Summary
Denne protokollen definerer en metode for å observere embryogenesis i Arabidopsis via ovule klaring etterfulgt av inspeksjon av embryoet mønster formasjon under et mikroskop.
Abstract
Gitt svært forutsigbar natur deres utvikling, har Arabidopsis embryoer blitt brukt som modell for studier av morphogenesis i planter. Men tidlig stadium anlegget embryo er små og inneholder noen celler, noe som gjør dem vanskelig å observere og analysere. En metode beskrives her for å karakterisere mønster formasjonen i anlegget embryoer under et mikroskop med modell organismen Arabidopsis. Etter klarering av fersk ovules bruker Høyers løsning, celle nummer i og morfologi av embryo kunne observeres og deres utviklingsstadiet kunne bestemmes av differensial forstyrrelser kontrast mikroskopi bruker en 100 X olje nedsenking linsen. I tillegg ble uttrykk for spesifikk markør proteiner merket med grønt fluorescerende Protein (GFP) overvåket for å kommentere celle identitet spesifikasjoner under embryoet mønstre av AC confocal mikroskopi for laserskanning. Denne metoden kan dermed brukes å observere mønster formasjonen i vill-type anlegg embryoer på mobilnettet og molekylære og å karakterisere rollen til bestemte gener i fosteret mønstre ved å sammenligne mønster formasjonen i embryoer fra vill-type planter og embryo-dødelige mutanter. Metoden kan derfor brukes som karakteriserer embryogenesis i Arabidopsis.
Introduction
Embryogenesis er den første hendelsen i høyere anlegget utvikling. En moden embryoet former fra en zygote gjennom celledeling og differensiering under streng genetisk kontroll1,2. Arabidopsis embryoer er en nyttig modell å studere kontroll av morphogenesis fordi en rekke celledelinger under embryogenesis følger en forventet mønster3,4. Men er et Arabidopsis embryo som inneholder ett til flere celler for liten til å være observert og analysert. I tillegg kan mutasjon av visse gener forårsake embryoet dødelighet5, som indikerer en nøkkelrolle av de genene i embryogenesis. Karakterisering av mønster formasjon i embryo-dødelige mutanter gir et grunnlag for å forstå den molekylære mekanismen hvor viktig gener regulere embryo utvikling.
En detaljert metode beskrives her for karakterisering av embryoet mønster formasjonen i modellen fabrikken Arabidopsis av direkte mikroskopiske observasjon. Metoden innebærer ovule klaring etterfulgt av mikroskopiske observasjon av et embryo. Karakterisering av en embryo-dødelige mutant er også beskrevet.
Morfologi av embryo på ulike utviklingsstadier kan bestemmes direkte av mikroskopi bruker ovules som er avklart med Høyers løsning6,7. Slike ovules viser en høy brytningsindeks; Dermed er denne ovule clearing metode spesielt fordelaktige for prøver som må følges av differensial forstyrrelser kontrast (DIC) mikroskopi.
Gener som er uttrykt i en bestemt celle eller et begrenset antall celler under embryogenesis kan i tillegg brukes som markører for å identifisere cellene i et embryo. Derfor kan celle identitet spesifikasjonen under embryogenesis kommenteres ved å overvåke uttrykket GFP-merket markør proteiner med AC confocal mikroskopi for laserskanning. Omvendt, observere uttrykksmønster av en ukjent funksjonelle gen -GFP fusion under embryogenesis kan gi en link mellom embryoet mønstre og uttrykk for det genet og lette identifisering av nye gener som kreves for embryogenesis i Arabidopsis.
Metoden beskrevet her kan også brukes som karakteriserer fenotypen av et embryo-dødelige mutant, og å fastslå effekten av berørte genet på embryogenesis på cellenivå. Videre, i kombinasjon med en sammenligning av uttrykksmønster av markør gener under embryogenesis mellom vill-type og mutant planter, metoden kan gi hint om molekylære mekanismer og signalnettverk trasé involvert i embryogenesis8,9. Faktisk metoden ble brukt naa10 planter, og det ble funnet at unormal delingen av hypofysen i mutant kan skyldes en endring i auxin distribusjonen i embryogenesis5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Denne protokollen har tre deler: 1) observere mønster dannelsen i vill-type Arabidopsis embryoer med DIC mikroskopi; 2) karakteriserer den embryo mønster formasjon via observasjon av markør protein uttrykk med AC confocal laserskanning mikroskopi; og 3) fastsette rollen til et bestemt gen i embryogenesis (med naa10 mutant som et eksempel).
1. ovule-fjerne
- Plante materiale forberedelse
Merk: Protokollen beskrevet her er et eksempel på hvordan å vokse friske planter; andre måter å vokse friske planter også arbeide.- Legg 100 frø til en 1,5 mL tube og legger 1 mL av 1,5% natriumhypokloritt (mix 15 mL 10% klor med 85 mL vann) for å sterilisere frø for 5 min. Inverter røret flere ganger slik at frø og løsning er godt blandet å sterilisere overflaten frø helt.
- Tvinge frøene til bunnen av røret med sentrifugering for 30 s på 1200 x g, fjerne nedbryting og vask frøene med sterilt vann fire ganger på en benk fjerne de gjenværende natriumhypokloritt.
- Legge til 4,4 g av Murashige og Skoog (MS) basale salt blanding og 10 g av sukrose 1 L ultrapure vann. Rør blandingen å oppløse salter og sukrose. Justere løsningen pH 5,8 med 1 M KOH, legge til 3 g av gelling agent, for eksempel Phytagel, MS-sucrose løsning, og sterilisere løsningen på 121 ° C i 15 min å gjøre MS medium.
- Hell 30 mL av MS medium i en 12 cm kultur parabol generere MS medium plater.
- Sett steriliserte frø på MS tallerkenen. Overføre platen til en vekst kammer og holde platen under lange dager forhold (22 ° C 16 h i lys og 18 ° C 8 h i mørket) etter frø lagdeling (3 dager på 4 ° C i mørket).
- Etter 8 dager med vekst, overføre planter jord (blanding næringsrik jord og vermikulitt på en 1:1 ratio) i en skuff, dekke skuffen med hvit og gjennomsiktig lokk i 5 dager for å unngå vanntap av og la et gap for å unngå vitrifikasjon av planter.
- Ta lokket av skuffen og dyrke planter i en walk-in kammer under lange dager forhold (se 1.1.5). Slå på lyset på 6:00 og av kl 10:00. Etter ca 20 dager vekst i walk-in kammeret, vil planter ha blomster og produsert siliques.
- Merk blomsterknopper med en tråd ved frø stilker i sitter på 8:00 pm (ikke bruk første til tredje blomsterknopper; siliques generert fra disse blomsterknopper vanligvis utvikle noen avbrutt frø, og dette kan endre andelen normalt å unormal ovules). Definere begynnelsen av pollinering av ovule som når merket knopp åpner for å blomstre på 8:00 neste morgen.
- Utarbeidelse av Høyers løsning
- Legge 24 g chloral hydrat til en 50-mL tube og vikle røret helt med aluminiumsfolie (løsninger av chloral hydrat ikke er stabil under lys).
- Deretter legge 9 mL ultrapure vann og 3 mL glyserol til ovenstående løsning og riste røret å oppløse chloral hydrat. Gjøre Høyers løsning, la røret stå over natten i romtemperatur å eliminere bobler.
- Ovule fargeseparasjoner og klarering
- Knytte et stykke dobbeltsidig teip til et mikroskop glass lysbilde. Plass en silique vokst for ønsket antall dager etter pollinering (DAP) på lysbildet med pseudoseptum vinkelrett på overflaten; Dette vil gjøre det enkelt å dele carpels (tall 1A og 1B).
- Delt carpels på begge sider av pseudoseptum med en sprøyte nål og koble to dissekert carpels til lysbildet slik at ovules i silique vises under en stereoscope (tall 1 c og 1 D).
- Dispensere 70 µL Høyers løsning på glass lysbilde, og deretter fukte spissen av et par tynn pinsett Høyers løsning av dipping. Bruker stereoscope, Flytt ovules Høyers løsning på lysbildet med pinsett å rengjøre embryoene. Bruke en dekkglassvæske på lysbildet forsiktig for å unngå å generere bobler.
- Sette ferdig lysbildet i en boks i et mørkt rom 2-12 h (mer moden en ovule er, jo mer tid vil være nødvendig) i romtemperatur. Embryo på 2/4-cellers scenen (1-2 DAP) kan observeres mikroskopisk etter 2 h, mens embryo mellom octant og globular tidligfasen (3 DAP) kan observeres etter 4 h. Mer modne embryo (4-8 DAP) kan observeres etter 12 h.
- Undersøk de ryddet ovules funksjonen DIC av et mikroskop. Finn embryoene under et lavt strømforbruk felt (10 X) og endre på et høyeffekts (100 X olje nedsenking linsen) å observere mobilnettet mønsteret i de utviklede embryoene.
- Undersøk embryoene på ulike utviklingsstadier.
2. karakterisering av Embryo mønstre og celle identitet via observasjon av markør Protein uttrykk
- Forberedelse av plantemateriale
- Klone arrangøren og koding sekvens av markør genet eller hormon respons elementet og deretter sikring det med et fluorescerende protein (som GFP); deretter inn Konstruer binære vektoren (for eksempel pCambia1300). Her auxin svar elementet DR5 er presentert som et eksempel10.
- Innføre den resulterende DR5-GFP -plasmider i vill-type planter av Agrobacterium tumefaciens-mediert transformasjon11. Velg T1 plantene bruke MS medium plater som inneholder hygromycin (50 mg/mL mor brennevin, utvannet 1:1, 000). Transgene planter vil ha lange røtter og generere to rosett blader etter 8 dager vekst under forholdene beskrevet i 1.1.5.
- Overføre transgene planter jord og dyrke dem som angitt i 1.1.6 og 1.1.7.
- Samle T2 frø fra uavhengige T1 linjene. Sår frø på MS-hygromycin plater, Velg planter med en kopi av DR5-GFP innsetting (forholdet mellom resistente planter til følsomme planter vil være omtrent 3:1), og overføre dem til jord.
- Dyrke T2 planter som angitt i 1.1.6 og 1.1.7.
- Samle T3 frø fra T2 planter. Sår frø på MS-hygromycin plater, Velg homozygous transgene planter (alle planter fra én linje vil vise hygromycin motstand), og overføre dem til jord.
- Merk blomsterknopper av homozygous T3 planter som angitt i 1.1.8.
- GFP signalet observasjon
- Bland 3 mL glyserol med 47 mL ultrapure vann til å generere en 6% glyserol løsning.
- Knytte et stykke dobbeltsidig teip til en barometer microscope skyve og fikse en silique som angitt i 1.3.1.
- Delt carpels på begge sider av pseudoseptum med en sprøyte nål og fest to dissekert carpels på lysbildet under en stereoscope som angitt i 1.3.2.
- Dispensere 30 µL 6% glyserol på av objektglass og plasser alle ovules fra dissekert carpels i løsningen ved hjelp av tynn pinsett. Plass en dekkglassvæske på lysbildet forsiktig.
- Så frø jakke og endosperm i hver ovule kan hindre observasjon av GFP signaler i embryo, ekstra embryoet fra ovule. Tapp lysbildet raskt og forsiktig extrude embryoet fra ovule (jo mer moden en ovule er mindre kraft skal brukes i lysbildet).
- Undersøke lysbildet til GFP fluorescens bruker AC confocal mikroskopi for laserskanning. Finne de isolerte embryoene under et lavt strømforbruk felt (10 X) fortegnelse deres plassering, og endre på et høyeffekts (100 X olje nedsenking linsen) å observere DR5-GFP uttrykk i embryoene ved å angi eksitasjon lyskilden 488 nm for gjenkjenning av GFP.
- Oppdage det GFP uttrykket i embryo å velge passende T3 linjen for videre analyse.
3. karakterisering av Embryo mønster formasjon i en Embryo-dødelige Mutant via Ovule klaring og markør Protein observasjon: Naa10 eksempel
- Fosteret mønstre i naa10 mutant planter
- Forberede plantemateriale som angitt i 1.1.1-1.1.7.
- Identifisere naa10/ − planter av PCR bruker gen-spesifikke primere5, og deretter merke blomsterknopper av naa10/ − planter som angitt i 1.1.8.
- Ovule klaring og mikroskopisk undersøkelse naa10/ − embryo som angitt i 1.2 og 1.3.
- Markør protein analyse med naa10 embryo
- Få egnet DR5-GFP transgene linjene ved hjelp av fremgangsmåten i 2.1-2.2.
- Krysse en homozygous DR5-GFP transgene linje med en naa10/ − plante å få naa10/ − planter som er homozygous for GFP fluorescens markøren på F2 generasjon (identifisert av gen-spesifikke PCR) som karakteriserer naa10/ −5 og observere GFP signalet under et mikroskop med en homozygous DR5-GFP linje.
- Merke blomsterknopper av naa10/ − planter som er homozygous for DR5-GFP som angitt i 2.1.7.
- Søke etter GFP signalet i naa10 embryo som er homozygous for DR5-GFP som angitt i 2.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden beskrevet i dette dokumentet kan brukes til å observere embryogenesis direkte under et mikroskop, kommentere celle identitet spesifikasjonen under embryogenesis med spesifikke indikatorer og karakterisere rollen til et bestemt gen under embryogenesis.
Representant resultatene fra analysen av embryoet mønstre (fra den langstrakte zygote trinn til eldre gå-stick scenen) i vill-type Arabidopsis er vist i figur 2. Etter ovule fortolling, kunne embryoene på ulike utviklingsstadier skilles av DIC mikroskopi (figur 2). Uttrykksmønster av DR5-GFP ble innspilt under embryogenesis under AC confocal laserskanning mikroskopi (Figur 3) fordelingen av auxin i embryo og undersøke auxin potensielle rolle under embryogenesis i Arabidopsis.
Denne protokollen kan også brukes til å beskrive rollene til bestemte gener under embryogenesis. Her ble rollen som Naa10 under embryogenesis i Arabidopsis undersøkt som et eksempel. Unormal delingen av hypofysen ble observert (skjev og loddrette avdeling av hypofysen i Naa10 sammenlignet med tverrgående asymmetrisk fordeling av hypofysen i vill-type planter, Figur 4). Fordelingen av auxin på globular scenen var nesten enhetlig i de fleste Naa10 embryoer og beholdt et bredere signal i hypofysen, sammenlignet med vill type embryo (figur 5). Disse resultatene indikerer at Naa10 er nødvendig for embryogenesis, og at det kan være involvert i embryogenesis via auxin signalveien i Arabidopsis.
Figur 1: Skjematisk Diagram for Disseksjon av Arabidopsis Silique. (A) silique festet på av objektglass ble limt med en dobbeltsidig teip. (B) det forstørrede image av boksen i A. De to imaginære linjene representert plasseringen deles. (C) det forstørret bildet av delt silique i boksen i D. (D) bildet av den delte silique. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Undersøkelse av Embryogenesis i vill-type (Col-0) Arabidopsis av DIC mikroskopi. (A) Elongated zygote. (B) en 1-celle scenen embryo på 1 DAP. (C) en 2/4-cellers scenen embryo på 2 DAP. (D) en octant scenen embryoet 3 DAP. (E) A dermatogen scenen embryo på 3 DAP. (F) et tidlig globular scenen embryo på 4 DAP. (G) A, sent embryoet globular scenen på 5 DAP. (H) A hjertet scenen embryo på 6 DAP. (jeg) en torpedo scenen embryo på 7 DAP. (J) en gå-stick scenen embryo på 8 DAP. Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Uttrykksmønster av DR5 i vill-type (Col-0) Arabidopsis embryoer. (en - d) GFP signaler. (A-D) Flettede bilder med lyse feltet bilder. DR5 ble uttrykt i roten stangen av vill-type globular scenen (en og en, 4 DAP) og hjertet scenen (b og B, 6 DAP) embryoer. DR5 ble også uttrykt i embryonale cotyledon tips (c og C, 7 DAP) og blodkar av modne vill-type embryo (d og D, 8 DAP). Skalere barer = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Karakterisering av rollen som Naa10 under Embryogenesis i Arabidopsis. Normal delingen av hypofysen i en vill-type anlegg (A). Unormal delingen av hypofysen i Naa10 mutant planter er merket med en hvit linje med (B) (skjev avdeling av hypofysen) og (C) (loddrett avdeling av hypofysen). Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Det DR5 uttrykket mønsteret i Globular scenen vill-type (Col-0) Arabidopsis og Naa10 embryoer. (og b) GFP signaler. (A og B) Flettede bilder med lyse feltet bilder. DR5 ble uttrykt i roten stangen på en vill-type globular scenen fosteret (en og en). DR5 ble nesten jevnt uttrykt i en globular scenen Naa10 embryoet og beholdt bredere signalet i hypofysen sammenlignet med vill-type (b og B). Skalere barer = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovule klaring er en nyttig metode for å oppdage celledeling og vurdere morfologi under embryogenesis i Arabidopsis; bruker denne teknikken, kan embryo observeres direkte under DIC mikroskopi5,12. Det kritiske trinnet for ovule klarering er skritt 1.3.4. Tiden som kreves for ovule klarering i trinn 1.3.4 er variabel. Embryo på 2/4-cellers scenen kan observeres klart etter 2 timer på Høyer løsning, mens de ser utydelig etter 12 h. Dermed mer moden en ovule er, jo lenger tiden som kreves for klarering.
I trinnet 2.2.5 for å isolere et embryo fra en ovule, er mengden av kraften til lysbildet viktig. Embryo kan bli knust hvis for mye kraft; men kan et embryo være ekstrudert fra ovule hvis også lite kraft brukes. I vår erfaring, jo mer moden en ovule er, mindre makt er nødvendig. Torpedo scenen og modne embryo kan isoleres direkte av peeling åpne en ovule med en sprøyte nål. Som noen av suspensor celler kan bli ødelagt i isolerte embryo under isolasjon prosessen, kan fluorescens signalet fra suspensor være tapt eller ufullstendig. En annen begrensning av denne metoden er at embryo før 4-cellers scenen var vanskelig å finne fra ekstrudert embryo som de er for liten og skjermet av ovule fragment.
Utviklingsstadiet og morfologi av et embryo kan påvirkes av mutasjon av visse gener; slike effekter kan påvises av mikroskopi etter ovule klarering. Denne tilnærmingen vil hjelpe i forståelsen av molekylære mekanismen av hvilke bestemte gener megle embryogenesis5. Observere uttrykksmønster av en ukjent funksjonelle gen -GFP fusion under embryogenesis kan gi en link mellom embryoet mønstre og uttrykk for det genet, og lette identifisering av nye gener som kreves for embryogenesis i Arabidopsis13. Dermed gir protokollen beskrevet her en grunnleggende metode for karakterisering av embryogenesis i Arabidopsis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Jessica Habashi for kritisk lesing av manuskriptet. Vi takker Dr. Xianyong Sheng Imaging Center, College biovitenskap, hovedstaden Normal University (Beijing, Kina), for å utføre lokaliseringen av DR5-GFP analysen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Beijing Municipal regjeringen Science Foundation (CIT & TCD20150102) og fra National Natural Science Foundation av Kina (31600248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-mL tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-mL tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment |
References
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W.
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
- Wendrich, J. R., Weijers, D. The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model. New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).
- ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo. Development. 142 (3), 420-430 (2015).
- Feng, J., et al. Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).
- Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo. Development. 118, 575-587 (1993).
- Luo, Y., et al. D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis. Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).
- Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation. Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).
- Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).
- Friml, J., et al. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).
- Fiume, E., Fletcher, J. C. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).
- Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein. Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).
