Summary
É apresentado um método para quantificar as principais características temporais vistas na moscas circadianos ritmos locomotoras. A quantificação é alcançada por encaixe atividade voar com uma forma de onda do modelo multi paramétrico. Os parâmetros do modelo descrevem a forma e o tamanho da manhã e noite picos de atividade diária.
Abstract
Na maioria dos animais e plantas, pulsos de disparo circadianos orquestram processos comportamentais e moleculares em sincronizá-los para o ciclo diário de claro-escuro. Mecanismos fundamentais subjacentes a este controle temporal são amplamente estudados usando a mosca de fruta Drosophila melanogaster como um organismo modelo. Nas moscas, o relógio é tipicamente estudado analisando multiday gravação locomotor. Tal gravação mostra um complexo padrão bimodal com dois picos de atividade: um pico de manhã que acontece ao amanhecer e um pico de noite que acontece ao redor de Crepúsculo. Estes dois picos formam uma forma de onda que é muito diferente de sinusoidais oscilações observada nos genes do relógio, sugerindo que os mecanismos além do relógio têm efeitos profundos em produzir os padrões observados em dados comportamentais. Aqui nós fornecemos instruções sobre o uso de um método computacional desenvolvido recentemente que descreve matematicamente padrões temporais na atividade de voar. O método combina dados de atividade com uma forma de onda de modelo que consiste de quatro termos exponenciais e nove parâmetros independentes que descrevem completamente a forma e o tamanho da manhã e noite picos de atividade. Os parâmetros extraídos podem ajudar a elucidar os mecanismos cinéticos de substratos que sustentam os padrões de atividade bimodal comumente observados em ritmos locomotoras voar.
Introduction
O relógio circadiano é um oscilador bioquímico endógeno com um período de aproximadamente 24 horas e é quase onipresente nos animais e plantas1,2. O relógio ajuda a sincronizar processos internos do organismo e o comportamento para o ciclo escuro luz externo. A estrutura genética do relógio circadiano tem sido amplamente estudada desde a década de 1960 usando a mosca de fruta, d. melanogaster. Neste inseto, o núcleo do relógio circadiano consiste de quatro proteínas: período, TIMELESS, CLOCK e ciclo. Estes componentes de núcleo juntamente com outras moléculas formam um laço de realimentação que produz quase sinusoidais oscilações de relógio genes3,4. O relógio circadiano em moscas é amplamente estudado usando multiday locomotoras gravações onde forem detectadas atividades de voar com um único feixe infravermelho cruzando no meio de um tubo individual5. Uma mosca típica de gravação tem um complexo padrão bimodal com dois picos bem distinguíveis: pico de manhã (M) que começa no final da noite e tem um máximo quando liga as luzes; e o pico de noite (E) que começa no final do dia e tem um máximo quando luzes desliguem6. Curiosamente, a forma de tal gravação comportamental é muito diferente de simples sinusoidais oscilações observadas a nível molecular, sugerindo a ação de mecanismos adicionais, contribuindo para os padrões observados temporais. Para entender melhor estes mecanismos ocultos, nós desenvolvemos uma ferramenta computacional que fornece uma descrição quantitativa dos padrões temporais.
Em nosso trabalho, ritmos de locomoção são definidos em termos de uma forma de onda que imita o padrão de atividade de voar. Desde simples ondas senoidais não pode ser usadas para modelar as mudanças observadas rítmicas em atividade, testamos várias formas de sinal para selecionar o mais simples que captura todas as características salientes vistas nas gravações. Mosca da fruta circadian comportamento é controlada pela atividade de neurônios de relógio que muitas vezes têm padrões exponenciais de ativação e desativação de7. A dinâmica exponencial e a análise visual dos dados motivaram-na construir um modelo com termos exponenciais, consistindo de quatro expoentes com nove parâmetros independentes e muito parecidas com o padrão de atividade voar8. Além dos dados do aparelho locomotoras, analisamos também seu espectro de energia. Espectro de atividade típica de mosca mostra vários picos em harmônicos T02, T03, etc., além do esperado pico fundamental no período circadiano T0. De acordo com o teorema de Fourier, apenas uma onda senoidal pura produz um único pico no espectro de energia, enquanto as mais complexas formas de onda mostram vários picos espectrais em harmônicos do período primário (Figura 1). Portanto, tendo em conta o padrão temporal não-sinusoidal em atividade voar8, um espectro de potência multi-pico dos dados matematicamente é esperado e não implica necessariamente a presença de vários períodos de oscilação. Importante, o espectro de potência da onda modelo proposto também mostra picos em todos os harmônicos do período primário, semelhante às gravações locomotoras voar, reforçando assim a alta fidelidade com a qual nosso modelo descreve dados voar no tempo e na frequência.
Em resoluções de tempo de alguns minutos ou menos, mosca atividade dados aparecem barulhentos, tornando-se difícil extrair parâmetros directamente a partir dos dados brutos. Binning dados em intervalos de tempo mais longos podem diminuir o nível de ruído, mas podem alterar os dados de maneiras que podem afetar a estimativa dos parâmetros do modelo. Portanto, obtemos os parâmetros de espectros de potência das gravações, usando uma expressão analítica para os espectros de potência esperado calculados a partir da transformada de Fourier do modelo função8 (veja arquivo adicional 1 de referência8). Esta abordagem de obter parâmetros de espectros de potência produz valores de parâmetros precisos sem quaisquer manipulações adicionais, tais como binning ou filtragem, dos dados brutos de atividade. Detalhes matemáticos do modelo e dos aplicativos de dados tipo selvagem e mutantes são descritos na referência8. O protocolo apresentado aqui centra-se sobre as instruções passo a passo para usar a ferramenta computacional.
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Protocol
1. medindo voar locomoção usando Drosophila atividade Monitor (DAM)
Nota: para mais detalhes veja referência 5.
- Preparar individual voar tubos com comida em uma extremidade e algodão do outro. Final com alimentos deve ser selado para evitar que os alimentos sequem.
- Coloque 5-6 g de comida de mosca num copo de 50 mL. Corte os alimentos em pedaços pequenos, para que seja fácil de derretê-la
- Tubos de vidro individuais 32 conectar com um elástico.
- Derreter o alimento no copo por aquecimento em um forno de microondas por 10-15 s. pare o microondas cada 5 s e agitar cuidadosamente o copo para garantir fusão igual de alimentos.
- Enquanto a comida é ainda líquida, colocar os tubos individuais preparados no copo com comida. Mover os tubos acima e para baixo assim que eles são igualmente preenchidos.
- Permitir a comida arrefecer e solidificar por aproximadamente 1 h.
- Depois que o alimento é sólido, retirar os tubos com a comida do copo.
- Selo final contendo a comida usando cera. Primeiro, cuidadosamente limpo um tubo usando uma toalha de papel, em seguida, pressione o tubo contra a cera. Visualmente a verificar a qualidade do selo e se necessário, repetir a selagem novamente.
- Fecha a outra extremidade do tubo com algodão, algodão permitirá a passar enquanto manter uma mosca bloqueado no tubo de ar.
- Coloque uma única mosca em cada tubo individual e coloque os tubos na barragem.
- Lugar de monitores em uma incubadora que mantém a umidade e a temperatura constante. Com base na experiência, defina as condições apropriadas de claro/escuro como segue.
- Para experimentos de claro/escuro espantar as moscas em ciclo claro/escuro para todo o experimento. Não utilize o primeiro dia de medições na análise.
- Para experimentos de escuridão constante, primeiro, manter as moscas durante dois dias em condições de luz/escuro de arrastamento e sincronização dos pulsos de disparo e alterne para escuridão constante. Não utilize as medições desde o primeiro dia de escuridão constante na análise.
- Coletar pelo menos quatro dias de dados que podem ser usados na análise.
Nota: O sistema de DAM imprimirá um único arquivo com uma gravação de locomoção de todas as moscas no monitor.
2. Análise de dados
- dividir arquivo de saída do monitor em vários arquivos de única atividade mosca; cada arquivo deve ser uma única coluna '. txt ' arquivo com uma medição individual de locomoção mosca.
- Run ' ModelFitPS3.m ' função em uma janela de comando do Matlab com os seguintes parâmetros de entrada:
- para Taxa amostragem, definir o intervalo de tempo de amostragem de dados em segundos. Por exemplo, se a atividade foi medida a cada minuto, digite 60 como o Taxa amostragem.
- Para bin_interval, defina o intervalo de tempo em minutos, para que dados vão ser guardados para melhor visualização; o intervalo recomendado bin é 20-30 min.
- Para a tendência, digite " 1 " se os dados mostram tendência de base e " 0 " contrário; dados com tendência vão ser detrended primeiro pelo encaixe de um polinômio de segunda ordem e em seguida subtraindo-lo a partir dos dados.
- Na janela pop-up, selecione um arquivo de única atividade mosca.
Nota: A primeira parcela é espectro de potência de dados e não o enredo de atividade familiar. A partir do espectro de potência plotados, determinar o período primário T 0: clique com o botão esquerdo do mouse sobre o pico circadiano, ou com o botão direito do mouse sobre o segundo pico harmônico (em torno de T 0 / 2). - Sobre a trama de dados aberto, verifique se a manhã e a noite picos são bem visualizados. Se não, altere o valor de bin_interval pelo botão direito do mouse em qualquer lugar no gráfico e introduzir o novo valor de bin_interval na caixa de diálogo. O programa irá redesenhar os dados com o novo valor do intervalo. Para aceitar o valor de bin_interval, clique esquerdo em qualquer lugar no gráfico.
- o programa irá redesenhar os dados novamente e mostrar os primeiros cinco dias de atividade. Sobre esta trama, clique sobre o primeiro pico de M que será usado na análise (às vezes é preciso pular um ou dois dias).
Nota: O programa irá redesenhar o gráfico a partir do pico de manhã peguei. As linhas azuis e vermelhas mostrará a posição aproximada do pico E e próximo pico dia M, respectivamente, com base no período determinado na etapa 2.4. - No mesmo gráfico, escolha dados para um ajuste preliminar dos dados com o modelo: clique sobre os pontos seguintes (nesta ordem; Observe que o local do clique será indicado com uma estrela vermelha na parte inferior): pico de (i) topo de M; (ii) fim do pico M; (iii) início do pico E; (iv) o topo do pico E; (v) fim do pico E; (vi) topo do pico do dia seguinte, M.
- Observe que o programa agora apresenta o espectro de poder.
Nota: O eixo x é dada agora na frequência.- Na janela aberta com o espectro de potência, escolher pontos que serão usados para a montagem da expressão analítica para o espectro de potência do modelo. O período detectado na etapa 2.4 é marcado com uma linha vermelha. Para escolher os pontos de fixação, primeiro determine aproximadamente o período primário, semelhante ao passo 2.4. Em seguida, usando o controle deslizante, ajuste o período primário valor para que o encaixe pontos (mostrada com círculos vermelhos, aparecerá depois de mover o controle deslizante) estão fechados para valores de pico.
- Após a seleção de pico visual, clique " aceitar " e o programa vai caber pontos selecionados com a expressão analítica para calcular os parâmetros modelo.
- Observe que os parâmetros e o erro de forma espectral são salvas no arquivo " model_fit_parameters.txtŔ o programa salvará adicionalmente 2 figuras com ataques de dados os aparelho locomotoras e seu espectro de energia.
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Representative Results
O método apresentado aqui permite a quantificação das principais características no padrão de locomoção voar. A quantificação é alcançada por encaixe os dados de atividade com um modelo que consiste de quatro termos exponenciais:
O modelo possui nove parâmetros independentes que descrevem o padrão de atividade. Os parâmetros bMDbsenhor,bEDe bER definir as taxas de decomposição de manhã (MD), aumento de manhã (Senhor) e à noite decadência (ED.), aumento de noite (ER), respectivamente. Parâmetro T0 define período circadiano, TM e TE definem as larguras dos picos M e E e HM e HE definem alturas dos picos M e E.
Valores dos parâmetros são obtidos a partir dos dados não filtrados em algumas etapas (Figura 2). Primeiro, um período circadiano do espectro de potência de atividade (etapa de protocolo 2.4) é determinado. Então, valores de parâmetros preliminares são extraídos a locomoção gravação encaixando-a com a f (t) (passos de protocolo 2.5-2.6). Estes valores servem como uma suposição inicial para caber o espectro de potência de dados com uma expressão analítica derivada em8 (arquivo adicional 1 em referência8) tomando a transformada de Fourier de f (t):
onde Tn = T0/n, com n = 1, 2,3... e T0 é o período circadiano (protocolo passos 2.7-2.8). Usando o ajuste espectral, os parâmetros do modelo são extraídos de locomoção voar sem filtragem ou binning. Encaixe do espectro de energia produz valores finais para os parâmetros do modelo, que são usados para construir a forma final de f (t), ou seja, o modelo de ritmos locomotoras voar.
No modelo, b parâmetros podem ser negativo ou positivo, que refletem a curvatura dos correspondentes termos exponenciais. Os parâmetros bMD e bER são positivos quando os expoentes são convexos e negativo quando os expoentes são côncavos, enquanto os parâmetros b,Sr e bED são positivos quando os expoentes são côncavos e negativo quando o expoentes são convexos. Em geral, para os expoentes descrevendo o pico M, o aumento nos parâmetros de b indica mais lenta ascensão ou decadência, e para os expoentes descrevendo o pico E, o aumento nos parâmetros de b indica mais rápida ascensão ou decadência.
A Figura 3 mostra exemplos de ajustes obtidos por este algoritmo. Disporem de picos espectrais em T0 e harmônicos de T02 T010 (Figura 3A). Outros harmônicos normalmente têm altura inferior ao nível de significância de 0,05 e, portanto, não são usados na análise. Parâmetros obtidos a partir do ajuste espectral são usados para construir um modelo para locomoção mosca (Figura 3B, vermelho). O método funciona para moscas de tipo selvagem (Figura 3, os painéis superiores) e para circadianos mutantes com comprimentos períodos alterados (Figura 3, painéis de média e inferior). Para ligações entre o modelo e biologia subjacente e exemplos adicionais, consulte Lazopulo et al. 8 resultados do procedimento de montagem são salvas em um arquivo na seguinte ordem: bMDbsenhor,bER,bED, T0, TM/t0, TE / T0, H,M, HE (tabela 1). O programa também salva o arquivo de saída o erro de montagem do ajuste espectral, 'Err', que é calculado como a soma dos quadrados dos resíduos (soma residual dos quadrados) normalizados pelo quadrado do máximo do espectro de potência de dados.
Figura 1 . Espectros de diferentes formas de onda de energia. De acordo com o teorema de Fourier, apenas uma onda sinusoidal mostra um único pico em um espectro de energia, enquanto formas de onda mais complexas, como a onda quadrada ou dente de serra, mostram picos adicionais em harmônicos do período primário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Representação esquemática do algoritmo de extração de parâmetro. Valores de parâmetro final são obtidos do encaixe do espectro de energia. Desde que o procedimento de instalação pode ser sensível a partir de valores, o algoritmo usa preliminares valores calculados a partir dos dados de locomoção e atualiza-los usando o espectro de potência. Os valores de parâmetro final são usados para construir f (t) que melhor descreve os dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Resultados representativos do método que quantifica voam usando uma forma de onda do modelo de locomoção. (A) parâmetros do modelo são extraídos de montagem os primeiro dez picos do espectro de energia. (B) obtidas parâmetros são usados para construir um modelo de atividade. O método pode ser aplicado ao tipo selvagem moscas (top painéis) ou mutantes com short (painéis de médios) e tempo dos ritmos circadianos (painéis de fundo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| voar de genótipo | bMD (1/min) | bsenhor (1/min) | bED (1/min) | bER (1/min) | T0 (min) | TM/t0 | Ede T/t0 | HM | HE |
| tipo selvagem | 0.0094 | 0.2077 | -0.0383 | 0.0606 | 1438 | 0.1528 | 0.0833 | 5.2238 | 8.7185 |
| curto circadiano mutante | 0.015 |
Tabela 1. Exemplo de parâmetros extraídos de encaixe os espectros de potência mostrados na Figura 3. o programa gera os valores de parâmetro final para o arquivo "model_parameters.txt", como mostrado na tabela.
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Discussion
Este trabalho apresenta as instruções para o uso de uma ferramenta computacional que fornece uma descrição quantitativa do padrão de locomoção voar. A ferramenta combina dados de locomoção com um modelo matemático que consiste de quatro termos exponenciais que juntos, descrevem a forma e o tamanho dos picos M e E. Os valores finais para os parâmetros do modelo são obtidos de encaixe os espectros de potência dos dados, onde o uso dos dados brutos pode evitar efeitos artefactual que dados binning ou filtragem podem impor aos valores de parâmetro. Os parâmetros do modelo, então, podem ser usado para mais estudo locomoção voar e os mecanismos que dão origem a picos de atividade.
A qualidade do encaixe pode ser avaliada de duas maneiras: através da observação visual do espectro poder caber e usando o erro de montagem (soma residual dos quadrados) que é calculado em conjunto com os parâmetros. Um dos principais fatores que influenciam a qualidade do ajuste é a determinação do período circadiano T0 (etapa de protocolo 2.8). Este valor de T0 afeta a estimativa dos picos nos parâmetros de espectro e o modelo de poder. Outro passo fundamental que influencia a qualidade do ajuste é a seleção de ponto de partida para um ajuste preliminar dos dados (etapa de protocolo 2.7), desde que TM e TE valores são definidos por esta seleção. O usuário pode explorar vários resultados ajuste escolhendo diferentes dias de atividade para definir TM e TE.
Nosso modelo é focado em imitar o comportamento locomotor bem descrito relógio controlado com dois proeminentes picos de atividade. Esse comportamento é observado em claro/escuro e em condições de escuridão constante, que torna a abordagem aplicável a estes dois tipos de experimentos. No entanto, o modelo não leva em conta a luz conduzida explosão de atividade observada em alguns experimentos de claro/escuro. Outra limitação surge a partir da extração de parâmetros de modelo, exigindo a entrada do usuário (etapas de protocolo 2,7-2,9). Desde que os parâmetros TMe TET0 são obtidos a partir da entrada do usuário, cada atividade voar deve ser analisada manualmente. Além disso, é recomendável usar o método com atividades individuais, em vez de com uma média de população gravação, desde que o procedimento de cálculo da média esconde muitos importantes diferenças individuais na locomoção de voar. Embora possa parecer complicado para grande número de moscas, analisando atividades voar individualmente, o usuário obtém valiosas informações estatísticas sobre o grau de variação do parâmetro dentro de um grupo de animais. Para ignorar esses benefícios, é possível gerar uma locomoção voar a média de população e analisá-lo para obter valores de parâmetro média.
O modelo utilizado neste trabalho é uma versão melhorada da forma de onda de nossa anterior pesquisa8. Ao contrário do modelo anterior, tem parâmetros separados para M e E alturas, H,M e HE, respectivamente. Previsivelmente, o novo modelo mostra melhor acordo com os dados de atividade de voar, desde a manhã e a noite picos geralmente têm diferentes alturas.
Esta análise não está limitada a voar locomoção medida com a técnica de feixe infravermelho. Outros métodos, tais como vídeo-tracking, produzem padrões similares de atividade diária voar com picos de M e E mostrando a dinâmica exponencial de ascensão e decadência9. A ferramenta discutida aqui pode ser prontamente aplicada a esses conjuntos de dados alternativos também.
O método discutido aqui quantifica gravações locomotoras moscas com o objetivo de conectar a saída comportamental para mecanismos subjacentes que regulam a voar o comportamento diário e controlar o padrão de atividade bimodal. Vários estudos recentes destinadas a identificação de neurônios e substratos que forma M e picos de atividade E10,11. Os investigadores manipularam a atividade de determinados grupos neuronais e analisaram o seu papel na formação do pico da noite, observando as mudanças na altura e fase do pico E. Em nosso modelo, parâmetros HE determina a altura do pico E, TE dá a largura de pico, e parâmetros bER e bED descrevem a forma de pico. Conforme descrito na referência8, em um contexto de bioquímico HE podem indicar a medida dos níveis de neuropeptídeos PFN e ITP, enquanto bER e bED podem representar as taxas de sua liberação e degradação. Juntos, que estes parâmetros podem ser utilizaram no futuro estudos para conectar melhor comportamento voar com neuromodulatory sinalização, no sentido de uma descrição integrada dos padrões bimodal em ritmos locomotoras voar.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Estamos gratos à Stanislav Lazopulo pela ajuda com o conteúdo de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila Activity Monitor | TriKinetics | DAM2, DAM5 | Measures fly locootion using single infrared beam |
| MatLab | Mathworks | Computing environment and programming language, MatLab should include Optimization and Symbolic Math toolboxes | |
| Drosophila melanogaster | per[S], per[L], iso31(wild type) | Our analysis can be performed with fly mutants of any circadian period |
References
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