (d), il computer (e), il dispositivo di controllo per il super luminescenti diodi (a infrarossi) (f) e la continuità di alimentazione (g). Il banco ottico (B) contiene la testa optical imaging della sonda (per retina di topo) (h), il manipolatore multi-asse (lineare e rotativi) (io) e un tema del mouse (j). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Progressiva degenerazione retinica esterna nel modello adRP parzialmente umanizzato come misurato da HR-SD-Oct. (A) immagini HR-SD-OCT della retina sono state ottenute per il modello adRP (hC1 x BL/6 (J)) alle diverse età, il controllo C57BL/6(J) a 14 settimane e la linea di hC1 omozigote mutante a 3 settimane. La retina esterna aveva un aspetto normale a 3 settimane nel modello adRP, ma ci era prova di assottigliamento progressivo ONL e disorganizzazione a e oltre 10 settimane di età. Di 37 settimane, (hC1 x BL/6(J)) dimostrato vasta degenerazione retinica esterna. Tutte le scansioni OCT erano nelle vicinanze del nervo ottico. (B) spessore ONL (in mm) lungo l'orizzontale asse tramite il nervo ottico è stato tracciato per controllo (C57BL/6(J)), hC1 e adRP animali di età diverse. C'era la perdita progressiva di spessore ONL nel modello adRP parzialmente umanizzato. ONL perdita era supera al 60% di 37 settimane di età. Barre di errore = errore standard della media. Barra della scala rossa = 200 µm e tutte le immagini sono la stessa scala. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Misure quantitative di strato nucleare esterno ed esterno lunghezza segmento utilizzando HR-SD-Oct. Mouse (A) le linee utilizzate per dimostrare misure ONL e OSL. Rappresentante OCT immagini da 2HRho1T/1T (2 dosi HRho) sulla priorità bassa del mouse RHO knockout) (pannello disinistra ) e N129R - x 129R-(una dose umana RHO sulla priorità bassa del mouse RHO knockout) (pannello didestra ). (B) è riportato un esempio di come le pinze sono state collocate per misurare la ONL (rosso) e OSL (blu). (C) i dati ottenuti da tre animali di ogni riga per spessore ONL è stato tracciato in formato grafico a barre che mostra il confronto della linea 2HRho1T/1T e N129R - x 129R-(Pannello di sinistra). La linea 2HRho1T/1T ha ~ 8 µm spessore ONL. Per illustrare le differenze di OSL, misurazioni multiple (sette) sono state fatte da un b-scan da ogni linea di mouse da Olmo a BM come in B (linea blu) in 9-settimana-vecchi animali (pannello didestra ). Questo hanno dimostrato una differenza di ~ 5 µm nell'OSL tra animali con 1 vs 2 copie del gene di HRho. ONL sia le misure OSL erano statisticamente significative, ONL p-valore = 1.7 e-5 e OSL p-valore = 6.4e-5. Barre di errore = errore standard della media. Barra della scala rossa = 100 µm entrambe le scansioni b in 3A hanno la stessa scala, 3B è ingrandita a migliorare chiarezza degli strati retinici e a fornire una dimostrazione qualitativa di come sono state acquisite le misurazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Tipi di iniezioni intraoculari in topi identificati da HR-SD-Oct. (A). A (hC1xBL/6(J)) mouse è stato iniettato con ~ 1 µ l di liquido mediante iniezione di Inferonasal transcleral transchoroidal. La separazione retinica risultante è visto come la verde regione inferiore destra dell'immagine face it , creando un bordo tagliente all'avanguardia di vescichetta sul lato destro dell'immagine. L'immagine di fondo di OCT di un sito di iniezione esibisce solo sottili differenze dipendendo dalla posizione della cavità riempita fluida, perché l'immagine è una raccolta di tutte le b-scan dall'intero spessore della retina. Inoltre, la vescichetta di iniezione cambia la distanza della superficie retinica dal copricapo di OCT, producendo un'area sfocata al sito di iniezione. (B) l'OCT b-scan di un iniettato retina è dimostrato. Il ONH è etichettato. (C) A iniezione subretinal è dimostrato. Il ONH è etichettato, e frecce nell'immagine face it (pannelli di destra) indicano il bordo posteriore del distaccamento. (D) A coroidica iniezione è ha dimostrato con un prospetto chiaro (spostamento verso l'alto) dello strato RPE (iper-riflettente curva) del bordo inferiore della retina (frecce) e significativa perdita di iper-riflettività del RPE e coroidico strati sottostanti la liquido iniettato. Confrontare le frecce nelle immagini (C vs D). Schisi retinica (E) A sono dimostrato vicino strato delle fibre nervose. Osservare la molto sottile membrana iper-riflettente che incapsula il liquido iniettato, mentre la retina rimane attaccato a RPE. Sottili differenze tra i tre distaccamenti differenti possono anche essere visualizzate nelle immagini face it (C, D ed E). Il distacco subretinal ha un bordo che è difficile da visualizzare (frecce in C), mentre l'iniezione coroidica crea un cerchio riflettente iper offuscata all'avanguardia della vescichetta, e la schisi retinica sono evidente dalla delimitazione marcata della sua Leading edge (E). Entrambi rosso scala bar = 200 µm in 4B. Tutte le immagini 4B attraverso 4E vengono scalati ugualmente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Mappatura e quantificare retinico esterno modifiche dopo l'iniezione Subretinal. Un metodo è stato sviluppato per identificare le aree di interesse durante l'esame di follow-up di topi che avevano iniezione subretinal del vettore, con 3D-stampa delle misure ONL dal b-scan multipli OCT. Un animale 2HRho1T/1T è stato iniettato con un virus adeno-associato self-complementari che esprimono GFP sia il ribozima hammerhead candidato di piombo (scAAV-GFP ad6 hhRz 725) (occhio OS) in una schermata di tossicità. (A) Imaged immediatamente successivo, l'estensione areale dell'iniezione è stato mappato inserendo calibri all'avanguardia della vescichetta nel punto dove i segmenti esterni separano da RPE in b-scan (pannello di sinistra (rosso pinza)). La posizione dello strumento pinza viene automaticamente associata all'immagine del fondo, e questo è ripetuto e compilato per b-Scan come molti come necessario, che dipendono la risoluzione desiderata (ogni 5th scansione in (A) (pannello di destra)). Gli studi successivi di OCT (ogni 2 settimane) ripreso la stessa regione della retina per consentire la sovrapposizione; il ONH e vasi sanguigni retinici sono punti di riferimento per facilitare le regolazioni cartesiane o rotazionale. L'intera regione della retina è stata misurata per spessore ONL fornito ai limiti richiesti (OPL ed ELM) erano visibili. (B) per mappare la lunghezza ONL sopra la superficie iniettata le posizioni di pinza (colorati) sono ancora mappate sull'immagine del fondo e compilate in un'immagine composita. Ogni 5th b-scan dalle immagini OCT è stata misurata con pinze incorporati fino a dieci punti attraverso la retina. (C) immagini pre- e post-compilate vengono ruotate, utilizzando software di imaging per allineare il sistema vascolare retinico, che permette i punti dati all'interno della retina distaccata regione retinica per essere identificato dalla sovrapposizione di immagini e separate. Set (D), i dati viene mappato in un formato di tabella, identico per la matrice dell'immagine del fondo e divisi in due gruppi (misure all'interno la vescichetta (riflessi rossi) e quelli che non sono). (E) dati sono presentati utilizzando una feature di plottaggio superficie 3D, che permette la visualizzazione di spessore ONL sull'intera regione imaged. Ciò consente la valutazione di differenze quantitative fra regioni iniettate e non iniettato dell'occhio. Il crepaccio nella trama 3D (E) fornisce un modo conveniente per separare il set di dati di misurazioni ONL all'interno della regione della retina distaccata dalla regione che è rimasto attaccata immediatamente dopo l'iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: programma utilizzato per tirare gli aghi di vetro. Parametri del programma per raggiungere aghi di vetro utili per subretinal di trans-sclerale, approccio transchoroidal.
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Discussion
HR-SD-OCT fornisce un metodo semplice per la caratterizzazione dei potenziali modelli animali della malattia umana per determinare la loro utilità nella prova terapeutica potenziale. La capacità di rapido e affidabile caratterizzano un potenziale modello animale della malattia umana è fondamentale per il processo di scoperta della droga terapeutica (ad es., sostituzione terapia genica, la terapia genica atterramento ribozima o shRNA, terapia genica combinato). HR-SD-OCT fornisce un metodo semplice, rapido e non invasivo per valutare la salute della retina che può essere utilizzato per caratterizzare e monitorare la progressione della degenerazione retinica in quasi qualsiasi modello di mouse. Le immagini OCT possono essere utilizzate per ottenere misurazioni della totalità dei diversi strati della retina, che possono fornire una valutazione dettagliata di una degenerazione retinica esterna (fotorecettori) nel corso del tempo o l'impatto di tentativi terapeutici di salvataggio sulla degenerazione o misura o cinetica timeline. HR-SD-OCT può essere utilizzato anche per valutare la tossicità di vettore trasportato o materiali. L'impatto più significativo su un programma di ricerca di degenerazione retinica del fotoricettore è la capacità di effettuare misurazioni raffinati di ONL nel tempo in animali vivi. Uno possibile tracciare una linea temporale di degenerazione retinica per estrarre una costante di tempo, che è un primo passo fondamentale per valutare l'efficacia e la tossicità di terapeutica candidato negli stessi modelli sopra una finestra temporale di opportunità terapeutica. Questa tecnologia consente anche considerevoli risparmi di risorse preziose (animali e tempo) rispetto l'istologia classica endpoint consentendo il ricercatore per un per identificare le anomalie nella coorte animale prima di entrare in uno studio ed eliminando gli animali che non soddisfano criteri sperimentali (ad esempio, consegna di subretinal successo).
La necessità di consegna preciso di certo terapeutica nello spazio subretinal dell'occhio del mouse è impegnativa, e HR-SD-OCT fornisce una conferma visiva accurata delle iniezioni subretinal successo come criterio per l'inclusione in corso degli animali nella disegno di studio pre-clinico. Vasto sforzo è richiesto di seguire frequentemente animali iniettati in studi di terapia genica nel corso del tempo, dal momento che questi modelli spesso simulano malattie degenerative retiniche umane dove malattia timelines emergono nei decenni. Numerosi esami di follow-up sono necessari per determinare l'efficacia terapeutica o per valutare la tossicità. Una soluzione a questa drammatica sfida è di avere la capacità di identificare e rimuovere gli animali da disegni di studio, che sono guasti chirurgici per la consegna del vettore terapeutico. La capacità di fornire un'iniezione di successo per un tecnico qualificato con anni di esperienza si è avvicinato 90% se l'iniezione e un occhio per animale e circa 80% di successo se l'iniezione di entrambi gli occhi. Con questo livello di efficienza, rimozione dal disegno dello studio degli animali con iniezioni infruttuoso è vantaggioso per test di ipotesi. Questo non solo consente di risparmiare tempo critico, ma permette anche per i risultati più coerenti e prevedibili. Inoltre, HR-SD-OCT permette di diminuire il numero di animali necessari per qualsiasi un esperimento consentendo gli stessi animali da seguire nel corso del tempo, che fa diminuire la variabilità di un animale in entrambi sperimentali e gruppi di controllo e permette più valutazione statistica robusta di ipotesi circa l'efficacia e la tossicità di terapeutica di candidati potenziali.
L'estensione della copertura della retina tramite un'iniezione subretinal in genere non è 100%, che può essere tossico31,32,33,34. Quindi, la capacità di distinguere tra regioni trasdotte e non trasdotte è fondamentale per la corretta sperimentazione delle ipotesi di salvataggio e di tossicità per un determinato candidato terapeutico. L'uso creativo di strumenti software disponibili permette precisa mappatura delle iniezioni subretinal nell'occhio del mouse. La formazione immagine immediata dell'occhio iniettato fornisce direzione per formazione immagine di follow-up per le regioni di interesse e la possibilità di confrontare le regioni che sono state trasdotte alle regioni che non sono state trattate all'interno del globo stesso. A seconda della precisione di mapping desiderato, questo processo può essere eseguito per ogni b-scan o periodicamente campionamento dall'insieme del b-scan raccolte immediatamente dopo l'iniezione e la compilazione di tutte le immagini del fondo in una singola immagine utilizzando software di grafica così che il lineare a tratti bordo continuo viene accuratamente mappato nell'immagine del fondo. Confronto tra le immagini immediatamente dopo iniezione di follow-up immagini richiede che le immagini siano allineati in modo che posizioni di misura possono essere mappati sull'immagine del fondo, e i punti dati possono essere suddivise in sede di iniezione e regioni non-iniettato della retina. Il mapping della testa del nervo ottico e i vasi sanguigni della retina può essere effettuato anche utilizzando la stessa metodologia, che agevola l'orientamento dell'occhio quando si tenta di allineare le immagini post-iniezione con le immagini successive di follow-up. Questa informazione utilizzabile in successive di formazione immagine per identificare l'area della retina dove si era verificato l'iniezione. Naturalmente, quando gli animali vengono sacrificati, la posizione dell'espressione di EGFP, trasportato da un vettore AAV contenente anche un gene terapeutico del candidato (ad esempio, ribozima), può essere utilizzata anche per confrontare la posizione di trasduzione con la superficie determinata da mapping dell'immagine che si basa sulla posizione dei vasi sanguigni. Ciò permetterà l'identificazione di diffusione del vettore nello spazio subretinal successivamente chiuso di là di zone di distacco anatomica.
Il nostro successo con l'uso di oro NPs per etichettare la vescichetta subretinal è stata limitata a causa della tossicità indotta dall'utilizzo dei materiali. Vorremmo incoraggiare ulteriori indagini su tali materiali per etichettare la misura delle vescichette subretinal, se preparazioni alternative (dimensioni, modifiche superficiali variabili) possono essere trovate che non inducono tossicità.
HR-SD-OCT fornisce un'enorme quantità di informazioni con significativamente meno tempo e risorse e può essere quantificata per fornire ulteriori informazioni sull'efficacia e la tossicità di terapeutica potenziale rispetto alle metodologie tradizionali come l'istologia. L'utilizzo di questa tecnologia consente al ricercatore di alleviare uno dei gravi impedimenti in preclinici retinica droga scoperta35. Il mouse RIS e HR-SD-OCT sono potenti strumenti per aiutare gli studi di terapia di gene retinico preclinici come componente del nostro programma di RNA Drug Discovery. Questi strumenti possono essere ampiamente applicati.
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Disclosures
Rapporti commerciali: MCB: nessuno; JMS: nessuno. L'imaging system (RIS)23 utilizzato in questo studio di retinico è un nuovo dispositivo di notevole utilità per qualsiasi gruppo che cerca di condurre studi di consegna di terapia genica in topi, roditori o piccoli animali. Mentre gli autori non hanno nessun conflitto di dichiarare nei confronti di questo dispositivo in questo momento, l'Università di Buffalo - SUNY e il Veterans Administration dispone dei diritti di proprietà intellettuale e può cercare di commercializzare questo strumento in futuro.
Acknowledgments
Questo materiale si basa su lavori sostenuta, in parte, dal Department of Veterans Affairs (VA), Veterans Health Administration, ufficio di ricerca e sviluppo (laboratorio ricerca e sviluppo biomedico) (Grant Merit VA 1I01BX000669). JMS è impiegato, in parte, come il personale medico-scienziato, oftalmologia, da WNY VA; MCB è impiegato, in parte, da VA WNY. Lo studio è stato condotto presso e in parte supportato da, il sistema del Healthcare di New York di Veterans Administration Western (Buffalo, NY). Contenuti non rappresentano le opinioni di Department of Veterans Affairs o di governo degli Stati Uniti. Supportati anche, in gran parte, di NIH/nia R01 concedere EY013433 (PI: JMS), NIH/nia R24 concedere EY016662 (UB Vision infrastruttura Center, PI: M macellazione, direttore - biofotonica modulo: JMS), una sovvenzione illimitata per il dipartimento di Oftalmologia/Università presso Buffalo da ricerca per prevenire la cecità (New York, NY) e una sovvenzione dalla Fondazione Oishei (Buffalo, NY). Riconosciamo il dono di hC1 transgenici RHOP347S linea e il mouse dell'esone 1 RHO knockout da Dr. Janis Lem (Tufts New England Medical Center, Boston, MA) e il dono del modello transgene NHR-E nella condizione eterozigotica sul esone 2 RHO knockout priorità bassa del mouse dalla d. ssa G. Jane Farrar e Peter Humphries (Trinity College, Dublino, IRE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL6 (J) | Jackson Laboratories | 664 | |
| N129R- | N/A | N/A | |
| 2HRho 1T/1T | N/A | N/A | |
| Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT) | Bioptigen | 90-R2200-U1-120. | |
| Retinal Imaging System (RIS) | In-house | N/A | |
| Stemi 2000C Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co | p-97 | |
| MMN-33 micro manipulator | Narishige USA | MMN-33 | |
| PLI-100 micro injector | Harvard Apparatus | 64-1736 | |
| Micropipette Holder (Rotating) | In-house | N/A | |
| Micropipette Storage Receptacle | World Precision Instruments Inc. | E210 | |
| Borosilicate glass capillary tubes 1.5-1.8 X 100mm, | Harvard Apparatus | 30-0053 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | SIGMA Aldrich | T48402-25G | |
| Tert-amyl Alcohol | SIGMA Aldrich | 240486-100ML | |
| Atropine Sulfate Ophthalmic Solution, USP 1% | Akorn Inc. | NDC 17478-215-05 | |
| Goniovisc | BioVision Limited | NDC 17238-610-15 | |
| Cyclopentolate Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 2% | Akorn Inc. | NDC 17478-097-10 | |
| Gentamicin Sulfate Ointment USP, 0.1% | Perigo | NDC 45802-046-35 | |
| Systane Ultra | Alcon Laboratories, Inc. | 9006619-1013 | |
| Tetracaine Hydrochloride | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-920-64 | |
| DPBS | Gibco Life Technologies | 14190-136 | |
| Virus Preparations | ViGene /UNC | N/A | |
| Gold nanorods | NANOPARTz | D12M-850-1.75 | |
| Fluorescein Sulfate AK-FLUOR 25% | Akorn Inc. | NDC 17478-250-20 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-A | |
| Forceps | Milton | 18-825 | |
| Needles 30 guage | Beckton Dickenson | W11604 | |
| Syringes | Beckton Dickenson | 309659 | |
| Bioptigen software Package | Bioptigen | N/A | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5% | Akorn Inc. | NDC 17478-263-12 | |
| Windows Excel | Microsoft | N/A | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Scale | Mettler | ||
| Scissors | World Precision Instruments | ||
| Ear punch | Nat’l band | ||
| CL 100 Light source | Welch Allyn | CL100 | |
| Nitrogen Gas | Jackson Welding Supply | N/A | |
| Heated Water bath | Neslab | RTE-140 | |
| Heating plate | In House | N/A | |
| Heating mat | Cincinnatti Sub Zero | 273 | |
| Clay mouse holder | Plast.i.clay American Art Clay Co. | N/A | |
| Betadine | MedLine | NDC53329-938-06 | |
| Cotton Tip Applicators | American Health Service | Ctag | |
| EtOH 70% | Fisher Scientific | BP2818-100 | |
| Gloves Nitrile | VWR | 89038-272 | |
| Diagnosys ERG Color Dome instrument | Diagnosys Inc. | D125 | |
| Contact lenses | In-house | N/A | |
| Diagnosys Software | Diagnosys Inc. | N/A | |
| Origin 6.1 software | OriginLab Corp. | N/A | |
| Reference electrodes | Ocuscience | F-Thread Electrode (DTL) 24” |
References
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