Summary
Este trabalho descreve um protocolo baseado em FACS que permite o isolamento fácil e simultâneo de pericitos tipo I e tipo II dos músculos esqueléticos.
Abstract
Pericitos são células multipotentes perivasculares que mostram heterogeneidade em diferentes órgãos ou mesmo dentro do mesmo tecido. Nos músculos esqueléticos, há pelo menos duas subpopulações de pericitos (chamadas de tipo I e tipo II), que expressam diferentes marcadores moleculares e possuem distintas capacidades de diferenciação. Utilizando ratinhos duplamente transgénicos NG2-DsRed e Nestin-GFP, os pericitos de tipo I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) e de tipo II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) foram isolados com sucesso. Contudo, a disponibilidade destes ratinhos duplamente transgénicos impede o uso generalizado deste método de purificação. Este trabalho descreve um protocolo alternativo que permite o isolamento fácil e simultâneo de pericitos tipo I e tipo II a partir de músculos esqueléticos. Este protocolo utiliza a técnica de triagem de células activada por fluorescência (FACS) e alvos PDGFRβ, em vez de NG2, juntamente com o sinal de Nestin-GFP. Após o isolamento, o tipo I e tyOs pericitos II apresentam morfologias distintas. Adicionalmente, os pericitos de tipo I e de tipo II isolados com este novo método, como os isolados a partir de ratinhos duplamente transgénicos, são adipogénicos e miogénicos, respectivamente. Esses resultados sugerem que este protocolo pode ser utilizado para isolar subpopulações de pericitos dos músculos esqueléticos e, possivelmente, de outros tecidos.
Introduction
A distrofia muscular é uma desordem músculo-degenerativa que não tem nenhum tratamento eficaz até agora. O desenvolvimento de terapias que promovem a regeneração de tecidos tem sido sempre de grande interesse. A regeneração e reparação dos tecidos após os danos dependem das células estaminais / células progenitoras residentes 1 . As células satélites são células precursoras miogénicas comprometidas que contribuem para a regeneração muscular 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . O seu uso clínico, no entanto, é dificultado pela sua migração limitada e baixa taxa de sobrevivência após a injecção, bem como pela sua diminuição da capacidade de diferenciação após a amplificação in vitro 8 , 9 , 10 , 11 . Além do satelliTe células, os músculos esqueléticos também contêm muitas outras populações de células com potencial miogénico 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , tais como as células intersticiais positivas ao receptor de factor de crescimento derivado de plaquetas beta (PDGFRp). Há evidências que demonstram que as células PDGFRβ + derivadas de músculo são capazes de se diferenciar em células miogênicas e melhorar a patologia e a função muscular 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . O PDGFRβ rotula predominantemente os pericitos 21 , que são células perivasculares com pluripotência 22 , 23 . Além de PDGFRβ, muitos outros marcadores, incluindo Neuron-Glial 2 (NG2) e CD146, também são usados para iDentify pericytes 21 . Deve-se notar, no entanto, que nenhum desses marcadores é pericítico-específico [ 21] . Estudos recentes revelaram dois subtipos de pericitos musculares, chamados de tipo I e tipo II, que expressam marcadores moleculares diferentes e exercem funções distintas 19 , 24 , 25 . Bioquimicamente, os pericitos do tipo I são NG2 + Nestin - , enquanto os pericídios do tipo II são NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funcionalmente, os pericitos tipo I podem sofrer diferenciação adipogênica, contribuindo para acúmulo de gordura e / ou fibrose, enquanto que os pericitos de tipo II podem se diferenciar ao longo da via miogênica, contribuindo para a regeneração muscular 19 , 24 , 25 . Estes resultados demonstram que: (1) os pericitos de tipo I podem bE alvo no tratamento de transtornos degenerativos gordos / fibrose, e (2) pericitos de tipo II têm grande potencial terapêutico para a distrofia muscular. Outras investigações e caracterização destas populações requerem um protocolo de isolamento que permita a separação dos pericitos tipo I e tipo II com alto grau de pureza.
Atualmente, o isolamento de subpopulações pericíticas depende de camundongos duplamente transgênicos NG2-DsRed e Nestin-GFP 19,24. A disponibilidade de ratinhos NG2-DsRed ea qualidade da maioria dos anticorpos NG2 limitam o uso generalizado deste método. Dado que todos os pericitos NG2 + também expressam PDGFRβ nos músculos esqueléticos 19 , 20 , 24 , hipótese de que NG2 pode ser substituído por PDGFRβ para o isolamento de pericitos e suas subpopulações. Este trabalho descreve um protocolo baseado em FACS queUtiliza a coloração PDGFRβ e o sinal Nestin-GFP. Este método é menos exigente para os investigadores porque: (1) não requer o fundo NG2-DsRed e (2) utiliza anticorpos PDGFRβ comercialmente disponíveis, que são bem caracterizados. Além disso, permite o isolamento simultâneo de pericitos tipo I e tipo II com elevada pureza, permitindo uma investigação mais aprofundada da biologia e potencial terapêutico destas subpopulações de pericitos. Após purificação, estas células podem ser cultivadas em cultura, e as suas morfologias podem ser visualizadas. Este trabalho também mostra que os pericitos tipo I e tipo II isolados usando este método, como os purificados a partir de camundongos duplamente transgênicos, são adipogênicos e miogênicos, respectivamente.
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Protocol
Os ratinhos transgénicos de tipo selvagem e Nestin-GFP foram alojados na instalação animal na Universidade de Minnesota. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Minnesota e estavam de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Dissecção muscular e isolamento de célula única
- Euthanize camundongos adultos (6-10 semanas, ambos do sexo masculino e feminino) com tribromoetanol (250 mg / kg, ip) e esterilizar a pele do abdômen com etanol 70%.
NOTA: O tribromoetanol foi usado aqui em vez de cetamina para anestesia / eutanásia, já que a ketamina é conhecida por interagir com os receptores NMDA, o que poderia potencialmente ter um impacto no estudo. - Coloque os ratos na posição supina e use um bisturi para fazer uma incisão horizontal na pele abdominal. Descasque a pele com a mão, puxando em direções opostas para expor os músculos dos membros posteriores.
- ColecionarT os músculos de ambos os membros posteriores usando fórceps e tesoura. Armazená-los em solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril suplementada com 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) em gelo.
- Lavar os músculos do membro posterior dissecados em PBS gelado suplementado com P / S a 1% duas vezes e transferi-los para uma placa estéril de 10 cm.
- Cuidadosamente dissecar os nervos, vasos sanguíneos e tecido conjuntivo dos músculos usando pinças e tesoura sob um microscópio de dissecção em 2X ampliação.
- Cortar finamente e picar os músculos em pedaços pequenos (1-2 mm 3 ) usando tesouras estéreis e lâminas. Se necessário, adicionar uma pequena quantidade de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) para garantir que os músculos não são secos.
- Quebrar mecanicamente o tecido por pipetagem para cima e para baixo através de uma pipeta serológica de 10 ml 10 vezes.
- Adicionar a solução de digestão recentemente preparada (DMEM suplementado com colagenase de tipo 2 a 0,2%) à mistura. Incubar a 37 ° C por 2 h com gentlAgitação a 35 revoluções / min.
- Triturar utilizando uma agulha de 18 G para homogeneizar a mistura. Em seguida, centrifugar a 500 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e depois ressuspender o sedimento em 0,25% de tripsina / EDTA. Incubar a 37 ° C durante 10 min. Repita o passo de centrifugação mais duas vezes.
- Adicionar 10 mL de DMEM suplementado com 20% de soro fetal bovino (FBS) à solução e centrifugar a 500 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tampão de lise de células vermelhas do sangue (NH4Cl 155 mM, KHCO3 10 mM e EDTA 0,1 mM).
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tampão de separação (HEPES 20 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM e BSA a 1% em PBS livre de Ca / Mg2 + , pH 7,0). Filtrar a mistura através de um filtro de células de 40 um para obter uma suspensão de célula única.
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 mL de tampão de separação.
- Conte oNúmero de células com um hemocitômetro e diluir a suspensão de célula única para 5 x 10 6 / mL em tampão de triagem.
2. Coloração e Classificação de Células
- Preparar os controlos ea amostra conforme descrito na Tabela 1 . Mancha a suspensão de célula única com os respectivos anticorpos em gelo durante 30 min, como descrito na Tabela 1 .
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min e lavar os pellets duas vezes com tampão de separação.
- Adicionar DAPI às soluções de célula única, como indicado na Tabela 1. Utilizar 5 μg / mL de DAPI (concentração final) para o controlo de cor única DAPI e 1 μg / mL de DAPI para o controlo de PDGFRβ-PE-FMO e para a amostra. Manter todos os tubos em gelo durante todo o experimento.
- Ative o classificador e o software. Digitalize e insira um chip de classificação de 100 μm quando solicitado.
- Execute a configuração automática ( ie, alinhamento de chip , calibração de gotículas, calibração de fluxo lateral e calibração de atraso de classificaçãoOn) carregando os grânulos de configuração automática quando solicitado.
- Quando a configuração automática estiver concluída, vá para a guia "Experiência", clique em "Novo" e selecione o "Modelo em Branco" em "Modelos Públicos".
- Em "Configurações de medição", digite "DAPI" para "FL1", "Nestin-GFP" para "FL2" e "PDGFRβ" para "FL3." Desmarque as caixas de "FL4" - "FL6".
- Marque as caixas para ativar os lasers 405, 488 e 561 e clique em "Criar Experiência Nova".
- Selecione a opção "Start Compensation Wizard" e siga as instruções do software "Compensation Wizard" para configurar a compensação.
- Carregar o controle sem cor e clique em "Iniciar". Clique em "Detector & Threshold Settings" e ajuste o ganho do sensor dos detectores FSC e BSC para colocar a população na escala.
- de AnúnciosApenas os níveis de ganho dos canais de fluorescência FL1-FL3 para colocar as populações negativas no lado esquerdo dos histogramas. Clique no botão "Gravar" para gravar os dados.
- Carregar controles de uma cor um por um quando solicitado. Clique em "Iniciar e Gravar" para gravar os dados. Ajustar os portões para as populações positivas nos histogramas. Clique em "Avançar".
- Vá para "Calcular matriz" na guia "Compensação" e clique em "Calcular" no painel "Calcular configurações de compensação" para executar a compensação. Clique em "Concluir" para sair do "Assistente de compensação".
- Carregue o controle PDGFRβ-PE-FMO e clique em "Iniciar". Desenhe um portão de polígono (Portão A) em torno das células de interesse sob o gráfico "Todos os Eventos".
- Clique duas vezes dentro do portão A para criar um gráfico filho. Altere o eixo Y para DAPI e desenhe uma porta poligonal (Gate B) em torno de células vivas (DAPI low ). Clique duas vezes em iNside Gate B para criar um enredo filho. Mude o eixo X para FSC-H e o eixo Y para FSC-W e desenhe uma porta poligonal (Gate C) em torno dos singlets para eliminar dupletos.
- Clique duas vezes dentro do Gate C para criar um gráfico filho. Mudar o eixo X para Nestin-GFP e o eixo Y para PDGFRβ-PE. Clique no botão "Gravar" para gravar os dados.
- Carregue a amostra e repita os passos 2.11-2.12. Após a gravação, clique em "Pausar" para preservar a amostra.
- Definir os limites de passagem para as células PDGFRβ + e Nestin-GFP + com base no controlo PDGFRβ-PE-FMO. Draw portões para o PDGFRβ + Nestin-GFP - e PDGFRβ + Nestin-GFP + populações.
- Em "Método de classificação", selecione "Tubos de 2 vias" e atribua as células "PDGFRβ + Nestin-GFP - " e "PDGFRβ + Nestin-GFP + " aos tubos coletores esquerdo e direitoEspecificamente. Montar os tubos de recolha de 15 mL de tampão de triagem na fase de recolha e clicar no botão "Carregar colecção".
- Clique no botão "Continuar" para manter a amostra em execução. Clique em "Start Sort" para coletar as células PDGFRβ + Nestin-GFP - (tipo I) e células PDGFRβ + Nestin-GFP + (tipo II pericytes).
3. Análises pós-triagem
- Centrifugar as células classificadas a 500 xg durante 5 min, ressuspender a pastilha em 1 mL de meio pericito (ver Tabela de Materiais ) e contar a densidade celular utilizando um hemocitómetro.
- Os pericitos tipo I e tipo II de sementes em lamínulas revestidas com poli-D-lisina (PDL) a ~ 1 x 10 4 células / cm2. Crescer em meio pericíto durante 3 dias a 37 ° C com 5% de CO2.
- No dia 3, examinar a morfologia do pericito (sob contraste de fase) e endógena Nestin-GFP expressão utilizando um micro fluorescenteÂmbito (laser de excitação: 488 nm, filtro de excitação: 470/40 nm, e filtro de emissão: 515/30 nm). Tire as imagens com um objetivo de 20X (0,45 NA).
- Substituir o meio pericítico por meio adipogênico (meio basal MSC + suplemento estimulante adipogênico) e miogênico (DMEM + 2% soro de cavalo) para iniciar a diferenciação adipogênica e miogênica, respectivamente, conforme descrito anteriormente 20 . Alterar o meio a cada 2-3 dias.
- Fixar as células no dia 17 (14 dias após a diferenciação adipogénica / miogénica) em paraformaldeído a 4% (PFA) durante 20 min à temperatura ambiente.
NOTA: Cuidado, PFA é um carcinógeno. - Realizar imunocitoquímica contra perilipina (marcador de adipócito) e S-miosina (marcador de miotubo maduro / miofibra), conforme descrito em publicações anteriores 19 , 20 .
- Lavar as células fixas 3 vezes em PBS durante 10 min à temperatura ambiente.
- Adicionar tampão de bloqueio (PBSSuplementado com soro de burro a 5%, BSA a 3% e Triton X-100 a 0,3%) e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
- Incubar as células com anticorpos anti-perilipina (2 μg / mL) e / ou anti-S-miosina (2 μg / mL) a 4 ° C durante a noite.
- Lavar as células 3 vezes em PBS durante 10 min à temperatura ambiente.
- Incubar as células com anticorpos anti-coelho anti-coelho (4 μg / mL) e / ou Alexa555 anti-rato (4 μg / mL) de burro Alexa 555 à temperatura ambiente durante 1 h.
- Lavar as células 3 vezes em PBS durante 10 min à temperatura ambiente.
- Monte as células imunocoradas com meio de montagem contendo DAPI (ver tabela de materiais). Examine a expressão de perilipina e S-miosina utilizando um microscópio fluorescente (laser de excitação: 543 nm, excitação de 540/45 nm e emissão de 600/50 nm) e tome imagens sob um objetivo 40X (0,60 NA).
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Representative Results
Os parâmetros FACS, incluindo a intensidade do laser e a compensação do canal, são corrigidos com base nos resultados de controles sem cor e controles de cor única. O controlo PDGFRβ-PE-FMO é utilizado para definir o gating para a população de PDGFRβ-PE + ( Figura 1A ). Entre as células PDGFRβ-PE, duas populações que representam as células Nestin-GFP + e Nestin-GFP estão claramente separadas ( Figura 1A ). As fronteiras de Gating para as populações PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + e PDGFRβ-PE + Nestin-GFP são estabelecidas com base no gating para PDGFRβ-PE + e Nestin-GFP + ( Figura 1A ). Estes limites são utilizados para definir e classificar PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + (tipo II pericídios) e PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - (tipo I pericitoEs) da amostra ( Figura 1B ). As células PDGFRβ-PE + Nestin-GFP e PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + isoladas representam 9,5% e 2,1% das células totais na solução de célula única, respectivamente.
Os pericitos isolados FACS tipo I e tipo II demonstram diferenças morfológicas após três dias em cultura. Os pericitos tipo I apresentam morfologia ameboide, com corpos celulares redondos e processos curtos ( Figura 2 ). Os pericitos de tipo II, entretanto, apresentam morfologia ramificada, caracterizada por pequenos corpos celulares e processos longos e finos ( Figura 2 ). Nesse momento, a maioria dos pericitos do tipo II permanece como Nestin-GFP + , enquanto que os pericitos do tipo I são Nestin-GFP - ( Figura 2 ).
Além disso, o tipo I, mas não o tipo II,Diferem em adipócitos que expressam perilipina após 14 dias em meio adipogênico ( Figura 3 ). Os pericitos de tipo II, mas não de tipo I, diferenciam-se em miotubos que expressam S-miosina após 14 dias em meio miogênico ( Figura 4 ). Estes resultados indicam fortemente que os pericitos do tipo I são adipogénicos, enquanto que os pericitos do tipo II são miogénicos.
Figura 1 : Limites de Gating e classificação representativa. ( A ) Esquema fluorescente do controlo PDGFRβ-PE-FMO, demonstrando os limites de giro PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - e PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + . ( B ) Esquema fluorescente representativo da amostra mostrando a distribuição do PDGFRβ-PE + Nestin-GFP
Figura 2: Morfologia e expressão de Nestin-GFP em pericitos classificados tipo I e tipo II. Os pericitos de tipo I e tipo II foram semeados em lamínulas e cultivados em meio pericíto durante 3 dias. Os pericitos tipo I apresentaram corpos celulares redondos, com processos curtos e sem sinal de GFP endógeno sob microscópio fluorescente (laser de excitação: 488 nm, excitação e filtros de emissão: 470/40 nm e 515/30 nm, respectivamente). Os pericitos de tipo II demonstraram pequenos corpos celulares, com processos longos e finos, e um forte sinal de GFP endógeno sobMicroscópio fluorescente sob as mesmas configurações. Barra de escala = 100 μm Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 3: Diferenciação adipogénica dos pericitos classificados tipo I e tipo II. Os pericitos de tipo I e tipo II ordenados foram cultivados em meio pericíto durante 3 dias. Eles foram então diferenciados em meio adipogênico por 14 dias. As células foram fixadas e imunocoradas com anticorpo anti-perilipina seguido de anticorpo anti-coelho Alexa555 burro. A imunocitoquímica mostrou que os pericitos de tipo I, mas não de tipo II, expressavam o marcador de adipócitos perilipina (vermelho) sob um microscópio fluorescente (laser de excitação: 543 nm, filtros de excitação e emissão: 540/45 nm e 600/50 nm, respeito Mente). Barra de escala = 50 μm Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 4 : Diferenciação miogênica de pericitos classificados tipo I e tipo II. Os pericitos de tipo I e tipo II ordenados foram cultivados em meio pericíto durante 3 dias e foram então diferenciados em meio miogénico durante 14 dias. As células foram fixadas e imunocoradas com anticorpo anti-S-miosina e anticorpo anti-rato burro Alexa555. A imunocitoquímica mostrou que os pericitos do tipo II, mas não do tipo I, expressaram o marcador de miotubo / miofibra maduro S-miosina (vermelho) sob um microscópio fluorescente (laser de excitação: 543 nm, filtros de excitação e emissão: 540/45 nm e 600/50 nm , Respectivamente). Barra de escala = 50 μm//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55904/55904fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
| Tubos | Coloração |
| Controle não-controlado | Suspensão de células individuais de ratinhos selvagens |
| DAPI controle de uma única cor (exclusão de células mortas) | A suspensão de células individuais de ratinhos de tipo selvagem + DAPI (5 μg / mL) |
| GFP controle de cor única | Suspensão de células individuais de ratinhos Nestin-GFP |
| Controlo monocomando PE | Anticorpos eBeads + PDGFRβ-PE de OneComp (4 μg / mL) |
| Controlo PE-FMO | A suspensão de células individuais de ratinhos Nestin-GFP + DAPI (1 μg / mL) |
| Amostra | A suspensão de células individuais de ratinhos Nestin-GFP + anticorpo PDGFRβ-PE (4 μg / mL) +DAPI (1 μg / mL) |
Tabela 1: Protocolo de coloração para os controlos de cor única, controlo de PDGFRβ-PE-FMO e amostra de músculo.
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Discussion
Os pericitos são células perivasculares multipotentes 22 , 23 localizadas na superfície abluminal dos capilares 21 , 26 . Nos músculos esqueléticos, os pericitos são capazes de diferenciar ao longo das vias adipogénicas e / ou miogénicas 19 , 20 , 24 . Estudos recentes revelaram duas subpopulações de pericitos, com diferentes expressões de marcadores e diferentes potenciais de diferenciação 19 , 24 , 25 . Os pericitos tipo I (NG2 + Nestin - ) são adipogênicos, enquanto que os pericitos do tipo II (NG2 + Nestin + ) são miogênicos. O isolamento destas subpopulações para estudos in vitro requer a linha de ratinhos dupla transgénicos NG2-DsRed e Nestin-GFP. A dependência desta purificaçãoProtocolo em camundongos duplos transgênicos limita significativamente sua aplicação e, portanto, pesquisa sobre a biologia das subpopulações de pericitos.
Este artigo de vídeo ilustra um método alternativo para o isolamento de pericitos de tipo I e de tipo II a partir de músculos esqueléticos de ratinho. Este novo método ainda depende de uma técnica baseada em FACS para a separação celular. No entanto, em vez de utilizar a fluorescência NG2-DsRed transgénica, ela direcciona-se para o sinal endógeno de PDGFRβ. Isto é baseado na observação de que a expressão de NG2-DsRed co-localiza com PDGFRβ no músculo esquelético 19 . Comparado com o método original, este protocolo tem várias vantagens. Primeiramente, não requer o fundo genético de NG2-DsRed, embora o fundo de Nestin-GFP seja ainda necessário. Em segundo lugar, em vez de se direccionar para NG2, este protocolo utiliza PDGFRβ, um marcador bem caracterizado com anticorpos validados e comercialmente disponíveis. Terceiro, permite o isolamento simultâneo de boPericitos tipo I e tipo II. Por exemplo, as células PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - e PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + isoladas utilizando este protocolo demonstram capacidades de diferenciação distintas. Especificamente, as células PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - , mas não PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + , diferenciam-se em adipócitos em estado adipogénico, enquanto que PDGFRβ- PE + Nestin- GFP + , mas não PDGFRβ- PE + , As células sofrem diferenciação miogénica sob condições miogénicas. Estes dados são consistentes com os relatórios anteriores mostrando que as células NG2-DsRed + Nestin-GFP (tipo I) são adipogénicas e as células NG2-DsRed + Nestin-GFP + (tipo II) são miogénicas 19 , 24 , sugerindo que o PDGFRβ isolado -EP + Nestin-GFP - e PDGFRβ-PE + NEstina-GFP + são efectivamente pericitos tipo I e tipo II, respectivamente. Juntos, esses resultados sugerem que este novo protocolo permite o isolamento / purificação relativamente fácil de subpopulações de pericitos a partir de músculos esqueléticos de ratinho e possivelmente outros tecidos. Isto promoverá estudos sobre a biologia pericítica e sua tradução terapêutica para vários distúrbios.
Deve notar-se, contudo, que existe uma limitação deste método devido ao uso de PDGFRβ. Foi demonstrado num estudo anterior que as células intersticiais PW1 + (PICs) também expressam PDGFRβ 20 . Deste modo, as popula�es isoladas de PDGFRβ-PE + Nestin-GFP - e PDGFRβ-PE + Nestin-GFP + podem conter PICs. No entanto, a contribuição desses PICs para a diferenciação de pericitos é limitada, uma vez que os pericitos superam os PICs nos músculos esqueléticos 20 e que os pericitos do tipo I não passam pela minhaOgenesis 19 , 25 .
Utilizando este método, os pericitos de tipo I e II foram obtidos com rendimentos de 9,5% e 2,1%, respectivamente. Estes números foram comparáveis aos rendimentos relatados de 2,8% e 3,4%, respectivamente, nos camundongos transgénicos 19 . A ligeira diferença pode ser devido a diferentes estratégias gating ou digestão protocolos. Estes resultados sugerem novamente que o protocolo proposto pode ser usado para isolar subtipos de pericitos dos músculos esqueléticos.
As etapas críticas deste protocolo incluem os seguintes pontos: (1) Certifique-se de que os músculos esqueléticos são totalmente picados e capazes de passar facilmente através de uma pipeta serológica de 10 ml. Grandes blocos musculares interferem com a digestão enzimática e reduzem significativamente o rendimento. (2) Use a solução de colagenase recentemente preparada para a digestão muscular e permita agitação suave (35 revoluções / min) durante a incubação. (3) Mantenha oControles e amostra em gelo durante as etapas de coloração e classificação. (4) Use controles FMO para configurar limites de gating.
Além da capacidade de diferenciação, os pericitos tipo I e II também apresentam morfologia diferente. Especificamente, os pericitos do tipo I possuem corpos celulares redondos, com processos curtos e núcleos relativamente grandes. Os pericitos de tipo II, por outro lado, geralmente têm pequenos corpos celulares, com processos longos e finos e núcleos pequenos. As diferenças morfológicas sugerem que os pericitos tipo I e II são intrinsecamente diferentes, o que é consistente com a heterogeneidade dos pericitos 21 . O que causa / mantém a diferença entre os pericitos tipo I e tipo II, bem como os mecanismos moleculares subjacentes, permanecem obscuros e requerem investigação adicional. Este protocolo de isolamento ajudará a responder a essas importantes questões.
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Disclosures
Todos os autores não têm conflito de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente apoiado por um Fundo-A-Fellow subvenção da Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) eo Cientista Development Grant da American Heart Association (16SDG29320001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 G Needles | BD | 305196 | |
| 10 mL Serological Pipette | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
References
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