Summary
ويرد بروتوكول لإنشاء نموذج الفأر المهندسة وراثيا من سرطان القولون والمستقيم عن طريق العدوى الغدة اللحية القطاعية وترصدها عن طريق التنظير القولون عالية الدقة.
Abstract
على الرغم من مزايا سهولة تطبيق وفعالية من حيث التكلفة، ونماذج الماوس سرطان القولون والمستقيم على أساس حقن الخلايا السرطانية لها قيود شديدة ولا محاكاة بدقة علم الأورام الورم ونشر الخلايا السرطانية. وقد أدخلت نماذج الفئران المهندسة وراثيا للتغلب على هذه القيود؛ ومع ذلك، فإن مثل هذه النماذج تتطلب من الناحية التقنية، وخاصة في الأجهزة الكبيرة مثل القولون الذي هو المطلوب فقط ورم واحد.
ونتيجة لذلك، تم تطوير نموذج مناعة، وراثيا نموذج الفأر من سرطان القولون والمستقيم الذي يتطور الأورام موحدة للغاية، ويمكن استخدامها لدراسات البيولوجيا الورم وكذلك التجارب العلاجية. يبدأ تطور الورم عن طريق العدوى الجراحية، القطاعية من القولون البعيدة مع فيروس الغدة كري في الفئران متحولة مشروط مجمع. الأورام يمكن الكشف عنها بسهولة ورصدها عن طريق تنظير القولون. نحن هنا وصف تقنية الجراحية من العدوى الغدة القطعي منوالقولون، ومراقبة الورم عن طريق تنظير القولون عالية الدقة وتقديم أورام القولون والمستقيم الناتجة.
Introduction
لا يزال سرطان القولون والمستقيم (كرك) أحد الأسباب الرئيسية للوفاة المرتبطة بالسرطان في البلدان الغربية. 1 في حين أن تشخيص المرضى الذين يعانون من مرض المرحلة المبكرة هو جيد، يتم تشخيص العديد من الأورام في مراحل لاحقة والتي، على الرغم من العديد من خيارات العلاج، والتشخيص محدودة. 2 ، 3 ، 4 ، 5
وتستند معظم نماذج الماوس الحالية من كرك على زرع الخلايا السرطانية المستمدة من خطوط الخلايا أو أورام المريض في الفئران عوز المناعة. 6 ، 7 ، 8 هذا يؤدي إلى المحلية، واعتمادا على موقع الحقن والخلايا السرطانية المستخدمة للحقن، وأورام النقيلي في بعض الأحيان. 9 ، 10 ومع ذلك، فإن نماذج طعم أجنبي الناتجة لها ماجوr. يجب أن تنشأ في الفئران عوز المناعة، وبالتالي القضاء على التفاعل المعقد بين الورم والجهاز المناعي المضيف. وبالإضافة إلى ذلك، كما هو مشتق الورم سدى من الخلايا المضيفة، والتفاعل بين حمة الورم البشري وسدى الفئران هو عيب، وبالتالي لا تمثل المرض. هذه العيوب يمكن تجنبها من خلال استخدام خطوط الخلايا الفئران للحقن. ومع ذلك، تتوفر سوى عدد قليل من خطوط الخلايا كرك الفئران، ومثل معظم خطوط الخلايا البشرية كرك المتاحة، هي أحادية النسيلة ونابلية للغاية. 11 وباختصار، فإن معظم النماذج المتاحة حاليا الماوس كرك هي اصطناعية للغاية وليس ممثلا تماما للمرض البشري.
نماذج الفئران المهندسة وراثيا (جيمس) من كرك يمكن تجنب هذه العيوب لأنها تتميز أورام الماوس الحقيقية التي يتم إنشاؤها عن طريق تحريض الطفرات الرئيسية من كرك في القولون. 12 ، 13 ،14 ويمكن تحقيق ذلك عن طريق تفعيل الطفرات الجرثومية المشروطة (فلوكسد) من قبل ريكومبيناس كري داخل الغشاء المخاطي القولون والمستقيم. في حين أن في جيمس العديد من الكيانات الورم الأخرى يتم استخدام التعبير جرماني (محرض) كري مدفوعة من قبل المروجين الأنسجة محددة، لا يمكن استخدام جرثومة جرثومية كري في القولون لأن هذا يؤدي إلى عدد كبير من الأورام في جميع أنحاء القولون مما تسبب في وفاة حمولة ورم حميد في في سن مبكرة جدا. لذلك، في النموذج الموصوف هنا يستخدم ناقلات الغدة الفرقية التعبير عن كري لتصيب مقطع القولون القصير. وهذا يؤدي إلى تحريض الأورام داخل هذا الجزء من الغشاء المخاطي في نقطة زمنية يحددها المحقق، مما أدى إلى أورام في نهاية المطاف تتقدم إلى سرطان الغازية والنقالي. الأورام هي أورام الفأر الحقيقية، وتنمو في المكروية سليمة، وبالتالي فهي قادرة على محاكاة كامل من أونكوجينيسيس القولون والمستقيم بما في ذلك التفاعل ورم المضيف والتسلسل النقيلي. هذا النموذج هووبالتالي منصة جذابة لدراسة بيولوجيا السرطان والتجارب العلاجية قبل السريرية.
العيب الرئيسي لنماذج الفئران المهندسة وراثيا لاتفاقية حقوق الطفل هو تعقيدها التقني. التسليم المحلي كري باستخدام المستقيم الشرج الغدة الشرجية في الحقن الشرجية في الفئران التي تحمل الأليلات أبك فلوكسد وصفت من قبل؛ ومع ذلك، فإن حدوث وتعدد وموقع الأورام المعوية يمكن أن يكون متغير للغاية مع هذه التقنية. 15 لذلك، تم تطوير تقنية الحد من العدوى الغدة كري عن طريق لقط الجراحي للجزء التي سيتم تحريضها. 13 لقد قمنا بتعديل هذا الإجراء من أجل تحسين رفاه الحيوان، فضلا عن خفض معدل الوفيات وعدد الأورام الناتجة. مع هذا البروتوكول، يجب أن تكون جميع المختبرات مع خبرة في جراحة القوارض الصغيرة قادرة على إنتاج نموذج وإنتاج الأورام التي هي استنساخه للغاية ويمكن الوصول إليها بسهولة لتنظير القولون. اعتمادا على م الشرطيأوتواتيونس المستخدمة ل أورام، يمكن ملاحظة كامل الطيف من الورم الحميد، سرطان الغازية والانبثاث. كما تقع الأورام في القولون البعيدة، والتقييم بالمنظار التسلسلي هو ممكن بسهولة في هذا النموذج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استعراض التجارب الحيوانية المقدمة هنا بشكل مستقل واعتمادها من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام الحكومة المؤسسية وتم إجراؤها وفقا للاتحاد الاتحادات المخبرية للعلوم الحيوانية (فيلاسا) المبادئ التوجيهية. وقد اتخذت جميع التدابير الممكنة لتقليل المعاناة بما في ذلك التخدير وتسكين أو، إذا لزم الأمر، القتل الرحيم المبكر.
1. المحلية الورم الحث عن طريق الجراحية العدوى الغدة كري
- إعداد الحيوانات لعملية جراحية
ملاحظة: تقريبا أي طفرة مشروطة ("فلوكسد") يمكن أن تحدث عن طريق الطريقة الموصوفة هنا. ينصح باستخدام الطفرات في الجينات ذات الصلة في سرطان القولون والمستقيم مثل أبك، كراس أو Tp53. كفاءة إعادة التركيب كري تعتمد على حجم البناء ليتم استئصالها. يتم استئصال متواليات فلوكسيد كبيرة بشكل أقل كفاءة. وينبغي تأكيد إعادة التركيب من جميع الأليلات في الأورام عن طريق الكمبيوترR.- لتطوير أورام القولون والمستقيم، استخدم الصليب من الأليلات الشرطية التالية لنموذج أساسي من كرك (عدد قاعدة بيانات مجي بين قوسين):
أبك tm2Rak (مجي: 3688435) 16
كراس tm4Tyj (مجي: 2429948) 17
Tp53 tm2Tyj (مجي: 3039263) 18 - إذا مطلوب أليل مراسل مضان (على سبيل المثال ، للكشف عن ميكروميتاستاسيس)، استخدم الأليل التالية:
غ (روزا) 26Sor tm6 (كاغ-ZsGreen1) هز (مجي: 3809522) 19
ملاحظة: تتوفر جميع السلالات المذكورة أعلاه عبر نسي نسيب مستودع أو مختبر جاكسون. لا يلزم الصيام كما يمكن مسح جميع البراز المتبقية قبل العدوى الفيروسية. الصيام قبل الجراحة يؤدي إلى ارتفاع معدل الوفيات المحيطة بالجراحة ويشكل ضغوطا هائلة للقوارض الصغيرة. - استخدام سيفوفلوران في 3 - 3.5 فول٪ للتخدير العام. فقدان tانه اصبع القدم منعكس قرصة يشير التخدير كافية.
- قبل شق الأول، وحقن 0.05 ملغ / كغ من البوبرينورفين تحت الجلد.
- تغطية عيون الماوس تخدير مع مرهم العيون لتجنب تجفيف القرنية.
- ضع الماوس في موقف ضعيف على طاولة صغيرة. استخدام الأشرطة اللاصقة غير الصدمة لكبح جماح الماوس.
- حلاقة البطن مع ماكينة حلاقة كهربائية (كريم مزيل الشعر يمكن استخدامها بدلا من ذلك) وتطهير مع مسحات الكحول أو اليود. استخدام وقت الاتصال الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
- تغطية الحقل الجراحي مع الستائر المعقمة.
ملاحظة: استخدام المضادات الحيوية المحيطة بالجراحة هو اختياري وتخضع للمبادئ التوجيهية المؤسسية. - استخدام العقيمة استخدام واحد أو أدوات معقمة لجميع العمليات الجراحية.
- لتطوير أورام القولون والمستقيم، استخدم الصليب من الأليلات الشرطية التالية لنموذج أساسي من كرك (عدد قاعدة بيانات مجي بين قوسين):
- البطن في منتصف الخط والتعرض للقولون
- استخدام مقص (المباضع يمكن استخدامها بدلا من ذلك) لجعل شق خط الوسط(~ 15 ملم) من الجلد على أسفل البطن.
- التقاط البطن الجهاز العضلي مع ملقط و شق بعناية مع مقص، وبالتالي فتح تجويف البطن.
- تحديد القولون البعيدة، لمسة فقط مع ملقط أتروماتيك. المشبك القولون مع المشبك الدقيق (على سبيل المثال ، المشبك الأوعية الدموية مايكرو سيريفين) حوالي 15 ملم القريبة من فتحة الشرج.
ملاحظة: إعطاء اهتمام خاص إلى الضعف من القولون في جميع الأوقات. انثقاب يؤدي حتما إلى التهاب الصفاق والإنتان ويتطلب القتل الرحيم للحيوان.
- عدوى القولون القطاعية مع فيروس أدينو-كري
- إدراج أنبوب تفلون مرنة عبر ترانسانالي وتدفع بعناية حتى تصل إلى انسداد التجويف التي حققتها المشبك وضعت سابقا في 15 ملم من حافة الشرج. لا تستخدم القوة الزائدة لأن هذا قد يؤدي إلى ثقب.
- قنية أنبوب مع قنية 30G، وربط حقنة القياسية 1 مل وطرد كولوn مع محلول ملحي عادي من أجل إخلاء البراز المتبقية. وهذا قد يتطلب عدة مل من المياه المالحة.
- مرة واحدة القولون البعيدة فارغة إزالة الأنبوب واستبدالها مع أنبوب تفلون جديدة ومرة أخرى وضعه مباشرة البعيدة إلى المشبك كما هو موضح أعلاه.
- تطويق القولون مع المشبك الثاني ~ 3 مم البعيدة إلى المشبك الداني ( أي ، على أنبوب إدراجها، ~ 12 ملم من حافة الشرج)، مما أدى إلى قطعة معزولة 3 ملم لتكون مصابة.
ملاحظة: للانسداد البعيدة من الجزء وقد ثبت فوجارتي مقاطع الشريان التاجي الأنسب كما هي المطاط، مما يؤدي إلى انسداد ضيق من القولون على الرغم من أنبوب داخل اللمعة بين فروع المشبك. - استخدام حقنة ثانية (معيار 1 مل مع قنية 30G) لحقن بعناية 50 - 80 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين إدتا في قطاع القولون فرضت واحتضان لمدة 10 دقيقة. ترك قنية والمحاقن تعلق على أنبوب تفلون لمنع السائل من تسرب الظهر.
- أولا إزالة المشبك البعيدة، ومن ثم أنبوب التربسين.
- مسح القولون البعيدة مع ~ 500 ميكرولتر من المياه المالحة العادية لإزالة التربسين المتبقية.
- إدراج أنبوب تفلون جديد، ووضع المشبك البعيدة مرة أخرى في مكان وتضخيم الجزء القولون مع 50 - 80 ميكرولتر من حل الغدة الفيروسة (10 11 وحدة تشكيل لوحة (بفو) / مل في الفوسفات مخزنة المالحة) واحتضان لمدة 30 دقيقة ( الشكل 2A ).
ملاحظة: لا تسرب الحل الفيروسي كما الاتصال مع الغدة كري قد يؤدي إلى تطور الورم في أي نسيج من الفئران متحولة مشروط. - إزالة المشابك والأنبوب.
- إغلاق البطن والانتعاش بعد العملية الجراحية
- إغلاق جدار البطن مع 6-0 بسرعة امتصاص تشغيل سوتوريس (على سبيل المثال ، بوليديوكسانون (بدس)).
- إغلاق الجلد مع مقاطع الجرح الجراحية.
- ضع الماوس على وسادة التدفئة تعيين إلى 38 درجة مئوية حتى تعافى تماما من التخدير.
- إدارة بلعة أخرى من 0.05 ملغ / كغ البوبرينورفين إب 12 ساعة بعد الجراحة، تليها البوبرينورفين إضافية كل 12 ساعة إذا لزم الأمر.
- مراقبة الفئران مرة واحدة على الأقل يوميا لعلامات الشدة بسبب نمو الورم.
2. تنظير القولون
ملاحظة: اعتمادا على الطفرات الشرطية المستخدمة، عدوى الفيروسة الغدانية يؤدي إلى أورام مرئية بالمنظار في غضون 2-4 أسابيع. لذلك، إجراء أول تنظير القولون بعد العملية الجراحية 2 أسابيع بعد الحث الغدانية وتكرار كل 2 أسابيع. ويوصى نظام متاح تجاريا للتنظير القولون الفئران. 20
- إعداد الحيوانات لتنظير القولون
ملاحظة: لا صيام هو ريكيرأد. وعادة ما تكون البراز المتبقية بشكل جيد في القولون البعيدة ويمكن دفعها وراء الورم أثناء تنظير القولون، مما يجعل عملية المجهدة من الصيام المتكررة لا لزوم لها.- استخدام سيفوفلوران في 3 - 3.5 فول٪ للتخدير العام. فقدان المنعكس اصبع القدم قرصة يشير التخدير كافية.
- تغطية عيون الفئران تخدير مع مرهم العيون لتجنب جفاف القرنية.
- كبح الفئران في وضع ضعيف على طاولة صغيرة.
- تنظير القولون
- إدراج نطاق (قطر 1.9 ملم؛ طول 10 سم) في القناة المعوية من خلال فتحة الشرج وبقوة نفخ الهواء تحت التحكم البصري لتوزيع القولون. لا تضخ المزيد من الهواء مما هو مطلوب للفحص.
ملاحظة: ل نفخ الهواء، مضخة الهواء المضادة للضباب من نظام تنظير القولون يمكن استخدامها. إذا لم تتوفر مضخة الهواء المضاد للضباب، يمكن استخدام أي مضخة هواء أخرى ذات إعدادات ضغط منخفضة جدا، أو قبل ذلكسوريزد الهواء مع صمام تخفيف الضغط الحساسة. ثاني أكسيد الكربون (كو 2 ) يؤدي بسهولة إلى الحماض في القوارض الصغيرة، وبالتالي يجب تجنبها. - دفع بعناية نطاق إلى الأمام حتى يمكن التعرف على الآفة المخاطية في القولون البعيدة ( الشكل 1A - 1D ).
- حفظ الصور بالمنظار لتقييم لاحق. وقد تم وصف نظام التسجيل بالمنظار للأورام داخل اللمعة من قبل. 20
- إزالة بعناية نطاق ووضع الماوس على وسادة التدفئة تعيين إلى 38 درجة مئوية حتى تعافى تماما من التخدير.
- إدراج نطاق (قطر 1.9 ملم؛ طول 10 سم) في القناة المعوية من خلال فتحة الشرج وبقوة نفخ الهواء تحت التحكم البصري لتوزيع القولون. لا تضخ المزيد من الهواء مما هو مطلوب للفحص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إذا أجريت بشكل كاف،> 85٪ من الحيوانات تطوير الأورام. الوفيات من هنا قدمت الإجراء الجراحي هو <5٪، والوفيات من تنظير القولون يكاد يكون غير موجود. في معظم الفئران، يتم الكشف عن آفة واحدة. في حوالي 30٪ 2 - 3 يمكن الكشف عن الأورام الصغيرة التي عادة فتيل إلى ورم واحد في غضون 2-3 أسابيع بعد تحريض الورم.
النمط الظاهري والسلوك البيولوجي للأورام الناتجة تعتمد اعتمادا كبيرا على الطفرات الشرطية للحيوانات. المحلية المغلوب بوساطة ضربة قاضية من أبك كافية للحث على الأورام ويؤدي في البداية إلى الورم الحميد، والتي يمكن الكشف عنها 2-4 أسابيع بعد العدوى الفيروسة الغدانية والتي تتقدم إلى غدية الغازية في غضون 12-16 أسابيع. ويمكن تسريع هذه العملية عن طريق إضافة شرطي طفرة كراس أونكوجينيك (كراس G12D)، والأورام الناتجة بسرعة التقدم إلى الغازيةغدية. على إضافة من الجين Tp53 R172H الأورام تقدم بسرعة إلى سرطان الغازية والنقالي. البقاء على قيد الحياة يعتمد بقوة على النمط الجيني للأورام. متوسط البقاء على قيد الحياة عادة حوالي 80 - 200 يوما بعد تحريض الورم. سبب الوفاة في الغالبية العظمى من الحالات هو انسداد الأمعاء كبيرة الثانوية لنمو الورم.
الأورام يمكن رصدها بسهولة وبشكل متكرر عن طريق تنظير القولون ( الشكل 1 ) دون إجهاد كبير للحيوانات.
مظاهر المرض هي مشابهة جدا ل كرك الإنسانية. الحيوانات تطور الأورام وأدينوكارسينوماس في نهاية المطاف من القولون البعيدة ( أرقام 2B، 2C، 2F ). اعتمادا على النمط الوراثي الشرطي من الفئران، والأورام أيضا ميتاستاسيزي إلى الصفاق ( الشكل 2D ) الكبد ( الشكل 2E ) ونادرة لي الرئتين (لا يظهر). إذا تم استخدام أليل مراسل كري (على سبيل المثال ، زغرين 19 )، يمكن التعرف على جميع مظاهر الورم بسهولة. و زغرين مراسل أليل يتميز بروتين الفلورسنت التعبير مشرق بما فيه الكفاية لتكون مرئية في ضوء النهار ( الشكل 1B ، الشكل 2C ).
من الناحية النسيجية، 95٪ من الأورام النامية هي أدينوكارسينوما. حوالي 5٪ من الأورام هي من أصل الوسيطة، على سبيل المثال ، ساركومة ليفية أو ساركومة عضلية مخاطية، من المفترض أن تتطور من الخلايا اللحمية التي أصيبت بطريق الخطأ مع الغدة كري. و هيستومورفولوغي من أدينوكارسينوماس يشبه كرك للغاية، ويضم الطيف بأكمله من الورم الحميد غير الغازية إلى غدية غزو الهياكل المحيطة بها ( الشكل 3A - 3C ).
فيليز / ftp_upload / 55952 / 55952fig1.jpg "/>
الشكل 1. صور القولون بالمنظار من أورام القولون والمستقيم (الأليلات الشرطية للحيوان معين بين قوسين).
A. القولون البعيدة الطبيعي. B. الورم الحميد في وقت مبكر بعد 2 أسابيع العدوى الغدة كري. لاحظ اللون الأخضر بسبب أليل مراسل غفب في هذا الفأر. ( أبك tm2Rak ، كراس tm4Tyj ، غ (روزا) 26Sor tm6 (كاغ-ZsGreen1) هز ). C. الورم الحميد المتأخر ( أبك tm2Rak ، كراس tm4Tyj ). D. أدينوكارسينوما القولون والمستقيم (كما تم تشخيصها من قبل علم الأمراض بعد تم الحصول على الصور تنظير القولون؛ أبك tm2Rak ، كراس tm4Tyj ، Tp53 tm2Tyj ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2.jpg "/>
الشكل 2. أ. أثناء العملية . لاحظ كبيرة، والمطاط فوجارتي كليب في الجزء السفلي وأنبوب إدراج ترانزانالي لحقن الغدة كري (السهم الأحمر). B. ورم القولون والمستقيم (السهم الأبيض) مع متتالية كبيرة الأمعاء انسداد 8 أسابيع بعد العدوى الغدة كري ( أبك tm2Rak ، كراس tm4Tyj ، Tp53 tm2Tyj ). C. ورم القولون والمستقيم (السهم الأبيض) 10 أسابيع بعد العدوى الغدة كري ( أبك tm2Rak ، كراس tm4Tyj ، غ (روزا) 26Sor tm6 (كاغ-ZsGreen1) هز ). لاحظ اللون الأخضر بسبب بروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) أليل مراسل في هذا الفأر. D. سرطان البريتوني (الأسهم السوداء) في جيم ( أبك tm2Rak ، كراس tm4Tyj ، Tp53 tm2Tyj ). تمت إزالة الكبد والأمعاء للكشف عن الكلى والحجاب الحاجز. E. الانبثاث الكبدي الإجمالي في جيم 12 أسابيع بعد الغدة كري فيفكتيون ( أبك tm2Rak ، كراس tm4Tyj ). F. القولون مع الورم بعد إزالة من الحيوان يصور في الشكل 2C . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. الهيماتوكسيلين / يوسين (H / E) أقسام ملطخة من أورام القولون والمستقيم من جيم.
المنطقة الانتقالية من الغشاء المخاطي الطبيعي إلى غدية مع تسلل الغشاء المخاطي، تحت المخاطية والمخاطية العضلية ( أبك tm2Rak ، كراس tm4Tyj ). منطقة انتقالية من الغشاء المخاطي القولون العادي ل أدنوكارسينوما الغازية ( أبك tm2Rak ، كراس tm4Tyj ). C. أدينوكارسينوما عالية الجودة مع تسلل الأنسجة المحيطة بها ( أبك tm2راك، كراس tm4Tyj ، Tp53 tm2Tyj ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين أنها سهلة عموما لتوليد والحفاظ على، الكلاسيكية نماذج الماوس كرك على أساس حقن خط الخلية هي اصطناعية وغير قادرة على تلخيص تماما المرض البشري. ونتيجة لذلك، وضعت جيمس. كان أول جيم جيم الماوس أبك مين ، الذي يؤوي طفرة خالية متخالف في الجين أبك، وبالتالي محاكاة المرض وراثي الإنسان داء السلائل الغدية العائلي (فاب). 21 ومع ذلك، أبك مين الفئران تتطور دائما الأورام المعوية متعددة لا تقتصر على القولون. أيضا، والوقت والمكان المحدد لتشكيل الورم الحميد هو عشوائي والأورام نادرا ما تتطور إلى الآفات الخبيثة كما يموت الماوس من الحمل الورم حميدة قبل الأورام يمكن أن تقدم. ولذلك، فإن أبك مين الماوس هو نموذج من فاب، وليس متفرقة كرك. نماذج أخرى تقدم الطفرات في الجينات إصلاح عدم تطابق الحمض النووي. 22 ، 23 على الرغم من أن بعض هذهالفئران هي نماذج ممتازة لسرطان الجهاز الهضمي وراثي، فإنها لا تمثل سرطان القولون والمستقيم متقطع.
وبصرف النظر عن التغيير الجيني الكامن وراء ذلك هو موقع الآفة الوراثية التي تحدد نماذج من سرطان القولون والمستقيم متفرقة ومتلازمات القولون. كل من النماذج المذكورة أعلاه تتميز الطفرات التي هي ناشطة بشكل أساسي أو المستحثة في جميع أنحاء القولون أو حتى الجهاز الهضمي بأكمله. وهذا يؤدي إلى تشكيل الأورام المتعددة، والتي ليست ممثلة ل كرك متفرقة الإنسان، لا يمكن تقييمها من قبل تنظير القولون، وبالإضافة إلى ذلك، عادة لا تترك الأورام وقتا كافيا لتطوير قبل أن يستسلم الحيوان إلى حمل الورم واسعة النطاق. ولذلك، فإن نموذج الفأر لسرطان القولون والمستقيم متفرقة يجب أن تشمل تفعيل المحلي من أورام القولون والمستقيم.
الأورام التي تنشأ في هنا قدمت جيم تقتصر بشكل صارم على شريحة مثبتة جراحيا واللغوية المصابةمن القولون. وهذا يؤدي إلى تشكيل ورم واحد التي يمكن الوصول إليها بسهولة للكشف والمراقبة عن طريق تنظير القولون. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الموقع البعيدة يجعل انسداد الأمعاء مضاعفات في وقت متأخر من نمو الورم، مما يسمح للأورام أن تتطور إلى الغازية، اعتمادا على النمط الجيني، سرطان النقيلي قبل الحيوان يتطلب القتل الرحيم. ميزة أخرى للعدوى كري شريحة هو البيئة غير المتضررة. بينما في أبك مين وغيرها من نماذج الفأر وراثية، والغشاء المخاطي المحيطة وحتى الخلايا اللحمية تعاني نفس الانحرافات الوراثية مثل الأورام، والأورام في نموذج اقترح هنا تطوير داخل ظهارة القولون العادية وسدى. وهذا يتيح التفاعل أكثر واقعية ورم المضيف والدراسات الجزيئية دون قيود. وعلاوة على ذلك، فإن النقطة الزمنية للتحريض الورم معرفة جيدا في هذا النموذج. بينما في الماوس أبك دقيقة ، تتطور الأورام بعد "ضرب الثاني"، خلالها أليل الثاني أبك هو ستوشاستفقدت في نقطة زمنية عشوائية، يتم تنشيط جميع الطفرات المطلوبة في وقت واحد في نموذج وصفها هنا، مما يسمح بدراسات الآفات في وقت مبكر جدا أو خزعات متتالية بطريقة محددة جدا.
ومع ذلك، يأتي هذا النموذج أيضا مع القيود. عبور الأليلات المتعددة في نموذج واحد يتطلب وقتا هائلا والموارد؛ بالإضافة إلى ذلك، في كثير من الأحيان ليس كل ذرية يمكن استخدامها للتجارب بسبب النمط الجيني غير مناسب. الإجراء نفسه يتطلب الممارسة وتستغرق وقتا طويلا. إنتاج تعليق الفيروسات الغدة كري مع تيتر عالية بما فيه الكفاية وبكميات كبيرة هو كثيفة من حيث التكلفة. لذلك، هذا النموذج ليست مناسبة لتحل محل جميع نماذج الماوس كرك الأخرى، وسوف تقتصر على المختبرات مع التركيز بشكل واضح على نماذج جيم.
البروتوكول نفسه يطالب من الناحية الفنية، ولكن مع بعض التدريب غير الجراحية الموظفين يمكن أن تؤدي الإجراءات بشكل كاف. الخطوة الحاسمة خلال الغدة كري أنانفكتيون هو التضخم من الجزء الأمعاء فرضت - الضغط داخل اللمعة الزائدة يؤدي إلى ثقب، ضغط غير كاف يقلل من معدل العدوى الناجحة. هذه الخطوة تتطلب التدريب.
تم نشر بروتوكول للعدوى الفيروسة الغدانية من القولون البعيدة من قبل هانغ وآخرون. قبل. 13 يختلف البروتوكول المقدم هنا عن البروتوكول المذكور أعلاه في عدة جوانب رئيسية. كما أنه غالبا ما يسبب انثقاب الأمعاء في أيدي غير خبرة، يتم تخطي التآكل الميكانيكية من الغشاء المخاطي قبل حضانة الغدة كري في هذا البروتوكول. وهذا يؤدي إلى انخفاض معدل تشكيل الورم، ولكن يمكن أن تتصدى من قبل زيادة التتر الفيروسية. وبهذه الطريقة، يمكن أيضا أن يتم تخفيض معدل الأورام الوسيطة كما دون تآكل الغشاء المخاطي أقل الخلايا الوسيطة داخل جدار الأمعاء يتعرض الغدة كري.
أيضا، على النقيض من البروتوكول المذكور أعلاه 13 هنابروتوكول وصف لا يوصي الصيام بين عشية وضحاها قبل الجراحة أو تنظير القولون. بدلا من ذلك، احمرار الأمعاء أو، في حالة تنظير القولون، يتم استخدام التلاعب الميكانيكية بسيطة لإزالة البراز المتبقية. هذا تحسين البروتوكول يحسن بشكل كبير رفاه الحيوان. الصوم بين عشية وضحاها هو إجراء مرهق للغاية للقوارض الصغيرة والمعروف أن تؤثر بقوة على عملية التمثيل الغذائي الفئران، وبالتالي التأثير أيضا على النتائج التجريبية. 24 ، 25 هذه الآثار غير المرغوب فيها من الصيام بين عشية وضحاها يمكن تجنبها في المخطوطة هنا المقدمة.
فرق مهم آخر بين بروتوكول هنا قدم والبروتوكول من قبل هونغ وآخرون. هو طول الجزء المثبت (وبالتالي المصاب). في حين أن بروتوكول وصفها هنا يوصي بطول قصير (~ 3 ملم)، وهونغ وآخرون. يوصي 20 ملم من القولون البعيدة أن تكون مصابة. وقد تم اختيار طول الجزء أقصر لتقليل عددمن الخبايا إعادة التركيب، وبالتالي الأورام الناتجة. كما أن غالبية المرضى الذين يعانون من كرك متفرقة تطوير ورم واحد بدلا من الأورام متعددة، وهذا الإجراء يزيد من أهمية السريرية للنموذج. لا يبدو أن معدل تكوين الورم تتأثر بالسطح المنخفض من القولون المصاب.
وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية جميع البروتوكولات التي تتطلب إعادة التركيب المحلي لل كري داخل الغشاء المخاطي القولون. معظم التطبيقات في أبحاث السرطان تشمل الجينات الورمية المشروطة، مما يؤدي إلى تشكيل أورام القولون والمستقيم. ومع ذلك، فإن جميع التطبيقات الأخرى مثل تحريض يبني مراسل داخل الغشاء المخاطي القولون لا يمكن أن يتحقق مع بروتوكول هنا قدم كذلك.
في الختام، هنا قدمت مجموعة من متطورة للغاية وراثيا نموذج الماوس من سرطان القولون والمستقيم جنبا إلى جنب مع خيار تنظير القولون عالية الدقة للكشف عن ومراقبة الأورام النامية توفرs إعداد ممتاز لدراسة البيولوجيا والعلاج من كرك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ويكرس هذا العمل لذكرى البروفسور موريتز كوخ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents / consumables | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Gene Transfer Vector Core University of Iowa |
||
| 15 mL, 50 mL centrifuge tubes | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Petri dish PS 100/15 mm (sterile, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analgesia / anesthesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | - | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | - | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - ophthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Table Top Research Anesthesia Machine x/O2 Flush w/ Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Insulin syringe EMG 1 mL (with 30G cannula) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Fine Bore Tubing (bore: 0.28 mm/ diameter: 0.61mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Curved Micro Serrefine Vascular Clamp | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Fogarty Spring Clips | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Hair shaver | Aesculap - Braun | - | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Fiber Optic Light Cable | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Three-Chip Camera Head | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Camera Control Unit | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Flat Screen Monitor EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| HOPKINS Straight Forward Telescope diameter 1.9 mm; length 10 cm autoclavable fiber optic light transmission incorporated |
Karl Storz | 64301AA | |
| Protection and Examination Sheath | Karl Storz | 61029C |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Jr Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146 (2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F.
