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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

UNE Published: July 26, 2017 doi: 10.3791/55939
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, Queen's University, 2Centre for Neuroscience, Queen's University

Summary

Ici, nous présentons un dosage spécifique de Caenorhabditis elegans conçu pour évaluer les changements dans le comportement d'aversion au cuivre et la capacité de localiser une source alimentaire commune, à mesure que l'organisme progresse d'un état nutritionnel nourri à un affamé.

Abstract

Pour assurer la survie, les organismes doivent être capables d'éviter des habitats défavorables tout en assurant une source alimentaire constante. Caenorhabditis elegans modifie ses caractéristiques locomotrices lors de la détection de divers stimuli environnementaux et peut moduler leur suite de réponses comportementales en réponse à des conditions de famine. Les nématodes présentent généralement une diminution de la réponse aversive lorsqu'ils sont éliminés d'une source alimentaire pendant plus de 30 minutes. L'observation des changements comportementaux en réponse à un état nutritionnel changeant peut donner un aperçu des mécanismes qui régulent la transition d'un état bien nourri à un état affamé.

Nous avons développé un dosage qui mesure la capacité d'un nématode à traverser une barrière aversive ( c.-à-d. Le cuivre) puis atteindre une source alimentaire pendant une période prolongée. Ce protocole s'appuie sur les travaux antérieurs en intégrant plusieurs variables d'une manière qui permet une collecte continue de données lorsque les organismes se déplacent vers unN condition de plus en plus affamé. En outre, ce dosage permet une augmentation de la taille de l'échantillon afin que les populations de nématodes plus grandes puissent être évaluées simultanément.

Les organismes défectueux pour détecter ou répondre au cuivre traversent immédiatement la barrière chimique, alors que les nématodes de type sauvage sont initialement repoussés. Comme les vers de type sauvage sont de plus en plus affamés, ils commencent à traverser la barrière et à atteindre la source de nourriture. Nous avons conçu ce dosage pour évaluer un mutant incapable de répondre à des indices environnementaux divers, y compris la sensation alimentaire ou la détection de produits chimiques aversifs. Lorsqu'ils ont été évalués via ce protocole, les organismes défectueux ont immédiatement traversé la barrière, mais ont également été incapables de détecter une source de nourriture. Par conséquent, ces mutants traversent à plusieurs reprises la barrière chimique malgré une entrée temporaire d'une source alimentaire. Ce test permet de tester directement les populations de vers afin d'évaluer les défauts potentiels liés à l'aversion et à la famine.

Introduction

Caenorhabditis elegans a été utilisé comme modèle pour l'étude de la neurobiologie pendant des décennies en raison de la facilité relative dans l'analyse des circuits d'un système nerveux composé de seulement 302 neurones 1 . Pourvu que l'organisme dépend de la réponse aux signaux environnementaux, une grande partie du système nerveux est dédié à la régulation de l'intégration des signaux environnementaux 2 . Malgré la simplicité de son système nerveux, C. elegans peut détecter et répondre à divers signaux environnementaux, y compris les répulsifs 3 , les attractifs 4 , la température 5 et même l'humidité 6 . Un échec à intégrer correctement les signaux environnementaux a été lié à un certain nombre de troubles du comportement et des états neurodégénératifs dans les systèmes modèles de mammifères 7 à 9 . Avec une gamme de modèles disponibles de maladies neurales 10 dans C. elegans et le développement des écrans pharmaceutiques de nématodes 11 , cet organisme s'est avéré être un système utile pour l'étude de la neurobiologie. Compte tenu de la disponibilité d'un connecteur 1 de nématode cartographique et de mutations de presque tous les gènes du génome 12 du nématode, notre compréhension du système nerveux des nématodes et, par extension, est partiellement limitée par la conception d'essais créatifs appropriés.

Un certain nombre de tests de chimiotaxis ont été développés au cours des 40 dernières années pour évaluer la réactivité des nématodes à divers stimuli aversifs 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . L'expérimentation initiale impliquait l'introduction d'une stimulation environnementale aiguë tandis qu'un seul ver gremed sur une plaque d'agar= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Les modifications immédiates apportées aux réponses locomotrices ont été enregistrées. Par exemple, l'octanol odorant volatil peut être appliqué sur un cheveu et flanqué devant le nez d'un nématode pour stimuler l'initiation de la locomotion vers l'arrière dans les vers sauvages 17 . Des tests plus complexes ont également été développés pour incorporer de multiples variables comme moyen d'évaluer le choix du comportement 18 . Une variation de ce dosage implique l'utilisation d'une solution de cuivre pour créer une barrière de ligne médiane aversive 4 . Un attirant, à savoir le diacétyle, a été placé d'un côté de la barrière chimique avec des vers transférés à l'écart de la source de diacétyle. Les vers défectueux pour les réponses aversives au cuivre ont immédiatement traversé la barrière pour atteindre le diacétyle, tandis que les vers de type sauvage ont d'abord été repoussés par la barrière. Les réponses ont été marquées lorsque les vers se sont approchés de la barrière de cuivreSans observations à long terme.

Lorsque les vers sont évalués après avoir subi des conditions de famine, leur sensibilité aux stimuli environnementaux diminue 19 . Lorsque l'octanol chimique aversif est flotté devant le nez des nématodes, les organismes de type sauvage stimulent le mouvement vers l'arrière en 3 à 5 s lorsqu'ils sont alimentés. Après que ces organismes ont été retirés des aliments pendant 10 min, ils présentent une réponse retardée de 8 à 10 s 20 . Ainsi, avec une famine accrue, les nématodes affichent une diminution de la réponse aversive aux signaux environnementaux nuisibles car la recherche d'aliments devient plus essentielle à la survie. À l'inverse, les nématodes qui exagèrent le récepteur neuropéptidique 9 ( npr-9) ne répondent pas à l'octanol sur ou hors de l'alimentation et présentent une incapacité à répondre à un certain nombre de stimulants aversifs 21 . Ces organismes npr-9 (GF) ne modulent pas non plus leur fréquence d'inversion en présence d'aliments, mais peuventInversée en réponse à des stimulations tactiles sévères indiquant qu'elles sont capables de se déplacer vers l'arrière 21 . Nous avons également évalué les mutants npr-9 (LF) étant donné qu'ils présentent une fréquence d'inversion anormalement diminuée des aliments, mais peuvent moduler leur comportement en présence de nourriture 21 . Le couplage de l'état nutritionnel du ver avec l'introduction de stimuli externes aiguë a aidé à élucider les mécanismes par lesquels une voie alimentaire peut moduler largement les voies de signalisation sensorielle 22 , 23 . La présence d'aliments dans l'environnement des nématodes a également été utilisée pour évaluer les réponses au retrait de l'éthanol 24 . Dans cette expérience, les vers ont été incubés à différentes concentrations d'éthanol, puis ont été placés sur une plaque d'agar avec un morceau de nourriture connu sous le nom de "test de race alimentaire". Le patch alimentaire a été placé sur un bord de la plaque alors que les nématodes wÉtaient séparés de la source de nourriture. Le retrait de l'éthanol a été évalué en mesurant la durée de temps nécessaire pour que les vers atteignent le morceau de nourriture.

Ce test d'aversion en cuivre à base de nutriments s'appuie sur l'analyse alimentaire pour intégrer d'autres variables environnementales, à savoir l'alimentation et le cuivre, tout en évaluant les changements de comportement dans le temps. Il s'agit d'une adaptation d'un protocole communément utilisé dans la communauté de C. elegans 4 . Ce protocole a été utilisé pour évaluer les réponses aversives et la détection des aliments sur une période de quatre heures 21 . Étant donné que les comportements de famine de l'exposition de ver après 30 minutes de privation de nourriture 25 , nous sommes également en mesure d'évaluer comment les changements d'état nutritionnel peuvent influencer les réponses environnementales. Les conditions de ce dosage mesurent la façon dont les organismes expérimentaux changent de réactivité aux stimuli aversifs au fil du temps, ce qui évalue les changements de comportement commeLes organismes progressent vers un état affamé (et des mesures continues de la famine prolongée). Étant donné que les animaux npr-9 (GF) ne modifient pas leur comportement en réponse à de la nourriture ou de nombreux indices aversifs, nous avons cherché à identifier si ces déficits comportementaux persisteraient dans le contexte de la famine. En fin de compte, cette conception de dosage a été formulée pour évaluer spécifiquement les mutants npr-9 (GF) mais peut être davantage adaptée pour caractériser également de nouvelles souches.

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Protocol

1. Préparation des organismes expérimentaux

  1. Choisissez 10 nématodes en phase L4 par souche 24 h avant de commencer l'essai afin de s'assurer que les organismes sont de jeunes adultes lorsqu'ils sont testés. Pour chaque mutant ou nématode de contrôle testé, choisissez 10 L4 (10 pour le contrôle et 10 pour l'essai).
    1. Maintenir les organismes L4 en utilisant des méthodes standard 26 , 27 pendant 24 h sur des plaques de gélose standard ensemencées avec OP50 Escherichia coli . Si des organismes sont perdus pendant les étapes de lavage suivantes, compensez en augmentant la taille de l'échantillon de départ ( c.-à-d., Choisissez 20 vers plutôt que 10).
      Note: Le comportement est un phénotype indépendant. Effectuez la méthode en trois exemplaires pour chaque souche sur trois jours distincts. Inclure des souches de contrôle supplémentaires et des conditions pour de nouvelles souches, comme l'a souligné la section de discussion.
  2. Immédiatement avant l'analyse, transférer l'orga expérimentaleÀ une plaque de gélose sans bactéries et permet aux nématodes de se déplacer librement pendant 1 min pour éliminer les excès de bactéries.
    1. Si les organismes expérimentaux ont subi des conditions de contamination pendant les 24 heures précédant l'essai, les jeter.
  3. Pipetter 1 mL de M9 sur la plaque sans bactéries pour laver les vers dans un tube à microcentrifugeuse.
  4. Centrifuger à 3 000 xg pendant 1 min. Les vers doivent former une pastille au bas du tube. Aspirer la solution M9 sans perturber la pastille de ver. Ajouter 1 mL de M9 à la pastille de ver, inverser le tube pour mélanger les vers avec la solution.
  5. Répétez les étapes 1.4 trois fois de plus.
    1. Si l'excès de bactéries a été initialement transféré avec les vers, répétez pour un total de 5 fois. Aucune bactérie ne doit être transférée aux plaques de cuisson de cuivre. Si les aliments sont transférés à la plaque de dosage, cela entravera la collecte précise des données.
  6. Après le lavage final, aspirer le surnageant jusqu'à 10081; L de M9 et la boulette de ver est restée.
    Attention: les comportements liés à la famine deviennent évidents après 30 min. Par conséquent, les vers doivent être immédiatement transférés de la solution une fois que les étapes de lavage ont été achevées.

2. Préparation des plaques de dosage

  1. Préparer des plaques d'agar NGM standard deux jours avant l'essai.
    1. Si les plaques sont conservées dans un environnement humide, faire des plaques d'agar 3 jours avant le dosage. Sinon, retirez le couvercle de la plaque pendant 3 à 6 h pour assurer une sécheresse adéquate (si dans un environnement stérile).
  2. Avec un marqueur permanent épais, faites une ligne sur la face inférieure de la plaque le long du bord extérieur et une autre pour former une barrière intermédiaire ( Figure 1 ). La barrière de ligne médiane doit être équidistante de chaque bord de la plaque. Utilisez une règle pour assurer des mesures précises. Ces lignes serviront de guide lors du transfert de bactéries et de la solution de cuivre. À condition queE. coli est transféré avant la solution de cuivre, ces lignes serviront d'indicateurs.
  3. Plaque de semence avec 50 μL d'OP50 E. coli sur un seul côté de la barrière de cuivre pour créer une pelouse uniforme ( Figure 2 ). La concentration bactérienne devrait rester constante dans les dosages; Cependant, une faible variabilité a été observée en réponse à des différences légères de concentration.
    1. Utilisez les lignes marquées sur la partie inférieure de la plaque pour s'assurer que les bactéries ne sont pas en contact avec la solution de cuivre. Pourvu que la solution de cuivre traverse le bord de la plaque et forme une barrière de ligne médiane, transférez les bactéries afin que la solution de cuivre ne soit pas en contact avec la source de nourriture.
  4. Marquez un deuxième ensemble de plaques et ne transférez pas de E. coli OP50 ( Figure 2 ). Ces plaques serviront à évaluer le contrôle négatif. Ces plaques devraient également avoir unMarquant sur une moitié de la plaque pour indiquer l'origine initiale du transfert.
  5. Permettre aux bactéries de sécher puis d'incuber les plaques à 37 ° C pendant une nuit. Assurez-vous que les taches bactériennes ne sont pas perturbées lors du transfert vers un incubateur ou une pièce de 37 ° C. Une perturbation excessive pourrait altérer l'emplacement ou la forme du patch alimentaire.

3. Test de chimiotaxie

  1. Préparer à nouveau une solution de sulfate de cuivre (II) 0,5 M avant l'heure de début du dosage. Pourvu que 125 μL de la solution soit utilisé par plaque, augmenter ce volume en fonction du nombre de plaques de dosage utilisées ( par exemple, 5 plaques de dosage, 625 μL).
  2. Pipetter 100 μL de la solution de sulfate de cuivre (II) sur le bord de la gélose pour créer une barrière extérieure en cuivre. Le dessous marqué de la plaque devrait servir de guide.
  3. Pipettez 25 μL de la solution de sulfate de cuivre (II) pour créer une barrière de ligne médiane.
    1. Assurez-vous que la solution de sulfate de cuivre (II) neEs pas entrer en contact avec le patch bactérien. Utilisez une technique tachetée, car les rayures peuvent affecter la locomotion en raison des indentations / rayures sur la gélose.
  4. Laisser sécher la solution de cuivre sur la plaque. La période peut varier en fonction des conditions de la plaque et du laboratoire. Vérifier visuellement la sécheresse toutes les 5 minutes après le transfert.
    Remarque: La solution de cuivre présente une teinte bleuâtre et est facilement identifiable. Utilisez un mouchoir de laboratoire pour mouiller légèrement la solution près du bord de la plaque pour discerner la sécheresse.
  5. Pipettez 20 μL de la pastille de ver du bas du tube sur la moitié libre de bactéries de la plaque de dosage.
    1. Assurez-vous que 10 vers sont transférés à la plaque de dosage. Si des vers supplémentaires ont été inclus accidentellement, retirez-les en choisissant avec de l'huile d'halocarbon pour s'assurer qu'aucune bactérie ne soit ajoutée à la plaque. Chaque dosage devrait avoir un nombre constant de nématodes pendant le dosage.
      REMARQUE: si trop peu de vers sont transfA commis une erreur lors des essais, l'augmentation de la taille initiale de l'échantillon permettra d'atténuer les pertes potentielles lors des lavages et des transferts.
  6. Retirer l'excès de M9 de la plaque avec un tissu de laboratoire. M9 ne devrait pas entrer en contact avec la solution de sulfate de cuivre (II).
    Attention: assurez-vous que les vers et la surface de la gélose ne sont pas affectés lors de cette étape. Si utilisé trop dur, le tissu de laboratoire peut créer des indentations sur la surface de gélose de la plaque et peut éliminer les vers. Les vers accidentellement éliminés via KimWipe doivent être éliminés.
  7. Une fois que la solution M9 a été retirée et que tous les vers ont commencé des modèles de locomoteurs non liquides, démarrez le chronomètre d'essai.
    1. Optimalement, retirer la solution M9 dans un min. Le paramètre essentiel est l'identification de la locomotion sinusoïdale. Les vers englobent différemment, p . Ex. Battant plutôt que sinusoïdal, lorsqu'ils sont liquides. Commencez le chronomètre d'essai une fois que chaque organe expérimentalL'iso ne cesse de se débattre.
  8. Vérifier les plaques d'essai toutes les 30 min.
    1. Pour les plaques de dosage avec des taches bactériennes, on obtient des grappes positives s'ils atteignent le patch alimentaire sur une période de 4 h. Pour les plaques de contrôle négatives, marquer positivement les organismes s'ils ont traversé la barrière.

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Representative Results

Nous avons utilisé une souche de surexpression de type sauvage (N2), npr-9 (tm1652) et npr-9 , c'est -à- dire npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), pour évaluer les réponses à la famine et à l'aversion au cuivre. Les organismes de type sauvage sont capables de détecter et de répondre à la barrière de cuivre aversive, tandis que les mutants npr-9 (GF) n'initialisent pas une réponse aversive au cuivre au cours du test de 4 h 21 . Après 30 minutes de famine, environ 50 à 60% des organismes de type sauvage (N2) traversent la barrière de cuivre et atteignent le patch alimentaire. À la marque de 2 h, 75% des nématodes de type sauvage atteignent la source de nourriture. À la fin de l'analyse, 100% des organismes N2 se sont déplacés vers la source alimentaire. En revanche, la majorité des organismes npr-9 (GF) ne modulent pas les caractéristiques locomotrices en réponse à la nourriture et continueront à traverser la barrière aversive même après avoir pris contact avec un alimentla source. Les vers Npr-9 (GF) ne modifient pas continuellement leur locomotion en réponse aux aliments pendant le dosage de 4 h et seulement 30% des organismes d'essai se trouvent sur les aliments à un moment donné. Les animaux npr-9 (LF) ne fonctionnent pas aussi bien que les organismes N2, mais modulent leurs modèles de locomotrie à mesure que la famine augmente pour atteindre le patch alimentaire ( Figure 3 ). Lorsque les organismes N2 ou npr-9 (LF) sont évalués via ce dosage sans nourriture, ils traversent rarement la barrière du cuivre. Les mutants npr-9 (GF) traversent à plusieurs reprises la barrière d'avant en arrière ( Figure 4 ).

Figure 1
Figure 1 : Une représentation visuelle des marques pour indiquer le placement de la solution de cuivre sur le dessous d'une plaque de Petri de 5 cm. Ces indications servent à assurer queLes sections de la plaque ont été mesurées de manière appropriée et servent de guide pour transférer le patch bactérien et ensuite la solution de cuivre sur la surface de la gélose. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : La plaque de Petri de 5 cm est divisée en deux sections pour les plaques de dosage alimentaire et la pelouse bactérienne est formée dans le centre de l'une de ces sections pour la plaque sur place. Le patch alimentaire ne doit pas entrer en contact avec le composé d'essai qui traverse les bords de la plaque et forme une barrière de la ligne médiane. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

<P class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> figure 3
Figure 3 : Pourcentage de vers N2, npr-9 (tm1652) et npr-9 (GF) qui atteignent la source alimentaire au cours d'une période de quatre heures en réponse à l'essai d'aversion en cuivre à base d'état nutritionnel. Les points de données sont des moyennes d'au moins trois expériences (n> 30 vers) effectuées sur des jours distincts pour les deux souches. Les données sont présentées en moyenne ± erreur standard et analysées avec une ANOVA à deux sens répétée. ** p <0,01, significativement différent des animaux N2 dans des conditions identiques. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Pourcentage de N2, npr-9 (tm1652) et npr-9 (GF) W orms qui traversent la barrière de cuivre sans source alimentaire sur un essai de quatre heures. Les souches précitées ont été évaluées pour l'aversion en cuivre en l'absence de nourriture. Les réponses positives sont notées comme traversant la barrière de cuivre et restant sur la moitié non-originale de la plaque. Les points de données sont des moyennes d'au moins trois expériences (n> 30 vers) effectuées sur des jours distincts pour les deux souches. Les données sont présentées sous la forme moyenne ± SE et au moins 10 animaux ont été testés dans trois expériences indépendantes analysées avec une ANOVA à deux voies à répétition. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Cette conception de dosage modifie l'essai de course alimentaire 24 pour inclure une solution de cuivre pour créer une barrière de ligne médiane aversive et autour du bord de la plaque pour empêcher une perte de nématodes. Les organismes sont testés pour leur capacité à traverser la barrière aversive et à atteindre un patch alimentaire sur une période de 4 h. Dans le contexte de npr-9 (GF) , nous avons utilisé ce dosage pour évaluer comment les conditions de famine pourraient affecter les réponses aversives et la détection des aliments. Pourvu que nous ayons précédemment caractérisé npr-9 (GF) comme défectueux pour la réactivité à la nourriture et les indices aversifs, nous avons combiné plusieurs indices environnementaux avec l'état nutritionnel pour évaluer si la famine pouvait moduler les comportements défectueux npr-9 (GF) . Ce dosage repose sur la capacité d'un ver à détecter et à répondre aux stimuli chimiques et aux signaux alimentaires 3 , 4 . Compte tenu des diverses variables analysées, les conditions de l'exLes organismes expérimentaux doivent être contrôlés méticuleusement pour éliminer les facteurs de confusion. Pour les mutants non caractérisés, c'est -à- dire ceux qui présentent une aversive inconnue ou une réactivité alimentaire, des souches de contrôle supplémentaires devraient être utilisées. Les souches défavorisées avides, p.ex. che-2 ou odr-3 28 , et les mutants qui ne modifient pas les modèles de locomotricité hors des aliments, p . Ex. Tph-1 29 , devraient également être évalués en parallèle pour s'assurer que le cuivre et les conditions de famine sont correctement contrôlés. En outre, pour mettre plus directement en évidence la contribution de la famine au comportement évalué, des conditions de dosage distinctes peuvent également être développées pour des contrôles supplémentaires. Par exemple, les nématodes peuvent être affamés immédiatement avant le dosage et transférés dans la plaque de dosage (avec des aliments) afin d'identifier à quelle vitesse un organisme dans un état affamé réagira au cuivre et atteindra le patch alimentaire. Notre analyse actuelle souligne avErsive réponses que les organismes expérimentaux progressent d'un bien alimenté à l'état affamé.

Notre dosage est une modification du test de chimiotaxie C. elegans couramment utilisé 4 dans lequel un stimulus plus fort ( c. -à-d. Une concentration élevée) a été incorporé afin d'évaluer les comportements sur une période plus longue. Plutôt que d'évaluer des réponses instantanées, ce dosage peut être utilisé pour mesurer les changements dans les réponses aversives à mesure que les organismes progressent vers un état affamé (si les contrôles nécessaires sont inclus). Des évaluations similaires ont été utilisées en l'absence de cuivre afin d'évaluer les réponses au retrait de l'éthanol, c'est-à - dire les nématodes qui localisent les aliments au fil du temps 24 .

Comme c'est le cas avec un dosage comportemental chez C. elegans, le contrôle des variables environnementales est essentiel pour assurer des résultats constamment reproductibles. Les organismes doivent tous être de la même agE, étant donné que les réponses comportementales peuvent varier selon l'âge. En outre, la variabilité de l'état nutritionnel des vers peut modifier l'acclimatation dans les conditions de famine. Par conséquent, les vers expérimentaux ne devraient pas subir de famine à aucun point avant ce protocole. L'expérience de la génération de parents par la famine peut également influencer le comportement de la progéniture 30 ; Par conséquent, il est conseillé de s'assurer que les organismes expérimentaux sont bien alimentés pendant au moins deux générations. De plus, le nombre d'organismes transférés dans les plaques de dosage devrait rester constant étant donné que la densité de la population locale peut influencer les taux de dispersion 31 . Une fois que les vers ont été transférés sur les plaques, il est essentiel d'éliminer l'excès de solution M9 avec un tissu de laboratoire sans endommager la surface de la gélose. L'altération de la surface peut entraver les phénomènes spontanés de localisation. L'excès de solution doit être supprimé de manière appropriée avant de commencer le début officiel deLe dosage pour s'assurer que le comportement de dérapage, c'est-à - dire un modèle de locomotorie des nématodes observé dans le liquide, n'est pas présent. Un indicateur clair est de rechercher un comportement de rampement.

Les plaques d'essai doivent être contrôlées de sorte que la sécheresse des plaques et des bactéries soit cohérente. Les plaques excessivement fraîches peuvent causer des défauts de locomotrie et peuvent également interférer avec la détection des stimuli environnementaux 6 . L'application des solutions de cuivre doit être aussi cohérente que possible afin que les barrières aversives soient convenablement épaisses et qu'elles ne soient pas en contact avec la source alimentaire. L'application d'une très faible solution de cuivre pourrait diminuer le temps de réponse aversif de type sauvage, alors que trop pourrait se révéler létale pour les nématodes. Viser une épaisseur uniforme de la solution de cuivre donne les meilleurs résultats. Si des indentations sont créées dans l'agar pendant l'application de la solution de cuivre, la plaque d'essai doit être jetée. Des vers peuvent se creuser à travers de tels trous 32, Surtout lorsqu'ils sont confrontés à une substance aversive ou à une famine. Pour assurer l'uniformité des plaques entre les échantillons, des populations mixtes de vers ( c'est-à - dire un type mutant et sauvage) pourraient être mesurées sur la même plaque si elles étaient distinctement marquées ( p. Ex. Via GFP).

Bien que ce dosage ait été effectué sur des plaques d'agar de taille standard, des plaques plus grandes peuvent être utilisées ( par exemple, un diamètre de 100 mm). Dans ce scénario, la durée de l'analyse devrait être prolongée jusqu'à 6 h pour fournir suffisamment de temps pour le mouvement du ver. Des plaques plus grandes pourraient permettre de tester de plus grandes populations et pourraient être utilisées pour étudier comment la densité de la population affecte les réponses aversives pendant de longues périodes de temps. Des procédures techniquement plus avancées pourraient également être incorporées avec l'utilisation d'équipements de suivi de vis couplés à un étage mobile 33 . Le suivi des vers permettait des mesures plus précises et permettrait la collecte de variables supplémentaires ( p. Ex.

Le dosage peut être facilement adapté pour permettre la mesure de phénotypes alternatifs. L'âge du ver peut être varié pour permettre des mesures sur les changements aversifs induits par la famine liés à l'âge. En outre, les variations de l'état nutritionnel des vers expérimentaux pourraient également permettre d'analyser l'habitude de la famine dans le contexte de l'aversion alimentaire et chimique. Tant que les protocoles sont cohérents entre les ensembles de données comparables, presque tout pré-conditionnement des organismes expérimentaux pourrait être évalué via le test de chimiotaxis.

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Disclosures

Nous n'avons rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 à William G. Bendena.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] Produced in lab
Cupric Sulfate Sigma C-1297 Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Neurobiologie numéro 125, Chimiosensation cuivre famine aversion chimiotaxie nourriture
UNE<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensemble d&#39;aversion en cuivre à base d&#39;état nutritionnel
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Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay. J. Vis. Exp. (125), e55939, doi:10.3791/55939 (2017).

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