Summary
Viene presentato un metodo per quantificare le caratteristiche principali di temporale vista in volare ritmi circadiani dell'apparato locomotore. La quantificazione avviene inserendo attività di volare con una forma d'onda modello multi-parametrico. I parametri del modello descrivono la forma e la dimensione della mattina e sera picchi di attività quotidiana.
Abstract
Nella maggior parte dei animali e piante, orologi circadiani orchestrano processi comportamentali e molecolari e sincronizzarli con il ciclo giornaliero di chiaro-scuro. Meccanismi fondamentali che sono alla base di questo controllo temporale sono ampiamente studiati usando il Mosca di frutta melanogaster della drosofila come organismo modello. In mosche, l'orologio è in genere studiato analizzando multiday registrazione dell'apparato locomotore. Una registrazione di tale Mostra un complesso modello bimodale con due picchi di attività: un picco di mattina che accade intorno all'alba con un picco di sera che accade intorno al tramonto. Questi due picchi di forma insieme una forma d'onda che è molto diversa da oscillazioni sinusoidali osservata nei geni dell'orologio, suggerendo che i meccanismi oltre l'orologio hanno effetti profondi nella produzione i modelli osservati in dati comportamentali. Qui forniamo le istruzioni sull'utilizzo di un metodo computazionale sviluppato di recente che descrive matematicamente schemi temporali nell'attività di volare. Il metodo si inserisce dati di attività con una forma d'onda modello che consiste di quattro termini esponenziali e nove parametri indipendenti che descrivono completamente la forma e la dimensione della mattina e sera picchi di attività. I parametri estratti possono contribuire a delucidare i meccanismi cinetici di substrati che sottendono i modelli di attività bimodale comunemente osservata nei ritmi locomotore volare.
Introduction
L'orologio circadiano è un oscillatore endogeno biochimico con un periodo di circa 24 ore ed è quasi onnipresente in animali e piante di1,2. L'orologio consente di sincronizzare i processi interni e il comportamento per il ciclo di buio luce esterno di un organismo. La struttura genetica dell'orologio circadiano è stato ampiamente studiata dal 1960 utilizzando il moscerino della frutta, d. melanogaster. In questo insetto, il nucleo dell'orologio circadiano è costituito da quattro proteine: periodo, TIMELESS, orologio e ciclo. Questi componenti di base insieme ad altre molecole formano un ciclo di feedback che produce quasi sinusoidale oscillazioni di geni orologio3,4. L'orologio circadiano in mosche è ampiamente studiato utilizzando registrazioni locomotore multiday dove volare l'attività viene rilevata con un singolo raggio infrarosso attraversando la metà di un singolo tubo di5. Una Mosca tipica registrazione ha un complesso modello bimodale con due picchi ben distinguibili: picco di mattina (M) che inizia alla fine della notte e ha un massimo quando le luci si accendono; e picco di sera (E) che inizia alla fine della giornata e ha un massimo quando le luci sono spente6. È interessante notare che, la forma di tale registrazione del comportamento è molto diversa dalle oscillazioni sinusoidali semplice osservate a livello molecolare, suggerendo l'azione di meccanismi aggiuntivi che contribuiscono ai pattern temporale osservato. Per comprendere meglio questi meccanismi nascosti, abbiamo sviluppato uno strumento computazionale che fornisce una descrizione quantitativa degli schemi temporali.
Nel nostro lavoro, ritmi locomotore sono definiti in termini di una forma d'onda che imita il modello di attività di volare. Poiché onde sinusoidali semplice non può essere utilizzate per modellare i cambiamenti ritmici osservati nell'attività, abbiamo testato varie forme di segnale per selezionare quello più semplice che cattura tutte le caratteristiche salienti vista nelle registrazioni. Mosca della frutta circadiano comportamento è controllato dall'attività dei neuroni di orologio che spesso hanno modelli esponenziali di attivazione e disattivazione7. La dinamica esponenziale e l'analisi visiva dei dati ci ha motivato a costruire un modello con termini esponenziali che consiste di quattro esponenti con nove parametri indipendenti e molto somiglianti l'attività volare modello8. Oltre ai dati dell'apparato locomotore, analizziamo anche il suo spettro di potenza. Spettro di attività tipica di volare Mostra picchi multipli alle armoniche T02, T,0, 3, ecc., oltre il picco fondamentale previsto presso il periodo circadiano T0. Secondo il teorema di Fourier, solo un'onda sinusoidale pura produce un singolo picco negli spettri di potenza, mentre più complesse forme d'onda mostrano picchi spettrali più alle armoniche del periodo primario (Figura 1). Pertanto, dato il modello temporale non sinusoidale in attività volare8, uno spettro di potenza multi-picco dei dati è matematicamente previsto e non implica necessariamente la presenza di più periodi di oscillazione. D'importanza, lo spettro di potenza della forma d'onda di modello proposto Mostra anche picchi presso tutte le armoniche del periodo primario, simile alle registrazioni locomotore volare, sottolineando così l'alta fedeltà con cui il nostro modello descrive dati volare nel tempo e in frequenza.
A risoluzioni di tempo di pochi minuti o meno, volare attività dati appare rumorosi, rendendo difficile per estrarre i parametri direttamente dai dati grezzi. Binning dati in intervalli di tempo più lungo possono diminuire il livello di rumore, ma, possono modificare i dati in modi che possono influenzare la stima dei parametri del modello. Otteniamo quindi i parametri da spettri di potenza delle registrazioni, utilizzando un'espressione analitica per gli spettri di potenza previsto calcolati dalla trasformata di Fourier della funzione modello8 (Vedi ulteriore File 1 di riferimento8). Questo approccio di ottenere parametri dagli spettri di potenza produce i valori dei parametri precisi senza qualsiasi ulteriori manipolazioni, come binning o filtrare, i dati di attività crudo. Dettagli matematici del modello e delle applicazioni ai dati wild-type e mutanti sono descritti in riferimento8. Il protocollo presentato qui si concentra sulle istruzioni dettagliate per utilizzare lo strumento computazionale.
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Protocol
1. misurazione volare locomozione utilizzando Drosophila attività Monitor (diga)
Nota: per maggiori dettagli vedi riferimento 5.
- Preparare singoli tubi con cibo per volare su un'estremità e cotone da altro. Alla fine con il cibo dovrebbe essere sigillata per evitare il cibo si secchi.
- Mettere 5-6 g di alimento in un becher da mL 50. Tagliare il cibo in piccoli pezzi in modo che è più facile a sciogliersi it.
- 32 collegare tubi di vetro singolo con un elastico.
- Sciogliere il cibo nel becher di riscaldamento nel forno a microonde per 10-15 fermata s. forno a microonde ogni 5 s e agitare accuratamente il becher per garantire parità di fusione di cibo.
- Mentre il cibo è ancora liquido, mettere i tubi singoli preparati nel becher con il cibo. Spostare su e giù i tubi così sono altrettanto pieni.
- Consenti il cibo per raffreddare e solidificare per circa 1 h.
- Dopo il cibo è solida, togliere le provette con il cibo dal becher.
- Sigillare l'estremità contenente il cibo utilizzando cera. In primo luogo, rimuovere attentamente un filmato utilizzando un tovagliolo di carta, quindi premere il tubo contro la cera. Visivamente verificare la qualità del sigillo e se necessario, ripetere la tenuta ancora.
- Chiudere l'altra estremità del tubo con cotone; cotone permetterà aria di passare attraverso mentre mantenendo una Mosca bloccato nel tubo.
- Inserire un singolo fly in ogni singolo tubo e inserire i tubi nella diga. Monitor
- posto in un'incubatrice che mantiene l'umidità e temperatura costante. Basato sull'esperimento, impostare come segue le giuste condizioni di luce/buio.
- Per esperimenti di chiaro/scuro tenere le mosche nel ciclo luce/buio per l'intero esperimento. Non utilizzare il primo giorno delle misurazioni nell'analisi.
- Per gli esperimenti di buio costante, in primo luogo tenere le mosche per due giorni in condizioni di luce/buio per la sincronizzazione degli orologi e trascinamento e quindi passare alla oscurità costante. Non utilizzare le misurazioni dal primo giorno di buio costante nell'analisi.
- Raccogliere almeno quattro giorni di dati che possono essere utilizzati nell'analisi.
Nota: Il sistema DAM emetterà un singolo file con una registrazione di locomozione di tutte le mosche nel monitor.
2. Analisi dei dati
- Split monitor file di output in più file di singola attività volare; ogni file deve essere una singola colonna '. txt ' file con una misurazione individuale volare locomozione.
- Run ' ModelFitPS3.m ' funzione in una finestra di comando di Matlab con i seguenti parametri di input:
- per samplingrate, impostare l'intervallo di tempo di campionamento dei dati in pochi secondi. Ad esempio, se l'attività è stata misurata ogni minuto, immettere 60 come il samplingrate.
- Per bin_interval, impostare l'intervallo di tempo in minuti al quale i dati verranno cestinati per una migliore visualizzazione; l'intervallo consigliato bin è 20-30 min
- Per la tendenza, immettere " 1 " se i dati mostrano tendenza iniziale e " 0 " altrimenti; dati con tendenza saranno essere detrended prima di montare un polinomio di secondo ordine e quindi sottraendo i dati.
- Finestra popup nella quale selezionare un file di singola attività volare.
Nota: Il primo appezzamento è lo spettro di potenza di dati e non la trama di attività familiare. Dallo spettro della potenza tracciati, determinare il principale periodo T 0: fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul picco circadiano, o con il pulsante destro del mouse sulla cima della seconda armonica (intorno T 0 / 2). - Sulla trama di dati aperto, controllare se la mattina e sera cime sono ben visualizzati. In caso contrario, modificare il valore di bin_interval facendo clic destro in un punto qualsiasi del grafico e inserendo il nuovo valore di bin_interval nella finestra di dialogo. Il programma verrà aggiornate i dati con il nuovo valore dell'intervallo. Per accettare il valore di bin_interval, a sinistra fare clic sul grafico.
- Il programma sarà ridisegnare nuovamente i dati e Visualizza i primi cinque giorni di attività. Su questo terreno, fare clic sul primo picco M che verrà utilizzato nell'analisi (a volte è necessario saltare uno o due giorni).
Nota: Il programma verrà ridisegnare il grafico a partire dal picco mattina raccolti. Le linee blue e rosse mostrerà la posizione approssimativa della E con successivo giorno M picco, rispettivamente, basato sul periodo determinato nel passaggio 2.4. - Sullo stesso grafico, scegliere dati per una vestibilità preliminare dei dati con il modello: fare clic sui seguenti punti (in questo ordine; si noti che la posizione di scatto sarà indicata con una stella rossa sul fondo): picco (i) Top di M; (ii) fine del picco M; (iii) inizio del picco E; (iv) la cima del picco E; (v) fine del picco E; (vi) la cima del picco M del giorno successivo.
- Si noti che il programma presenta ora lo spettro di potenza.
Nota: L'asse x è ora dato in frequenza.- Nella finestra aperta con lo spettro di potenza, selezionare punti che verranno utilizzati per il montaggio l'espressione analitica per lo spettro di potenza del modello. Il periodo rilevato nel passaggio 2.4 è segnato con una linea rossa. Per selezionare punti di raccordo, innanzitutto determinare approssimativamente il periodo primario, simile al punto 2.4. Quindi utilizzando il dispositivo di scorrimento, ritocca il periodo primario valore affinché il raccordo punti (indicati con cerchi rossi, apparirà dopo aver spostato il cursore) sono chiusi per i valori di picco.
- Dopo la selezione di picco visual, fare clic su " Accept " e il programma adatterà punti selezionati con l'espressione analitica per calcolare i parametri di modello.
- Si noti che i parametri e l'errore di forma spettrale sono salvati nel file " model_fit_parameters.txtŔ il programma salverà inoltre 2 figure con accoppiamenti dei dati dell'apparato locomotore e il suo spettro di potenza.
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Representative Results
Il metodo presentato qui permette la quantificazione delle caratteristiche principali nel modello di locomozione volare. La quantificazione avviene inserendo i dati di attività con un modello che consiste di quattro termini esponenziali:
Il modello dispone di nove parametri indipendenti che descrivono il modello di attività. I parametri bMD,bMR,bEDe bER definire i tassi di decadimento di mattina (MD), aumento di mattina (MR), sera di decadimento (ED) e aumento di sera (ER), rispettivamente. Parametro T0 definisce periodo circadiano, TM e TE definire larghezze delle cime M ed E e HM e HE definire altezze dei picchi M ed E.
Valori dei parametri sono ottenuti dai dati non filtrati in pochi passaggi (Figura 2). In primo luogo, è fissato un periodo circadiano dallo spettro di potenza di attività (punto 2.4 del protocollo). Quindi, i valori dei parametri preliminari vengono estratti dalla locomozione registrazione inserendo con la f (t) (passaggi di protocollo 2,5-2,6). Questi valori servono come ipotesi iniziale per il montaggio lo spettro di potenza di dati con un'espressione analitica derivata in8 (file aggiuntivo 1 in riferimento8) prendendo la trasformata di Fourier di f (t):
dove Tn = T0/n, con n = 1, 2,3... T0 corrisponde al periodo circadiano (protocollo passi 2.7-2.8). Utilizzando la misura spettrale, i parametri del modello vengono estratti dalla locomozione volare senza filtraggio o binning. Montaggio dello spettro di potenza produce valori finali per i parametri di modello, che vengono poi utilizzati per costruire lo stadio evolutivo finale di f (t), vale a dire, il modello di volare ritmi dell'apparato locomotore.
Nel modello, i parametri b possono essere negativo o positivo, che riflettono la curvatura dei corrispondenti termini esponenziali. I parametri bMD e bER sono positivi quando gli esponenti sono convesse e negativo quando gli esponenti sono concavi, mentre i parametri bMR e bED sono positivi quando gli esponenti sono concavi e negativi quando la gli esponenti sono convessi. In generale, per gli esponenti che descrive il picco M, l'aumento nei parametri b indica più lento aumento o decadimento, e per gli esponenti che descrive il picco E, l'aumento nei parametri b indica più veloce aumento o decadimento.
La figura 3 Mostra esempi delle misure ottenute con questo algoritmo. Picchi spettrali a T0 e armoniche da T02 a T010 sono montati (Figura 3A). Altre armoniche in genere abbiano altezza inferiore al livello di significatività di 0,05 e pertanto non vengono utilizzati nell'analisi. Parametri ottenuti dal fit spettrale sono utilizzati per costruire un modello per la locomozione volare (Figura 3B, rosso). Il metodo funziona sia per mosche wild-type (Figura 3, pannello superiore) mutanti circadiani alterato lunghezze periodo (Figura 3, pannelli centro e in basso). Per ulteriori esempi e collegamenti tra il modello e la biologia sottostante, fare riferimento a Lazopulo et al. 8 risultati dalla procedura di montaggio vengono salvati in un file nel seguente ordine: bMD,bMR,bER,bED, T0, TM/t0, TE / T0, HM, HE (tabella 1). Il programma salva anche nel file di output l'errore di adattamento della fit spettrale, 'Err', che viene calcolato come somma dei quadrati dei residui (somma residua dei quadrati) normalizzati per il quadrato della massima dello spettro di potenza di dati.
Figura 1 . Spettri di diverse forme d'onda di potenza. Secondo il teorema di Fourier, solo un'onda sinusoidale viene illustrato un singolo picco in uno spettro di potenza, mentre forme d'onda più complesse, come onda quadrata o a dente di sega, mostrano ulteriori picchi alle armoniche del periodo primario. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Rappresentazione schematica dell'algoritmo parametro-estrazione. Parametro finale vengono ottenuti dalla montaggio lo spettro di potenza. Poiché la procedura di montaggio può essere sensibile ai valori iniziali, l'algoritmo utilizza preliminari valori calcolati dai dati di locomozione e li aggiorna utilizzando lo spettro di potenza. I valori di parametro finale vengono utilizzati per costruire f (t) che meglio descrive i dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Risultati rappresentativi del metodo che quantifica volano locomozione utilizzando una forma d'onda modello. (A) i parametri del modello vengono estratti dal raccordo i primi dieci picchi dello spettro di potenza. (B) i parametri ottenuti vengono utilizzati per costruire un modello di attività. Il metodo può essere applicato al tipo selvaggio mosche (pannello superiore) o mutanti con breve (pannelli) e lungo i ritmi circadiani (pannello inferiore). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| volare il genotipo | bMD (1/min) | bMR (1/min) | bED (1/min) | bER (1/min) | T0 (min) | TM/t0 | TE/t0 | HM | HE |
| wild-type | 0.0094 | 0.2077 | -0.0383 | 0.0606 | 1438 | 0.1528 | 0,0833 | 5.2238 | 8.7185 |
| breve circadiano mutante | 0,015 |
Tabella 1. Esempio di parametri estratti da montaggio gli spettri di potenza, illustrati nella Figura 3. Il programma restituisce i valori di parametro finale al file "model_parameters.txt" come mostrato nella tabella.
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Discussion
Questo lavoro presenta le istruzioni per l'utilizzo di uno strumento computazionale che fornisce una descrizione quantitativa del pattern di locomozione volare. Lo strumento si inserisce dati di locomozione con un modello matematico che consiste di quattro termini esponenziali che descrivono la forma e le dimensioni delle cime M ed E. I valori finali per i parametri di modello sono ottenuti da montaggio gli spettri di potenza dei dati, dove l'uso dei dati grezzi può evitare effetti artefactual che dati binning o filtraggio possono imporre sui valori dei parametri. I parametri di modello consente quindi di ulteriore studio di locomozione volare e i meccanismi che danno luogo a picchi di attività.
La qualità del raccordo può essere valutata in due modi: tramite l'osservazione visiva dello spettro di potenza adatta e utilizzando l'errore di adattamento (somma residua dei quadrati) che viene calcolato con i parametri. Uno dei fattori chiavi che influenza la qualità adatta è la determinazione del periodo circadiano T0 (passo 2.8 del protocollo). Questo valore di T0 colpisce la stima dei picchi nei parametri di modello e spettro di potenza. Un altro passo fondamentale che influenza la qualità adatta è la selezione del punto di partenza per una vestibilità preliminare dei dati (passaggio di protocollo 2.7), dal TM e TE i valori sono definiti attraverso questa selezione. L'utente può esplorare più adatta risultati scegliendo diversi giorni di attività per la definizione di TM e TE.
Il nostro modello è focalizzato sulla che imita il comportamento motorio descritta bene clock controllato con prominente due picchi di attività. Questo comportamento è osservato sia in chiaro/scuro e in condizioni di buio costante, che rende l'approccio applicabile a questi due tipi di esperimenti. Tuttavia, il modello non prendere in considerazione la luce guidato scoppio di attività osservata in alcuni esperimenti di chiaro/scuro. Un'altra limitazione deriva dall'estrazione di parametri di modello che richiedono l'input dell'utente (passaggi di protocollo 2,7-2,9). Poiché i parametri TMe TET0 sono ottenuti dall'input dell'utente, ogni attività volare dovrebbero essere analizzati manualmente. Inoltre, è consigliabile utilizzare il metodo con attività individuali, piuttosto che con una popolazione media recording, poiché la procedura di calcolo della media nasconde molte importanti differenze individuali nella locomozione volare. Anche se può sembrare ingombrante per gran numero di mosche, analizzando volare attività singolarmente, l'utente ottiene preziose informazioni statistiche sul grado di variazione dei parametri all'interno di un gruppo di animali. Per trascurare questi benefici, è possibile generare una locomozione volare una media di popolazione e analizzarlo per ottenere i valori di parametro medio.
Il modello utilizzato in questo lavoro è una versione migliorata della forma d'onda dalla nostra precedente ricerca8. A differenza del modello precedente, ha parametri distinti per altezze dei picchi M ed E, H,M e HE, rispettivamente. Il nuovo modello Mostra prevedibilmente migliore accordo con dati relativi all'attività di volare, poiché la mattina e sera picchi in genere hanno altezze diverse.
Questa analisi non è limitata a volare locomozione misurata con la tecnica a raggi infrarossi. Altri metodi, ad esempio dei video-monitoraggio, producono modelli simili di attività quotidiana volare con M ed E vette mostrando dinamica esponenziale di crescita e decadimento9. Lo strumento discusso qui può essere applicato facilmente a questi insiemi di dati alternativi pure.
Il metodo illustrato qui quantifica volare locomotore registrazioni con l'obiettivo di collegare uscita comportamento ai meccanismi di fondo che regolano volare comportamento quotidiano e controllare il modello di attività bimodale. Parecchi studi recenti finalizzata alla identificazione di neuroni e substrati tale forma M e picchi di attività E10,11. I ricercatori hanno manipolato l'attività di alcuni gruppi neuronali e analizzato il loro ruolo nella formazione del picco sera osservando cambiamenti nella fase del picco E di altezza e. Nel nostro modello, i parametri HE determina l'altezza del picco E, TE dà la larghezza del picco, e parametri bER e bED a descrivere la forma di picco. Come descritto nel riferimento8, in un contesto biochimico HE possono indicare la misura dei livelli di neuropeptidi NPF e ITP, mentre bER e bED possono rappresentare le tariffe del loro rilascio e la degradazione. Insieme, che questi parametri possono essere utilizzati in futuro studi per connetterti meglio Vola comportamento con neuromodulatory segnalazione, verso una descrizione integrata dei modelli bimodale in ritmi locomotore volare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati a Stanislav Lazopulo per aiuto con il contenuto del video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor | TriKinetics | DAM2, DAM5 | Measures fly locootion using single infrared beam |
| MatLab | Mathworks | Computing environment and programming language, MatLab should include Optimization and Symbolic Math toolboxes | |
| Drosophila melanogaster | per[S], per[L], iso31(wild type) | Our analysis can be performed with fly mutants of any circadian period |
References
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