Summary
עבודה זו מתארת פרוטוקול מבוסס FACS המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד.
Abstract
Pericytes הם תאים multipotent perivascular המציגים הטרוגניות באיברים שונים או אפילו בתוך הרקמה זהה. בשרירי השלד, יש לפחות שתי תת-אוכלוסיות (הנקראות סוג I וסוג II), המבטאות סמנים מולקולריים שונים ויש להן יכולות הבחנה שונות. באמצעות NG2-DsRed ו Nestin-GFP עכברים פעמיים מהונדס, סוג אני (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) וסוג II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) פריסיטים היו מבודדים בהצלחה. עם זאת, הזמינות של עכברים אלה פעמיים מהונדס מונע את השימוש הנרחב של שיטה זו טיהור. עבודה זו מתארת פרוטוקול חלופי המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד. פרוטוקול זה מנצל את הקרינה המופעל תא מיון (FACS) טכניקה מטרות PDGFRβ, ולא NG2, יחד עם האות Nestin-GFP. לאחר בידוד, הקלד אני ו tyPe II pericytes להראות מורפולוגיות שונות. בנוסף, סוג I ו percytes סוג II מבודדים בשיטה חדשה זו, כמו אלה מבודד מן העכברים מהונדס פעמיים, הם אדיפוגניים ו myogenic, בהתאמה. תוצאות אלו מראות כי פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לבודד subpopulations pericyte של שרירי השלד ואולי מתוך רקמות אחרות.
Introduction
ניוון שרירים הוא הפרעה ניוונית שרירית כי אין טיפולים יעילים עד כה. פיתוח טיפולים המקדמים התחדשות רקמות תמיד היה עניין רב. התחדשות רקמות ותיקון לאחר נזק תלוי בתאי גזע תושב / תאים אב 1 . תאי לוויין מחויבים תאים מבשר myogenic התורמים התחדשות שרירים 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . השימוש הקליני שלהם, לעומת זאת, הוא הקשו על ידי הגירה מוגבלת שלהם שיעור הישרדות נמוך לאחר ההזרקה, כמו גם על ידי יכולת ירידה שלהם בידול לאחר הגברה במבחנה 8 , 9 , 10 , 11 . בנוסף satelliתאי T, שרירי השלד מכילים גם אוכלוסיות תאים רבים אחרים עם פוטנציאל myogenic 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , כגון טסיות הנגזרות גורם גדילה ביתא (PDGFRβ) תאים interstitial אינטראקטיביים. ישנן ראיות מראה כי שריר הנגזרות PDGFRβ תאים + מסוגלים להבדיל לתאי myogenic ולשפר פתולוגיה שריר לתפקד 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ בעיקר תוויות pericytes 21 , אשר תאים perivascular עם pluripotency 22 , 23 . בנוסף PDGFRβ, סמנים רבים אחרים, כולל Neuron-Glial 2 (NG2) ו CD146, משמשים גם אניDentify pericytes 21 . עם זאת, יש לציין כי אף אחד מהסימנים הללו אינו ספציפי ל- pericyte 21 . מחקרים שנערכו לאחרונה חשפו שני תת-סוגים של פריסיטים בשרירים, הנקראים סוג I וסוג II, המבטאים סמנים מולקולריים שונים ומבצעים פונקציות שונות 19 , 24 , 25 . ביוכימית, סוג אני pericytes הם NG2 + Nestin - , ואילו סוג II pericytes הם NG2 + Nestin + 19 , 24 . באופן פונקציונלי, סוג אני pericytes יכול לעבור בידול אדיפוגני, תורם הצטברות שומן ו / או פיברוזיס, ואילו סוג II pericytes יכול להבדיל לאורך מסלול myogenic, תורם התחדשות שרירים 19 , 24 , 25 . תוצאות אלה מראות כי: (1) סוג אני pericytes עשוי bE ממוקד לטיפול בהפרעות ניווניות שומן / פיברוזיס, ו (2) סוג II pericytes יש פוטנציאל טיפולי רב עבור ניוון שרירים. חקירה נוספת ואפיון של אוכלוסיות אלה דורשות פרוטוקול בידוד המאפשר הפרדה מסוג I ו percytes סוג II ברמה גבוהה של טוהר.
נכון לעכשיו, בידוד subpopulations pericyte מסתמך על NG2-DsRed ו Nestin-GFP עכברים מהונדסים פעמיים 19 , 24 . הזמינות של עכברים NG2-DsRed ואת האיכות של רוב הנוגדנים NG2 להגביל את השימוש הנרחב של שיטה זו. בהתחשב בכך שכל NG2 + pericytes גם להביע PDGFRβ בשרירי השלד 19 , 20 , 24 , אנו משער כי NG2 ניתן להחליף PDGFRβ לבידוד pericytes ו subpopulations שלהם. עבודה זו מתארת פרוטוקול מבוסס FACSמשתמש מכתים PDGFRβ ואת האות Nestin-GFP. שיטה זו היא פחות תובענית עבור החוקרים כי: (1) זה אינו דורש את הרקע NG2-DsRed ו (2) הוא משתמש נוגדנים PDGFRβ זמינים מסחרית, אשר מאופיינים היטב. בנוסף, הוא מאפשר בידוד סימולטני של סוג I ו- II pericytes בטוהר גבוה, ומאפשר חקירה נוספת של ביולוגיה ופוטנציאל טיפולי של subpopulations אלה pericyte. בעקבות טיהור, תאים אלה יכולים להיות גדלים בתרבות, המורפולוגיות שלהם יכול להיות דמיינו. עבודה זו גם מראה כי סוג I ו percytes סוג II מבודד באמצעות שיטה זו, כמו אלה מטוהרים מן העכברים מהונדס פעמיים, הם אדיפוגניים ו myogenic, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Wildtype ו Nestin-GFP מהונדס עכברים היו שוכנו במתקן החיות באוניברסיטת מינסוטה. כל הניסויים הניסויים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת מינסוטה היו בהתאם NIH מדריך לטיפול ושימוש של חיות מעבדה.
1. ניוון שרירים בודד בידוד התא
- להרדים עכברים בוגרים (6-10 שבועות, הן זכר והן נקבה) עם tribromoethanol (250 מ"ג / ק"ג, IP) ו לעקר את עור הבטן שלהם עם אתנול 70%.
הערה: Tribromoethanol שימש כאן במקום קטמין עבור הרדמה / המתת חסד, כמו ketamine ידוע אינטראקציה עם קולטני NMDA, אשר עלולה להשפיע על המחקר. - מניחים את העכברים במצב שכיבה להשתמש איזמל לבצע חתך אופקית על עור הבטן. לקלף את העור ביד, מושך בכיוונים מנוגדים לחשוף את השרירים hindlimb.
- קולקלא את השרירים משני hindlimbs באמצעות מלקחיים ומספריים. אחסן אותם ב סטרילי פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) בתוספת 1% פניצילין סטרפטומיצין (P / S) על הקרח.
- לשטוף את השרירים hindlimb גזור ב- PBS קר כקרח בתוספת 1% P / S פעמיים ולהעביר אותם צלחת סטרילית 10 ס"מ.
- בזהירות לנתח את העצבים, כלי הדם, ורקמות החיבור מן השרירים באמצעות מלקחיים ומספריים תחת מיקרוסקופ לנתיחה בהגדלה 2X.
- דק קוצצים את השרירים לחתיכות קטנות (1-2 מ"מ 3 ) באמצעות מספריים סטריליים להבים. אם יש צורך, להוסיף כמות קטנה של Dulbecco השתנה נשר בינוני (DMEM) כדי להבטיח כי השרירים לא יבשים.
- מכני לשבור את הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה דרך פיפטה 10 מ"ל סרולוגי 10 פעמים.
- הוסף טריים פתרון העיכול (DMEM בתוספת 0.2% סוג 2 collagenase) לתערובת. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות עם עדיןE-agitation ב 35 סיבובים / דקות.
- Triturate באמצעות מחט 18 G כדי homogenize את התערובת. ואז, צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ולאחר מכן resuspend גלולה 0.25% טריפסין / EDTA. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. חזור על צעד צנטריפוגה פעמיים נוספות.
- הוסף 10 מ"ל של DMEM בתוספת 20% בסרום שור עוברית (FBS) לפתרון צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה במאגר תמוגה תא דם אדום (155 מ"מ NH 4 Cl, 10 מ"מ KHCO 3 , ו 0.1 מ"מ EDTA).
- צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה במיון מיון (20 מ"מ HEPES, pH 7.0, 1 מ"מ EDTA, ו 1% BSA ב Ca / Mg 2 + חינם PBS, pH 7.0). סנן את התערובת באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר להשיג ההשעיה תא בודד.
- צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות. מחק supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של מיון המאגר.
- לספור אתמספר תא עם hemocytometer ו לדלל את ההשעיה תא בודד ל 5 x 10 6 / mL במאגר מיון.
2. תא מכתים ומיון
- הכן את הפקדים ואת המדגם כמתואר בטבלה 1 . כתם ההשעיה תא בודד עם נוגדנים בהתאמה על קרח במשך 30 דקות, כמתואר בטבלה 1 .
- צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות ולשטוף את הכדורים פעמיים עם מיון המאגר.
- הוסף DAPI לפתרונות תא בודד, כפי שצוין בטבלה 1. השתמש DAPI 5 מיקרוגרם / מ"ל DAPI (ריכוז סופי) עבור DAPI צבע אחד שליטה ו 1 מיקרוגרם / מ"ל DAPI עבור PDGFRβ-PE-FMO שליטה המדגם. שמור את כל הצינורות על הקרח לאורך הניסוי.
- הפעל את סדרן ואת התוכנה. סרוק והכניס שבב מיון 100 מיקרומטר כאשר תתבקש.
- בצע את ההגדרה האוטומטית ( כלומר, יישור שבב, כיול אגל, כיול זרם צד, ועיכוב מיון calibratiב) על ידי טעינת חרוזי ההתקנה אוטומטית כאשר תתבקש לעשות זאת.
- כאשר ההגדרה האוטומטית הושלמה, עבור לכרטיסייה "ניסוי", לחץ על "חדש" ובחר את "תבנית ריקה" מתוך "תבניות ציבוריות".
- תחת "הגדרות מדידה", הזן "DAPI" עבור "FL1", "Nestin-GFP" עבור "FL2" ו "PDGFRβ" עבור "FL3." בטל את הסימון של תיבות עבור "FL4" - "FL6".
- סמן את התיבות כדי להפעיל את הלייזרים 405, 488 ו- 561 ולחץ על "צור ניסוי חדש".
- בחר את "התחל פיצוי אשף" ולאחר מכן פעל לפי "אשף פיצוי" התוכנה מבקשת להגדיר את הפיצוי.
- טען את השליטה unstained ולחץ על "התחל". לחץ על "גלאי & הגדרות סף" ולהתאים את הרווח חיישן של FSC ו BSC גלאי למקום האוכלוסייה על הסולם.
- מוֹדָעָהרק את רמות הרווח של FL1-FL3 ערוצי הקרינה למקום אוכלוסיות שליליות בצד שמאל של היסטוגרמות. לחץ על כפתור "הקלטה" כדי להקליט את הנתונים.
- טען בודדים בצבע אחד אחד כאשר תתבקש. לחץ על "התחל והקלט" כדי להקליט את הנתונים. להתאים את השערים לאוכלוסיות חיוביות על היסטוגרמות. לחץ על "הבא".
- עבור אל "חישוב מטריקס" על הכרטיסייה "פיצוי" ולחץ על "חישוב" בלוח "חישוב פיצוי הגדרות" לבצע את הפיצוי. לחץ על "סיום" כדי לצאת מהאשף "פיצוי".
- טען את PDGFRβ-PE-FMO שליטה ולחץ על "התחל". צייר שער מצולע (שער A) סביב התאים של עניין תחת העלילה "כל האירועים".
- לחץ פעמיים בתוך שער A כדי ליצור מגרש ילדים. שנה את ציר Y ל- DAPI וצייר שער מצולע (שער B) סביב תאים חיים (DAPI) נמוכים . לחץ פעמיים על iNside שער B כדי ליצור מגרש הילד. לשנות את ציר ה- X כדי FSC-H ואת ציר Y ל- FSC-W ו לצייר שער מצולע (שער C) סביב singlets לחסל הכפולות.
- לחץ פעמיים בתוך שער C כדי ליצור מגרש ילדים. שנה את ציר ה- X ל- Nestin-GFP ואת ציר ה- Y ל- PDGFRβ-PE. לחץ על כפתור "הקלטה" כדי להקליט את הנתונים.
- טען את המדגם וחזור על הצעדים 2.11-2.12. לאחר ההקלטה, לחץ על "השהה" כדי לשמור על המדגם.
- הגדר את גבולות gating עבור PDGFRβ + ו Nestin-GFP + תאים המבוססים על PDGFRβ-PE-FMO שליטה. צייר השערים עבור האוכלוסייה PDGFRβ + Nestin-GFP - ו PDGFRβ + Nestin-GFP + אוכלוסיות.
- תחת "שיטת מיון", בחר "2-way צינורות" ולהקצות "PDGFRβ + Nestin-GFP - " ו "PDGFRβ + Nestin-GFP + " לתאי צינורות שמאל וימין, מחדשבצורה מדהימה. הרכבה מיון המיון מלא 15 מ"ל צינורות איסוף על הבמה אוסף ולחץ על "טען אוסף" כפתור ".
- לחץ על הלחצן "המשך" כדי לשמור על הדגימה פועלת. לחץ על "התחל מיון" כדי לאסוף PDGFRβ + Nestin-GFP - (סוג אני pericytes) ו PDGFRβ + Nestin-GFP + (סוג II pericytes) תאים.
3. לאחר מיון המיון
- צנטריפוגה תאים מיון ב 500 xg במשך 5 דקות, resuspend גלולה ב 1 מ"ל של מדיום pericyte (ראה טבלה חומרים ), ולספור את צפיפות התא באמצעות hemocytometer.
- סוג זרע אני ואת סוג II pericytes על פולי- D- ליזין (PDL) מצופה coverslips ב ~ 1 x 10 4 תאים / ס"מ 2 . לגדול במדיום pericyte במשך 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 .
- ביום 3, לבחון את המורפולוגיה pericyte (תחת בניגוד לעומת) אנדוגני Nestin-GFP ביטוי באמצעות מיקרו פלואורסצנטיהיקף (לייזר עירור: 488 ננומטר, מסנן עירור: 470/40 ננומטר, מסנן פליטה: 515/30 ננומטר). קחו תמונות תחת מטרה 20X (0.45 NA).
- החלף את המדיום pericyte עם בינוני adipogenic (MSC העכבר הבסיס + בינוני adipogenic תוספת גירוי) ו myogenic (DMEM + 2% בסרום סוס) בינוני ליזום adipogenic ו myogenic בידול, בהתאמה, כפי שתואר לעיל 20 . שנה את המדיום כל 2-3 ימים.
- תקן את התאים ביום 17 (14 ימים לאחר בידול אדיפוגני / myogenic) ב paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: זהירות, PFA הוא מסרטן. - ביצוע immunocytocochemistry נגד perilipin (סמן adipocyte) ו- S- myosin (בוגר myotube / myofiber בוגרת), כפי שתואר בפרסומים קודמים 19 , 20 .
- לשטוף את התאים קבוע 3 פעמים PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוספת חיץ חסימה (PBSבתוספת 5% סרום חמור, 3% BSA, ו 0.3% Triton X-100) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות.
- דגירה התאים עם antilodies perilipin (2 מיקרוגרם / מ"ל) ו / או אנטי- S- מיוזין (2 מיקרוגרם / מ"ל) נוגדנים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשטוף את התאים 3 פעמים PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- דגירה התאים עם Alexa 555 חמור נגד ארנבת (4 מיקרוגרם / מ"ל) ו / או Alexa555 חמור אנטי עכבר (4 מיקרוגרם / מ"ל) נוגדנים בטמפרטורת החדר למשך 1 שעות.
- לשטוף את התאים 3 פעמים PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הר תאים immunostained עם המדידה הרכבה המכיל DAPI (ראה את טבלת החומרים). בחן perilipin ו- S- ביטוי myosin באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (עירור לייזר: 543 ננומטר, עירור 540/45 ננומטר ו 600/50 ננומטר פליטת) ולקחת תמונות תחת מטרה 40X (0.60 NA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרמטרים של FACS, כולל עוצמת הלייזר ותגמול הערוץ, מתוקנים על סמך תוצאות הבקרה הבלתי מבוקרת ובקרות בצבע יחיד. PDGFRβ-PE-FMO שליטה משמש לקבוע את gating עבור האוכלוסייה PDGFRβ-PE + ( איור 1 א ). בין PDGFRβ-PE תאים, שתי אוכלוסיות המייצג Nestin-GFP + ו Nestin-GFP - תאים מופרדים בבירור ( איור 1 א ). גבולות Gating עבור PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + ו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - אוכלוסיות נקבעים על בסיס gating עבור PDGFRβ-PE + ו Nestin-GFP + ( איור 1 א ). גבולות אלה משמשים להגדיר ומיון PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (סוג II pericytes) ו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - (סוג אני pericytEs) תאים מן המדגם ( איור 1 ב ). מבודד PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - ו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + תאים חשבון עבור 9.5% ו 2.1% מכלל התאים פתרון תא בודד, בהתאמה.
סוג FACS מבודדים אני ואת סוג II pericytes להפגין הבדלים מורפולוגיים לאחר שלושה ימים בתרבות. סוג אני pericytes להציג מורפולוגיה אמביאידית, עם גופי תא עגול ותהליכים קצרים ( איור 2 ). סוג II pericytes, עם זאת, להראות מורפולוגיה מסועפת, המאופיינת על ידי גופים תאים קטנים ותהליכים ארוכים, רזה ( איור 2 ). בשלב זה, רוב סוג II pericytes להישאר Nestin-GFP + , בעוד סוג אני pericytes הם Nestin-GFP - ( איור 2 ).
בנוסף, הקלד I, אבל לא סוג II, pericyTES להבדיל peripipin- להביע אדיפוציטים לאחר 14 ימים במדיום adipogenic ( איור 3 ). סוג II, אבל לא להקליד אני, pericytes להבדיל לתוך S- מיוזין להביע מיוטובים לאחר 14 ימים במדיום myogenic ( איור 4 ). תוצאות אלו מצביעות באופן חזק על סוג pericytes אני adipogenic, ואילו סוג II pericytes הם myogenic.
איור 1 : גבולות הזזה ומיון מייצג. ( א ) חלקת פלואורסצנטי של PDGFRβ-PE-FMO שליטה, הוכחת PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - ו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + גבולות gating. ( ב ) נציג פלורסנט העלילה של המדגם מראה את ההפצה של PDGFRβ-PE + Nestin-GFP
איור 2: מורפולוגיה הביטוי Nestin-GFP במיון סוג I ו pericytes סוג II. מיון סוג אני ו per II סוג II היו seeded על coverslips וגדל בינוני pericyte במשך 3 ימים. סוג אני pericytes הראה תא גוף עגול, עם תהליכים קצרים, ולא אות אנדוגני GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (עירור לייזר: 488 ננומטר, עירור מסננים פליטה: 470/40 ננומטר ו 515/30 ננומטר, בהתאמה). סוג II pericytes הפגינו גופי התא הקטן, עם תהליכים ארוכים ודקים, ואת האות GFP אנדוגני חזק תחתמיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת אותן הגדרות. סולם בר = 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: בידול אדיפוגני של מיון סוג I ו percytes סוג II. סוג מסודר I ו- II סוג pericytes גדלו במדיום pericyte במשך 3 ימים. הם נבדלו אז במדיום אדיפוגני למשך 14 ימים. התאים היו קבועים ו immunostained עם נוגדן אנטי פריליפין ואחריו Alexa555 חמור אנטי ארנב נוגדן. Immunocytochemistry הראה כי סוג אני, אבל לא סוג II, pericytes הביע את סמן peripipin אדיפוציטים (אדום) תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (לייזר עירור: 543 ננומטר, עירור מסננים פליטה: 540/45 ננומטר ו 600/50 ננומטר, כבוד ). סולם בר = 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 : בידול Myogenic של סוג מיון אני וסוג II pericytes. מיון מסוג I ו II סוג pericytes גדלו במדיום pericyte במשך 3 ימים היו נבדלו אז במדיום myogenic במשך 14 ימים. התאים היו קבועים immunostained עם נוגדנים אנטי S- נוגדנים ו Alexa555 חמור נוגדנים עכבר. Immunocytochemistry הראה כי סוג II, אבל לא להקליד אני, pericytes הביע את myotube בוגרת / סמן myofiber S- myosiber (אדום) תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (לייזר עירור: 543 ננומטר, מסננים עירור ו פליטה: 540/45 ננומטר ו 600/50 ננומטר , בהתאמה). סולם בר = 50 מיקרומטר//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| צינורות | הַכתָמָה |
| שליטה ללא שליטה | ההשעיה תא בודד מן עכברים wildtype |
| DAPI שליטה בצבע יחיד (אי הכללת תאים מתים) | ההשעיה תא בודד מ wildtype עכברים + DAPI (5 מיקרוגרם / מ"ל) |
| GFP צבע אחד שליטה | ההשעיה תא בודד מעכברים Nestin-GFP |
| PE צבע יחיד שליטה | OneComp eBeads + PDGFRβ-PE נוגדן (4 מיקרוגרם / מ"ל) |
| PE-FMO שליטה | ההשעיה תא בודד מעכברים Nestin-GFP + DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל) |
| לִטעוֹם | ההשעיה תא בודד מעכברים Nestin-GFP + PDGFRβ-PE נוגדן (4 מיקרוגרם / מ"ל) +DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל) |
טבלה 1: פרוטוקול מכתים עבור פקדי צבע יחיד, PDGFRβ-PE-FMO שליטה, מדגם שריר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pericytes הם תאים multivotent perivascular 22 , 23 הממוקם על פני השטח abluminal של נימי 21 , 26 . בשרירי השלד, pericytes מסוגלים להבדיל לאורך נתיבים adipogenic ו / או myogenic 19 , 20 , 24 . מחקרים שנערכו לאחרונה חשפו שתי תת-קבוצות של פרסיטים, עם ביטוי סמן שונה והבדלים ברורים שונים 19 , 24 , 25 . סוג אני (NG2 + Nestin - ) pericytes הם adipogenic, ואילו סוג II (NG2 + Nestin + ) pericytes הם myogenic. בידוד של subpopulations אלה עבור במבחנה מחקרים דורש NG2-DsRed ו Nestin-GFP קו עכבר מהונדס פעמיים. התלות של הטיהור הזהפרוטוקול על עכברים פעמיים מהונדס מגביל באופן משמעותי את היישום שלה ובכך מחקר על הביולוגיה של subycopulations pericyte.
מאמר זה וידאו ממחיש שיטה חלופית לבידוד של סוג I ו pericytes סוג II מן שרירי השלד העכבר. שיטה חדשה זו עדיין מסתמכת על טכניקה מבוססת FACS על הפרדת תאים. עם זאת, במקום ניצול מהונדס NG2-DsRed מהונדס, הוא מכוון את האות PDGFRβ אנדוגני. זה מבוסס על התצפית כי ביטוי NG2-DsRed co-localizes עם PDGFRβ בשרירי השלד 19 . בהשוואה לשיטה המקורית, פרוטוקול זה יש מספר יתרונות. ראשית, היא אינה דורשת רקע גנטי NG2-DsRed, למרות הרקע Nestin-GFP עדיין נחוץ. שנית, במקום מיקוד NG2, פרוטוקול זה משתמש PDGFRβ, מאפיין היטב מאופיין עם נוגדנים מאומתים זמינים מסחרית. שלישית, היא מאפשרת בידוד בו זמנית של boסוג אני ו סוג II pericytes. לדוגמה, PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - ו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + תאים מבודדים באמצעות פרוטוקול זה להפגין יכולות הבחנה שונות. באופן ספציפי, PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - , אבל לא PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , תאים להבדיל adipocytes במצב adipogenic, ואילו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , אבל לא PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - , תאים עוברים בידול myogenic תחת מצב myogenic. נתונים אלה עולים בקנה אחד עם דוחות קודמים מראה כי NG2-DsRed + Nestin-GFP - תאים (סוג אני pericytes) הם adipogenic ו NG2-DsRed + Nestin-GFP + תאים (סוג II pericytes) הם myogenic 19 , 24 , מה שמרמז כי בודדים PDGFRβ -PE + Nestin-GFP - ו- PDGFRβ-PE + Nאסטין- GFP + תאים אכן סוג אני ואת סוג II pericytes, בהתאמה. יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך פרוטוקול חדש זה מאפשר בידוד / טיהור קל יחסית של subpopulations pericyte של שרירי השלד העכבר, ואולי רקמות אחרות. זה יעודד מחקרים על ביולוגיה pericyte ואת התרגום הטיפולי שלהם עבור הפרעות שונות.
יצוין, עם זאת, כי יש מגבלה של שיטה זו בשל השימוש PDGFRβ. זה הוכח במחקר קודם כי PW1 + תאים interstitial (PICs) גם להביע PDGFRβ 20 . לכן, בודדים PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - ו PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + אוכלוסיות עשוי להכיל PICs. עם זאת, התרומה של אלה PICs כדי הפרדת pericyte מוגבל, בהתחשב בכך pericytes במספר PICs בשרירי השלד 20 ואת סוג זה אני pericytes לא עוברים שליOgenesis 19 , 25 .
בשיטה זו, הקלד I ו II סוג pericytes התקבלו תשואות של 9.5% ו 2.1%, בהתאמה. מספרים אלה היו דומים לתשואות שדווחו על 2.8% ו -3.4%, בהתאמה, בעכברים הכפולים-טרנסגניים 19 . הבדל קל עשוי להיות בשל אסטרטגיות gating שונים או פרוטוקולי עיכול. תוצאות אלו שוב מציעות כי הפרוטוקול המוצע ניתן להשתמש כדי לבודד תת סוגים של pericytes של שרירי השלד.
השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים את הנקודות הבאות: (1) ודא כי שרירי השלד הם טחון לחלוטין ויכול בקלות לעבור דרך פיפטה סרולוגית 10 מ"ל. גושי שרירים גדולים מפריעים לעיכול אנזימטי ומפחיתים באופן משמעותי את התשואה. (2) השתמש טריים collagenase פתרון לעיכול שרירים ולאפשר תסיסה עדינה (35 סיבובים / דקות) במהלך הדגירה. (3) לשמור עלשולטת ומדגם על הקרח לאורך מכתים ומדרגות מיון. (4) השתמש בפקדי FMO כדי להגדיר גבולות gating.
בנוסף יכולת בידול, הקלד אני סוג II pericytes גם להראות מורפולוגיה שונים. באופן ספציפי, סוג אני pericytes יש תאים עגולים התא, עם תהליכים קצרים גרעינים גדולים יחסית. סוג II pericytes, לעומת זאת, בדרך כלל יש גוף תאים קטנים, עם תהליכים ארוכים ודקים גרעינים קטנים. ההבדלים המורפולוגיים מצביעים על כך שסוג I ו- II pericytes הם שונים במהותם, אשר עולים בקנה אחד עם הטבע ההטרוגני של pericytes 21 . מה גורם / שומרת את ההבדל בין סוג I ו pericytes סוג II, כמו גם את המנגנונים המולקולריים הבסיסית, להישאר לא ברור ודורשים חקירה נוספת. פרוטוקול בידוד זה יעזור לענות על שאלות חשובות אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לכל המחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה באופן חלקי על ידי מענק קרן-A-FO של קרן Dystrophy Myotonic (MDF-FF-2014-0013) ומענק פיתוח המדען של איגוד הלב האמריקני (16SDG29320001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 G Needles | BD | 305196 | |
| 10 mL Serological Pipette | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
References
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
- Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
- Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
- Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
- Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).
