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Genetics

माउस टी-सेल लाइनों में क्रोमैटिन इम्युनोपेरिगेशन (चिप)

Published: June 17, 2017 doi: 10.3791/55907
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Biochemistry, University of Giessen

Summary

यह काम एक परिपक्व माउस टी-सेल लाइन का उपयोग करके क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन (चिप) के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल विशिष्ट प्रमोटर साइटों या जीनोम-वाइड पर विशिष्ट हिस्टोन अंकों के वितरण की जांच के लिए उपयुक्त है।

Abstract

सिग्नलिंग पथ, अलग-अलग स्तरों पर क्रोमेटिन संरचना के मॉड्यूलेशन के माध्यम से जीन एक्सप्रेशन कार्यक्रमों को विनियमित करते हैं, जैसे कि हिस्टोन पूंछ के बाद-अनुवादित संशोधनों (पीटीएम), हिस्टोन वेरिएंट के साथ कैनोनिकल हिस्टोन का आदान-प्रदान, और न्यूक्लियोसोम बेदखली। ऐसे विनियमन के लिए संकेत-संवेदनशील प्रतिलेखन कारकों (टीएफ) की बाध्यकारी आवश्यकता होती है जो कि उच्चवर्धक के रूप में परिभाषित नियामक तत्वों पर क्रोमैटीन-संशोधित एंजाइमों की भर्ती करते हैं। समझ कैसे संकेतन कैसकेड अनुवर्ती गतिविधि को विनियमित करने के लिए टीएफ के बंधन, क्रोमैटिन संशोधित एंजाइमों और विशिष्ट हिस्टोन अंकों और हिस्टोन वेरिएंट के अधिभोग के लिए व्यापक विश्लेषण की आवश्यकता है। क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन (चिप) एसेज विशिष्ट प्रोटीन / डीएनए कॉम्प्लेक्स को अनियंत्रित करने के लिए अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करता है। शुद्ध डीएनए के बाद के विश्लेषण में एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त प्रोटीन द्वारा कब्जा कर लिया क्षेत्र की पहचान के लिए अनुमति देता है। यह काम कुशलतापूर्वक पे के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता हैएक परिपक्व माउस टी-सेल लाइन में हिस्टोन प्रोटीन की चप्पे चीप प्रस्तुत प्रोटोकॉल चिप अवधि के उचित समय-सीमा में और उच्च प्रजनन क्षमता के साथ प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है।

Introduction

विकास, भेदभाव, और होमोस्टैसिस विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों पर निर्भर करते हैं जो कि सिग्नलिंग इवेंट से स्थापित होते हैं जो क्रोमैटिन संरचना को विनियमित करते हैं और इसलिए निर्धारित करते हैं कि किसी विशिष्ट जीन को सक्रिय किया जाता है या सेल-और समय-विशिष्ट तरीके से दमन होता है या नहीं। टी-सेल के विकास के दौरान, टी-सेल के अग्रदूतों के परिप्रेक्ष्य को एक-पॉजिटिव (एसपी) राज्य में डबल-नेगेटिव (डीएन) से परिपक्व होने के लिए विशिष्ट जीन एक्सप्रेशन प्रोग्राम स्थापित किए जाने चाहिए, जो कि कई मध्यवर्ती अवस्थाएं 1 से गुजरती हैं। टी सेल विकास के दौरान गतिशील रूप से विनियमित जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम को पिछले वर्षों में मोटे तौर पर कई प्रयोगशालाओं 2 , 3 , 4 , 5 , 6 द्वारा जांच की गई है ।

हिस्टोन्स के बाद-अनुवादित संशोधनों (पीटीएम) द्वारा, एक्सचेंजहिस्टोन वेरिएंट, न्यूक्लियोसोम बेदखली के साथ कैनोनिकल हिस्टोन, और डीएनए मेथिलैलेशन जीन के ऑन / ऑफ स्विच को विनियमित करते हैं। कई समूहों ने पीटीएम और हिस्टोन वेरिएंट्स के जीनोम-विस्तृत वितरण का पता लगाया है जो अलग-अलग क्रोमेटिन के साथ संबद्ध हैं, जो 7 , 8 , 9 , 10 के दोनों समीपस्थ और बाह्य विनियामक क्षेत्रों में हैं। सिग्नलिंग कैसकेड विशिष्ट बढ़ाने वाले तत्वों पर सकारात्मक और नकारात्मक क्रोमैटिन-संशोधित एंजाइमों के आदान-प्रदान के माध्यम से गतिशील क्रोमेटिन विनियमन (जिसे क्रोमैटिन संशोधक भी कहा जाता है) का आयोजन करता है। ये क्रोमैटिन संशोधक क्रोमैटिन संरचना को विनियमित करते हैं और इस प्रकार ट्रांसक्रिप्शनल आउटपुट द्वारा, उदाहरण के लिए, गतिशील हिस्टोन मेथिलैशन और एसिटिलेशन। यह निशान सिग्नलिंग मार्ग 11 , 12 , 13 ,14

गतिशील हिस्टोन PTMs; हिस्टोन वेरिएंट के साथ एक्सचेंज; और हिस्टोन, ट्रांसक्रिप्शन कारकों और कॉफ़ैक्टर्स के गतिशील अधिभोग की जांच क्रोमैटिन इम्युनोपेरेग्रेशन (चिप) एसेल्स द्वारा की जा सकती है। अति विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग विशिष्ट डीएनए-प्रोटीन परिसरों को शुद्ध करने के लिए किया जाता है, और शुद्ध डीएनए का मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) द्वारा विश्लेषण किया जाता है; गहरे क्रमिक (चिप-सेक); या, आजकल कम बार, माइक्रोएरे (चिप-चिप) को संकरण।

कोशिकाओं के विश्लेषण, क्रोमैटिन के कवच और / या एंटीबॉडी के निम्न विशिष्टता के साथ जटिलताओं के कारण चिप आर्च कभी-कभी चुनौती होती है। प्रोटोकॉल में सुधार के लिए कई रणनीतियों को अपनाया गया है, जैसा कि नेक्ससॉन 15 के मामले में है शीतलक जल-स्नान ध्वनियों का उपयोग नमूना हीटिंग से बचा जाता है जो जांच के तहत प्रोटीन पर मौजूद एपिटोप्स को नुकसान पहुंचा सकता है, लेकिन नमूनों की कतरनी के लिए जरूरी ऊर्जा को पानी में फैला दिया जाता है।ऊर्जा के फैलाव को रोकने वाले केंद्रित अल्ट्रासोनिक उपकरणों के विकास के साथ एक और सुधार किया गया था। इसलिए, ध्यान केंद्रित ultrasonicator उपकरणों सेल lysis और chromatin कर्तन में सुधार के लिए अनुमति देते हैं, ऑपरेटर प्रेरित विविधताओं को नष्ट करने और महत्वपूर्ण रूप से reproducibility बढ़ रही है।

यह काम ईटीपीएचए 16 , 17 नामक एक परिपक्व माउस टी-सेल लाइन में हिस्टोन प्रोटीन के चिप को कुशलतापूर्वक करने के लिए प्रोटोकॉल ( चित्रा 1 में योजनाबद्ध अवलोकन) का वर्णन करता है। आमतौर पर टी कोशिकाओं को बोलना मुश्किल होता है, और उनके क्रोमैटिन के कवच को अक्षम होने का पता चला है। इस प्रोटोकॉल में, जो एक ठंडा ध्यान केंद्रित ultrasonicator का उपयोग करता है, कोशिकाओं की संख्या, lysis बफर, और कर्तन की स्थापना E2-10HA माउस T- सेल लाइन के लिए अनुकूलित थे यह प्रोटोकॉल एक उच्च प्रजनन क्षमता और उचित समय के साथ चिप को करने की अनुमति देता है। वास्तव में, यह requirक्रोमेटिन को कतरनी करने के लिए लगभग दो दिन और कर्तन की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए, और तीन दिनों में इम्यूनोपेरैजैज करने के लिए, क्रॉस्लिंक को उलट करें और डीएनए शुद्ध करें।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किए गए सभी बफ़र्स और मध्यम तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं

दिन 1 और 2

1. कोशिकाओं को क्रॉसलिंकिंग

  1. एक 6-अच्छी तरह से थाली से माउस टी-कोशिकाओं को 50 एमएल ट्यूब और 4 डिग्री सेल्सियस और ~ 271 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें। आईएमडीएम सेल संस्कृति माध्यम के 30 एमएल में सेल गोली resuspend और एक Neubauer कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना
  2. नए 50 एमएल ट्यूबों में 20 x 10 6 कोशिकाओं के अलियंत्रकों को इकट्ठा करें।
  3. सीधे सेल संस्कृति माध्यम के लिए 1% अंतिम एकाग्रता में फॉर्मलाडीहाइड (एफएमए) जोड़ें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते रहें।
    सावधानी: एफएमए अगर साँस लेता है, तो धुएं के नीचे काम करते हैं और उचित सुरक्षा उपकरण पहनते हैं। इसके अलावा, कृपया होस्ट संस्थान के नियमों के अनुसार एफएमए अपशिष्ट को संभाल लें।
  4. 1 एम ग्लाइसिन का 1/8-मात्रा जोड़ें, पीएच 7.0, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  5. 5 के लिए सेंटीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मारोन्यूनतम 4 डिग्री सेल्सियस और ~ 271 xg और फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) के 10 एमएल के साथ धो लें।
  6. पीबीएस के 1 एमएल के साथ सेल गोली धो लें और 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण करें।

2. सेल lysis और क्रोमैटिन बाल काटना

  1. 1 एमएल एसडीएस लिसेफेशन बफर में सेल गोली को फिर से खोलें और 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते रहें।
  2. प्रत्येक नमूना को एक sonication ट्यूब में स्थानांतरित करें और तालिका 2 में संकेतित सेटिंग्स के अनुसार ध्यान केंद्रित ultrasonicator का उपयोग करके कर्तन करें ।
  3. कर्तन के बाद, नमूनों को 1.5 एमएल ट्यूब और सेंटीफ्यूज को 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और ~ 18,000 x जी पर स्थानांतरित करें।
  4. सतह पर तैरनेवाला को नई ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  5. चरण 3 के अनुसार बाल कर्तन की क्षमता निर्धारित करने के लिए 50 μL लीजिए और तरल नाइट्रोजन में शेड लाइसेट को स्नैप-फ्रीज करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर सिंगल-उपयोग अल्कोट्स में lysate स्टोर करें

3. बाल काटना क्षमता का निर्धारण

  1. 50 और एल्यूएशन 50 एल्यूएल बफर को जोड़ें181; प्रत्येक शेयर्ड लोयसेट के एल और 65 डिग्री सेल्सियस पर रात में, मिलाते हुए।
  2. ते बफर के 100 μL और 4 μL 10 मिलीग्राम / एमएल आरएनज़ ए (0.2 माइक्रोग्राम / μL अंतिम एकाग्रता) जोड़ें। मिक्स और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए मिलाते हुए, मिलाते हुए।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए 2 μL 20 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीनेस के (0.2 माइक्रोग्राम / μL अंतिम एकाग्रता) को जोड़ें और 2 डिग्री सेल्सियस पर 55 डिग्री सेल्सियस पर मिलाकर मिलाएं।
  4. फ़िनोल / क्लोरोफॉर्म / आईसोमिल अल्कोहल निकासी के लिए उपयुक्त प्रत्येक जेल ट्यूब में प्रत्येक नमूना स्थानांतरण करें; निर्माता के निर्देशों के अनुसार संभाल
  5. 200 μL फिनोल / क्लोरोफॉर्म / आइसोमिल अल्कोहल (25: 24: 1) जोड़ें और ट्यूबों को हिलाएं। 24 डिग्री सेल्सियस और ~ 16,000 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और नए ट्यूबों के ऊपरी चरण को स्थानांतरित करें।
    सावधानी: श्वास और संक्षारक होने पर फेनोल, क्लोरोफॉर्म, और आइसोमिल अल्कोहल विषैले होते हैं; एक धूआं हुड के नीचे काम करते हैं और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते हैं इसके अलावा, फिनोल, क्लोरोफॉर्म, और आइसोमिल अल्कोहल अपशिष्ट एसी को संभालनामेजबान संस्था के नियमों के अनुसार।
    1. एक बार पुन: दोहराएं।
  6. निर्माता के निर्देश के अनुसार शुद्धीकरण कॉलम का उपयोग करके निम्नलिखित संशोधनों के साथ डीएनए शुद्ध करें:
    1. झिल्ली को दो बार धो लें आखिरी धोने के बाद, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए ट्यूब को छोड़ दें और अवशिष्ट इथनॉल को लुप्त हो जाना।
    2. एच्युओटी के लिए, 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 50 μL जोड़ें, 1 मिनट के लिए ट्यूब को घुमाएं और झिल्ली को ठीक से गीला कर दें, और 1 मिनट के लिए 1 मिनट के लिए डीएनए से पहले 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेवन करें। 24 डिग्री सेल्सियस और ~ 17,900 x जी
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उच्च संवेदनशीलता किट का उपयोग कर एक फ्लोरोरोमीटर पर शुद्ध डीएनए को बढ़ाएं।
  8. 1.8% agarose जेल पर शुद्ध डीएनए के लगभग 500 एनजी और उच्च संवेदनशीलता किट का उपयोग कर एक वैद्युतकणसंचलन प्रणाली पर लगभग 1 एनजी का विश्लेषण करें।
    नोट: उम्मीद की गई थीडीएनए टुकड़ों के ई 200 और 500 बीपी के बीच है।

दिन 3 और 4

4. Immunoprecipitation

  1. कमजोर पड़ने वाले बफर के 5 संस्करणों के साथ लेयरेट की मात्रा 1 मात्रा पतला।
  2. 30 μL / एमएल प्रोटीन के साथ प्रीलाइरल एक परिपत्र मोती ( परिशिष्ट ए के अनुसार तैयार) 30 मिनट के लिए ठंडे कमरे में घुमाने के दौरान।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट ~ 750 x ग्रा पर अपकेंद्रित्र
  4. इनपुट का 10% ले लीजिए और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें
  5. नई ट्यूबों में वांछित एलिसेट की मात्रा को विभाजित करना (विवरण के लिए तालिका 3 देखें)। प्रत्येक ट्यूब में इच्छित एंटीबॉडी जोड़ें (विवरण के लिए तालिका 3 देखें) और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं
  6. घूर्णन करते समय 40 μL प्रोटीन एक मोती जोड़ें और 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस तक सेवन करें।
  7. 1 एमएल कम नमक बफर, हाई-नमक बफर, लीक बफर, और ते बफर के साथ मोती धो लें (प्रत्येक धोने के लिए, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस से घूर्णन और अपकेंद्रित्र3 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस और ~ 950 xg के लिए) विवरण के लिए तालिका 3 देखें
  8. एल्यूएशन बफर के 110 μL को जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेवन करें, हर 2 मिनट में vortexing।
  9. 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और ~ 950 XG के लिए अपकेंद्रित्र और एक नई 1.5-एमएल ट्यूब पर सतह पर तैरनेवाला के 100 μL स्थानांतरण।
  10. दोहराव 4.7-4.8 दोहराव बफर के 100 μL के साथ दोहराएं और एलावाओं को संयोजित करें। नमूनों को इनपुट करने के लिए 200 μL तक अल्युशन बफर जोड़ें
  11. सभी नमूनों को रात भर 65 डिग्री सेल्सियस से मिलाते हुए मिलाते हुए।

दिन 5

5. डीएनए शुद्धि

  1. प्रत्येक एल्यूएट और 8 μL 10 मिलीग्राम / एमएल आरएनस ए (0.2 माइक्रोग्राम / μL अंतिम एकाग्रता) के लिए 200 मील का ते बफर जोड़ें। मिक्स और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए मिलाते हुए, मिलाते हुए।
  2. प्रत्येक एल्यूएट में 4 μL 20 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीनेस के (0.2 माइक्रोग्राम / μL अंतिम एकाग्रता) को जोड़ें और 2 डिग्री सेल्सियस 55 डिग्री सेल्सियस पर मिलाकर मिलाएं।
  3. प्रत्येक नमूने को जेल में स्थानांतरित करेंफिनोल / क्लोरोफॉर्म / आईसोमिल शराब निकासी के लिए उपयुक्त ट्यूब; निर्माता के निर्देशों के अनुसार संभाल
  4. 400 μL फिनोल / क्लोरोफॉर्म / आइसमैल अल्कोहल (25: 24: 1) जोड़ें और ट्यूबों को हिलाएं। 24 डिग्री सेल्सियस और ~ 16,000 x ग्रा पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र नए ट्यूबों के ऊपरी चरण को स्थानांतरित करें
    सावधानी: श्वास और संक्षारक होने पर फेनोल, क्लोरोफॉर्म, और आइसोमिल अल्कोहल विषैले होते हैं; एक धूआं हुड के नीचे काम करते हैं और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते हैं इसके अलावा, मेजबान संस्थान के नियमों के अनुसार फ़िनोल, क्लोरोफॉर्म, और आइसोमिल शराब अपशिष्ट को संभालना।
    1. एक बार पुन: दोहराएं।
  5. निम्नलिखित संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार शुद्धिकरण कॉलम का उपयोग करके डीएनए को शुद्ध करना:
  6. झिल्ली को दो बार धो लें आखिरी धोने के बाद, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए खुले रहने के लिए अवशिष्ट इथनॉल को लुप्त हो जाना छोड़ दें।
  7. एलायटिंग के लिए, एच 2 ओ के 50 μL जोड़ें, कमरे के तापमान पर सेते रहें1 मिनट के लिए, 1 एस के लिए ट्यूबों को ठीक से झिल्ली को गीला कर, और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 24 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट और ~ 17,900 x ग्राम तक सेंटीफ्यूजेशन से डीएनए को जाने से पहले सेते हैं।

Representative Results

परिपक्व मूरीन टी-कोशिकाओं को हिस्टोन 3 (एच 3 के 4 एम 1), हिस्टोन 3 (एच 3 के 4 एम 3) पर लाइसिन 4 के त्रि-मेथिलिकेशन, और लाइसिन 27 के एसिटिलेशन पर लिसिन 4 के हिस्टोन मार्क मोनो-मेथिलैलेशन के संवर्धन की जांच के लिए चिप विश्लेषण के अधीन किया गया था। हिस्टोन 3 (एच 3 के 27 एसी), साथ ही साथ न्यूक्लियोसोम अधिभोग, जैसा कि पैनएच 3 चिप द्वारा पता चला है। बाल कर्तन की गुणवत्ता 1.8% agarose जेल ( चित्रा 2 ए ) और एक वैद्युतकणसंचलन प्रणाली ( चित्रा 2 बी ) पर विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया गया था। H3K4me1 और H3K4me3 आमतौर पर क्रमशः बढ़ाने साइटों और प्रमोटरों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है ( चित्रा 3 ए )। वास्तव में, एच 3 के 4me3 प्रमुख है, लेकिन प्रमोटरों 5 , 8 , 14 पर विशेष रूप से समृद्ध नहीं है। सक्रिय संवर्धनकर्ताओं की एक विशेषता एच 3 के 4me1 और एच 3 के 27ac के लिए बेहद समृद्ध होती है और एच 3 के 4me3 (<मजबूत वर्ग = "एक्सफिग"> चित्रा 3 ए, ऊपरी पैनल), जबकि निष्क्रिय एन्हेंचर एच 3 के 4 एम 3 और एच 3 के 27 सी के निम्न स्तर पर हैं लेकिन उच्च स्तर के एच 3 के 4 एम 1 1 ( चित्रा 3 ए , निचले पैनल)। चित्रा 3 बी में दिखाए गए अनुसार, ग्लिसराइडहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज ( गैप ) जीन सक्रिय जीन प्रमोटरों (गल्प प्रमोटर ) के विश्लेषण के प्रतिनिधि हैं। वास्तव में, यह H3K4me3 और H3K27ac के उच्च स्तर और एच 3 के 4me1 के निम्न स्तर दिखाता है चित्रा 3 बी में , डेल्टेक्स 1 ( डीटीएक्स 1 ) निष्क्रिय बढ़ाने वालों ( डीटीएक्स 1 बढ़ाने ) का प्रतिनिधि है , क्योंकि यह एच 3 के 4me1 के लिए बेहद समृद्ध है और एच 3 के 4me3 और एच 3 के 27ac के लिए खराब समृद्ध है। जीन रेगिस्तान एक क्षेत्र का प्रतिनिधि है जो कोडिंग जीन की कमी है और आमतौर पर सक्रिय क्रोमैटिन के निशानों के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में मुकदमा चलाया जाता है। अवलोकन है कि एच 3 के 4me1, एक अच्छी तरह से स्वीकार्य बढ़ाव चिह्न 4 , 5 , 7 , 14 , 18 , जीन रेगिस्तान में समृद्ध नहीं है, इस बात से पता चलता है कि इस क्षेत्र में वृद्धि करने वालों की कमी है

आकृति 1
चित्रा 1: चिप प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध अवलोकन प्रस्तुत किया। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: परिपक्व माउस टी सेल लाइन की कतरनी गुणवत्ता नियंत्रण ( ए ) परिपक्व माउस टी-सेल लाइन E2-10HA के दो अलग-अलग अलग-अलग पदार्थों की रोशनी, और लगभग 500 एनजी शुद्ध डीएनए का विश्लेषण 1.8% agarose जेल पर उनके कतरनी का मूल्यांकन करने के लिए किया गयाआईएनजी गुणवत्ता ( बी ) नमूना 2 से शुद्ध डीएनए की 1 एनजी वैद्युतकणसंचलन द्वारा इसकी कतरनी गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए विश्लेषण किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: क्रोमैटिन अंक जो कि बढ़ाने और प्रमोटरों को चिह्नित करते हैं ( ए ) सक्रिय बढ़ाने (ऊपरी पैनल) की विशेषता उच्च एच 3 के 4me1, कम एच 3 के 4me3 और उच्च एच 3 के 27 एके, जबकि निष्क्रिय एन्हांसरों (निचला पैनल) वर्तमान में उच्च एच 3 के 4me1, कम एच 3 के 4me3 और कम एच 3 के 27 एके है। ( बी ) चित्रा 2 ए में प्रस्तुत नमूनों को एक साथ जमा किया गया और चिप विश्लेषण के लिए हिस्टोन अंक एच 3 के 4me1, एच 3 के 4me3, और एच 3 के 27 एके और हिस्टोन अधिभोग के लिए इस्तेमाल किया गया है, जैसा कि पैनएच 3 चिप द्वारा पता चला है। इस विश्लेषण से पता चलता है कि वेंई - हाउसकीपिंग जीन ग्लिसराइडहाइड 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज ( गैप प्रमोटर ) के प्रमोटर एच 3 के 4me3 और एच 3 के 27 एके के लिए बेहद समृद्ध है और एच 3 के 4 एम 1 1 के लिए कम समृद्ध है। दूसरी ओर, निष्क्रिय जीन डेल्टेक्स 1 ( डीटीएक्स 1 बढ़ाने ) के बढ़ाने के लिए एच 3 के 4me1 के लिए बहुत समृद्ध है लेकिन एच 3 के 4me3 और एच 3 के 27ac के लिए खराब समृद्ध है। न्यूहेक्लोसोम अधिभोग की जांच के लिए एक पैनएच 3 एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए चिप का उपयोग किया गया था। जीन रेगिस्तान एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। एक प्रतिनिधि का प्रयोग दिखाया गया है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

बफर का नाम अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता
डिलीटेशन बफर सोडियम डोडेकYl sulfate (एसडीएस) 0.01% (डब्ल्यू / वी)
ट्राइटन एक्स -100 1.1% (वी / वी)
एथीलेनियामियानेटेट्रैटेसेटिक एसिड (ईडीटीए) पीएच 8.0 1.2 मिमी
ट्राइस-एचसीएल पीएच 8.1 16.7 मिमी
सोडियम क्लोराइड (NaCl) 167 मिमी
डीएमए समाधान डाइमिथाइल एडिपिमिडेट (डीएमए) 10 मिमी
फास्फेट-बफ़ेड खारा (पीबीएस) 1x
अल्युशन बफर सोडियम डाइडेस्किल सल्फेट (एसडीएस) 1% (डब्ल्यू / वी)
एथीलेनियामियानेटेट्रैटेसेटिक एसिड (ईडीटीए) पीएच 8.0 10 मिमी
ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0 50 मिमी
उच्च नमक बफर सोडियम डाइडेस्किल सल्फेट (एसडीएस) 0.1% (डब्ल्यू / वी)
ट्राइटन एक्स -100 1% (वी / वी)
Ethylenediamiनेटेट्रैसेटिक एसिड (ईडीटीए) पीएच 8.0 2 मिमी
ट्राइस-एचसीएल पीएच 8.1 20 मिमी
सोडियम क्लोराइड (NaCl) 500 मिमी
आईएमडीएम माध्यम Iscove संशोधित Dulbecco के माध्यम (आईएमडीएम) 1x
भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) 2% (वी / वी)
पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 1x
पेप्टाइन प्रीमाइटोन 0.3 मिलीग्राम / एमएल
इंसुलिन समाधान मानव 4.8 मिलीग्राम / एमएल
न्यूनतम आवश्यक माध्यम गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एमईएम एनईएए) 1x
लीक नमक बफर लिथियम क्लोराइड (लीक्ल) 0.25 एम
IGEPAL-CA630 1% (वी / वी)
एथीलेनियामियानेटेट्रैटेसेटिक एसिड (ईडीटीए) पीएच 8.0 1 मिमी
ट्राइस-एचसीएल पीएच 81 10 मिमी
कम नमक बफर सोडियम डाइडेस्किल सल्फेट (एसडीएस) 0.1% (डब्ल्यू / वी)
ट्राइटन एक्स -100 1% (वी / वी)
एथीलेनियामियानेटेट्रैटेसेटिक एसिड (ईडीटीए) पीएच 8.0 2 मिमी
ट्राइस-एचसीएल पीएच 8.1 20 मिमी
सोडियम क्लोराइड (NaCl) 150 मिमी
प्रोटीन एक Sepharose मोती वॉशिंग बफर ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0 20 मिमी
सोडियम क्लोराइड (NaCl) 500 मिमी
एथीलेनियामियानेटेट्रैटेसेटिक एसिड (ईडीटीए) पीएच 8.0 2 मिमी
सोडियम डाइडेस्किल सल्फेट (एसडीएस) 0.1% (डब्ल्यू / वी)
IGEPAL-CA630 1% (वी / वी)
एसडीएस Lysis बफर सोडियम डाइडेस्किल सल्फेट (एसडीएस) 1% (डब्ल्यू / वी)
EthylenediAminetetraacetic एसिड (EDTA) पीएच 8.0 10 मिमी
ट्राइस-एचसीएल पीएच 8.1 50 मिमी
ते बफर ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0 10 मिमी
एथीलेनियामियानेटेट्रैटेसेटिक एसिड (ईडीटीए) पीएच 8.0 1 मिमी

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल बफ़र्स और माध्यम की सूची।

पर बंद
चरम शक्ति 150.0 2.5
कर्तव्य कारक 15.0 15.0
साइकिल / फट 500 500
चक्र की संख्या 28

तालिका 2: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली कतरन सेटिंग्स इन शर्तों को परिपक्व माउस टी-सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया गया है।

एंटीबॉडी प्रदायक एंटीबॉडी / इम्युनोपर्रेबिज की मात्रा कोशिकाओं की मात्रा / इम्युनोपेरेग्रेशन धुलाई की स्थिति
H3 एबकैम (एबी -1791) 2.5 मिलीग्राम 5 x 10 6 कम नमक बफर में एक बार, दो नमक बफर में दो बार, लीक नमक बफर में दो बार और ते बफर में तीन बार
H3K4me1 एबकैम (एबी 88 9 5) 2.5 मिलीग्राम 5 x 10 6 कम नमक बफर में एक बार, दो नमक बफर में दो बार, लीक नमक बफर में दो बार और ते बफर में तीन बार
H3K4me3 डायजेनोड (पीएबी-003-050) 2.5 मिलीग्राम 5 x 10 6 कम नमक बफर में एक बार, दो नमक बफर में दो बार, लीक नमक बफर में दो बार और ते बफर में तीन बार
H3K27ac डायजेनोड (पीएबी-174-050) 2.5 मिलीग्राम 5 x 10 6 कम नमक बफर में ओस, उच्च नमक बफर में दो बार, लीक नमक बफर में दो बार और ते बफर में तीन बार
आईजीजी डायजेनोड (सी 15410206) चर * चर * चर *
* आईजीजी नियंत्रण के मामले में, एंटीबॉडी और कोशिकाओं दोनों की मात्रा, साथ ही साथ धोने के कदमों को अन्य इम्युनोपीसिपेट्स की शर्तों को दर्पण करना पड़ता है।

तालिका 3: इस अध्ययन में प्रयुक्त एंटीबॉडी और वॉशिंग की स्थिति।

जीन आगे प्राइमर रिवर्स प्राइमर जांच
गपध प्रमोटर (0 केबी) 5'-जीजीजी टीटीसी सीटीए टीएए एटीए CGG एक्ट जीसी -3 ' 5'-सीटीजी जीसीए सीटीजी सीएसी एएजी एएजी ए -3 ' 68
डीटीएक्स 1 बढ़ाने (+26 केबी) 5'-सीटीसी टीजीजी जीटीटी जीटीए जीजीजी जीएसी एजी -3 ' 5'-जीसीए टीजीजी जीएटीटीजी टीजीटी टीएसी आगा ए 3 ' 27
जीन रेगिस्तान 5'-सीएए टीजीसी एटीजी जीजीटी सीसीए जीएटी टीटी -3 ' 5'-एटीटी जीजीसी एसीजी जीएए जीटीए जीटीजी सीटी -3 ' 94

तालिका 4: इस अध्ययन में qPCR के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर्स और जांच।

मुसीबत कारण उपाय
Chromatin sheared के अंतर्गत है और टुकड़े बहुत बड़ी हैं। बहुत से कोशिकाओं का उपयोग किया गया है कोशिकाओं की संख्या कम करें
बाल काटना बहुत कम है कतरनी चक्र की संख्या में वृद्धि
कतरनी शिखर की शक्ति बढ़ाएं, कर्तव्य कारक और / या चक्र / फट
क्रोमैटिन की मात्रा कम है और टुकड़े बहुत छोटे हैं। बहुत कम कोशिकाओं का उपयोग किया गया है कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि
बाल काटना बहुत अधिक है कतरनी चक्र की संख्या कम करें
कतरनी शिखर की शक्ति कम करें, कर्तव्य कारक और / या चक्र / फट।
I पर बहुत कम वसूलीजीजी नियंत्रण और / या नकारात्मक नियंत्रण (उच्च पृष्ठभूमि) प्रयोग के लिए पर्याप्त क्रोमेटिन इस्तेमाल नहीं किया गया क्रोमेटिन की मात्रा में वृद्धि
एंटीबॉडी की मात्रा बहुत कम है एंटीबॉडी की मात्रा में वृद्धि
एंटीबॉडी की मात्रा बहुत अधिक है एंटीबॉडी की मात्रा कम करें
एंटीबॉडी में कम विशिष्टता है एंटीबॉडी बदलें
धुलाई की स्थिति बहुत कड़े हैं। धोने की संख्या कम करें
धोने के बफ़र्स की कटाई कम करें
धुलाई की स्थिति काफी कड़े नहीं है धोने की संख्या में वृद्धि
धोने के बफ़र्स की कटाई बढ़ाएं।
QPCR में बहुत अधिक डीएनए pipetted था QPCR में pipetted डीएनए की मात्रा कम करें।
QPCR शर्तों इष्टतम नहीं हैं QPCR स्थितियों को ऑप्टिमाइज़ करें
चक्र की संख्या कम करें
इनपुट नमूने की qPCR प्रतिक्रिया में कोई उत्पाद या उत्पाद बहुत कम नहीं है। QPCR में पर्याप्त डीएनए नहीं था। QPCR में डीएनए की pipetted की मात्रा बढ़ाएँ।
QPCR शर्तों इष्टतम नहीं हैं QPCR स्थितियों को ऑप्टिमाइज़ करें
चक्र की संख्या में वृद्धि
प्रयोग के लिए पर्याप्त क्रोमेटिन इस्तेमाल नहीं किया गया क्रोमेटिन की मात्रा में वृद्धि
सकारात्मक नियंत्रण और / या पैनएच 3 चिप में कोई संकेत नहीं। प्रयोग के लिए पर्याप्त क्रोमेटिन इस्तेमाल नहीं किया गया क्रोमेटिन की मात्रा में वृद्धि
एंटीबॉडी की मात्रा बहुत कम है एंटीबॉडी की मात्रा में वृद्धि
विरोधीशरीर की कम विशिष्टता है एंटीबॉडी बदलें
अल्युशन उप इष्टतम है समाधान में मोतियों को बनाए रखने के लिए अक्सर नमूने भंवर सुनिश्चित करें।

तालिका 5: समस्या निवारण

Discussion

चिप एक विशिष्ट तकनीक है जो जांच कर रहा है कि प्रोटीन या उनके पीटीएम विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों में समृद्ध हैं या नहीं। चिप परख परिणाम अक्सर जैविक या तकनीकी कारणों की वजह से व्याख्या करने के लिए चुनौतीपूर्ण होते हैं। जैविक कारण बहुत से होते हैं और इसमें डीएनए के लिए प्रोटीन की कमजोर या अप्रत्यक्ष बंधन शामिल है। इसमें तकनीकी सीमाएं भी हैं, जैसे कि सीमित एंटीबॉडी विशिष्टता और अक्षम सेल सेल या लिपटाइन की मात्रा। एक समस्या निवारण गाइड ( तालिका 5 ) रीढ़ की हड्डी के साथ समस्याओं का समाधान करने के लिए पाठक को मदद कर सकता है।

यह प्रोटोकॉल, शीतलन केंद्रित ultrasonicator डिवाइस का उपयोग करता है, जिससे कि एक परिपक्व माउस T-cell लाइन के क्रोमेटिन को कुशलतापूर्वक कतरनी की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल का मुख्य महत्वपूर्ण चरण क्रोमेटिन के कवच द्वारा दर्शाया जाता है, जिसे हमेशा प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह कोशिकाओं की संख्या और सोनिक चक्र की संख्या भिन्न करने का सुझाव दिया गया है। इसके अलावा, वह एसडीएस की उपस्थिति से नकारात्मक प्रभाव पड़ता है, जो नमूनों में प्रक्षेपित होता है, जो एसडीएस बिसर के साथ बर्फ पर कोशिकाओं के विश्लेषण के दौरान हो सकता है। इस मामले में, एसडीएस की उपस्थिति को कम करने के लिए कुछ मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एलिसेशन के बाद नमूना सेवन करना सबसे अच्छा होता है। यह प्रोटोकॉल को 200 से 500 बीपी के बीच शेड टुकड़े प्राप्त करने और इम्युनोपेरैगिज के साथ आगे बढ़ने से पहले नमूने की कतरनी की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए अनुशंसित है। इसके अतिरिक्त, निर्धारण समय, एंटीबॉडी और / या कोशिकाओं की मात्रा, और धोने की स्थिति को प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

चिप प्रक्रिया सफल बनाने में एक और महत्वपूर्ण कदम एंटीबॉडी का विकल्प है, क्योंकि कम विशिष्टता वाले एंटीबॉडी ने इम्युनोपेरेएबजी की दक्षता को काफी कम कर दिया है। इससे पहले, बाजार में उपलब्ध कई एंटीबॉडी की विशिष्टता के मूल्यांकन के लिए एक एकीकृत गुणवत्ता परीक्षण प्रक्रिया की अनुमति दी गई थी Ss = "xref"> 1 9 स्क्रीनिंग पाइप लाइन, डॉट ब्लोट, वेस्टर्न ब्लॉट, और चिप पर आधारित थी, जिसमें चिप 19 के लिए उपयुक्त उच्च गुणवत्ता वाला अभिकर्मकों की सूची उपलब्ध है। हाल ही में, कई वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी की विशिष्टता का मूल्यांकन उच्च घनत्व हिस्टोन पेप्टाइड माइक्रोएरे प्लेटफार्मों के द्वारा किया गया था, जो कि एंटीबॉडी विशिष्टता 20 पर एक डेटाबेस की स्थापना के लिए अनुमति देता है। चिपर प्रयोगों के लिए उपयोग किए जा सकने वाले सबसे विशिष्ट एंटीबॉडी की पहचान करने के लिए रीडर इस उपयोगी उपकरण का उपयोग कर सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल को प्राथमिक टी-कोशिकाओं के लिए परीक्षण नहीं किया गया है और, इस मामले में, पाठक को अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल का उल्लेख करना चाहिए जो सफलतापूर्वक प्राथमिक टी-कोशिकाओं 3 , 4 , 21 पर चिप का प्रदर्शन कर रहे हैं। विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक माउस उत्प्रेरक टी सेल लाइन पर चिप के साथ-साथ माउस एंडोथेलियल सेल लाइन पर भी प्रदर्शन करने के लिए उपयोग किया गया है।

Ove_content "> 5 x 10 6 कोशिकाओं को हिस्टोन अंकों के विश्लेषण के लिए प्रत्येक immunoprecipitation के लिए उपयोग किया जाना चाहिए। क्योंकि यह प्रोटोकॉल कुछ ऑप्टिमाइज़ेशन के साथ, TFs या cofactors पर चिप करने के लिए उपयुक्त भी हो सकता है, यह कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करना सबसे अच्छा है इन मामलों में immunoprecipitation के लिए उपयोग किया जाता है। प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक संख्या में कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए, कमजोर पड़ने वाले बफर में क्रोमेटिन को कम करने से पहले शेयर्ड लाइसेट के अधिक अलोकुट को एक साथ जमा किया जा सकता है।

डीएनए को सीधे बाँध नहीं करते हैं जो अंतर्जात प्रोटीन पर चिप करने के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया जा सकता है। इस मामले में, प्रोटीन-प्रोटीन क्रॉटलिंकर्स ( जैसे, डाइमिथाइल एडिपिमिडेट, डीएमए) के साथ पूर्व-निर्धारण की आवश्यकता हो सकती है (अधिक जानकारी के लिए परिशिष्ट बी देखें)। कॉफ़ेक्टर्स पर चिप के सफल प्रदर्शन को पहले से ही प्रोटीनों के बायोटीन-टैग में लगाए जाने वाले प्रोटीनों द्वारा किया गया था। इस मामले में, प्रोटीन को स्ट्रेक्टिविडिन-कंजुगा से शुद्ध किया गया थाटेड चुंबकीय मोतियों, और डीएमए के साथ एक पूर्व निर्धारण 22 प्रदर्शन किया था।

Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतियोगी वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए हम पी। केस और टी। श्मिट-वॉल का आभारी हैं। यह काम सहयोगी अनुसंधान अनुदान TRR81 और डीएफ़जी (जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन), मैक्स प्लैंक सोसायटी और फ्रीबर्ग में एसीसी 2 9 4 के हाइजेनबर्ग कार्यक्रम (बीओ 1639 / 5-1) और कार्डियो पल्मोनरी सिस्टम के लिए उत्कृष्टता क्लस्टर द्वारा समर्थित था (ईसीसीपीएस) जीएससेन में टीबी

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent High Sensitivity D5000 Reagents Agilent Technologies 5067-5593
Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5592
Agilent Tapestation 4200 Agilent Technologies G2991AA
Covaris S220 AFA System Covaris 500217
dimethyl adipimidate (DMA) Thermo Fisher Scientific 20660
Fetal bovine serum (FBS) Pan-Biotech 1502-P121301
Formaldehyde (FMA) Sigma-Aldrich F8775
Insulin solution human  Sigma-Aldrich I9278-5ML
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM) Gibco 21980-032
Minimum essential medium non-essential amino acids (MEM NEAA) Gibco 11140-035
nProtein A Sepharose 4 Fast Flow GE Healthcare 17-5280-02
Penicillin-Streptomycin
(10,000 U/mL)		 Gibco 15140-122
Peptone primatone Sigma-Aldrich P4963-100G
Phase Lock Gel Heavy 2 mL 5 Prime 2302830
Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) Roth A156.2
Phosphate-buffered saline (PBS) GIBCO 14190-094
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade Thermo Fisher Scientific 25530049
QIAquick PCR Purification Kit (250) Qiagen 28106
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit assay tubes Thermo Fisher Scientific Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) Thermo Fisher Scientific EN0531
Tube AFA Fiber & Cap Covaris 520081

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References

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आनुवंशिकी अंक 124 चिप एच 3 के 4me1 एच 3 के 4 मिमी 3 एच 3 के 27 एके एच ​​3 हिस्टोन अंक सोयाइटिंग बाल काटना क्रोमैटिन विनियमन ट्रांसक्रिप्शन।
माउस टी-सेल लाइनों में क्रोमैटिन इम्युनोपेरिगेशन (चिप)
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Giaimo, B. D., Ferrante, F., Borggrefe, T. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines. J. Vis. Exp. (124), e55907, doi:10.3791/55907 (2017).

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