Summary
Een cel cultuur model van weerstand slagaders wordt beschreven, waardoor de dissectie van signalering van trajecten in endotheel, gladde spieren, of tussen endotheel en gladde spieren (de kruising van de myoendothelial). De selectieve toepassing van agonisten of eiwit isolatie, elektronenmicroscopie of immunofluorescentie kan worden gebruikt met behulp van deze cel cultuur model.
Abstract
Het myoendothelial junction (MEJ), een unieke signalering microdomain in kleine diameter weerstand slagaders, vertoont lokalisatie van specifieke proteïnen en signalering processen die vasculaire Toon en bloeddruk kunnen. Als het is een projectie van hetzij de cel endothelial of gladde spieren, en als gevolg van zijn kleine formaat (gemiddeld een oppervlakte van ~ 1 µm2), de MEJ is moeilijk om te studeren in afzondering. Echter hebben we een cel cultuur model genaamd de vasculaire co celcultuur (VCCC) waarmee in vitro MEJ vorming, endothelial cel polarisatie en dissectie van signalering eiwitten en processen in de vasculaire muur van verzet slagaders. De VCCC heeft een veelheid van toepassingen en kan aangepast worden aan verschillende soorten cellen. Het model bestaat uit twee celtypen gegroeid aan weerszijden van een filter met 0.4 µm poriën waarin de in vitro MEJs kunnen vormen. Hier beschrijven we hoe maak je de VCCC via beplating van cellen en isolatie van endotheel, MEJ, en glad spierweefsel fracties, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor isolatie van de eiwit- of activiteit testen. Het filter met intact cel lagen kan worden opgelost, ingesloten en verdeelde immunefluorescentie p.a.. Nog belangrijker is, zijn veel van de ontdekkingen van dit model bevestigd met behulp van intact weerstand slagaders, de fysiologische relevantie onderstrepen.
Introduction
In kleine diameter weerstand slagaders scheidt een dunne interne elastische lamina (IEL) endothelial (EG) en de zachte spiercellen (SMC). De cellen kunnen project door openingen in deze elastische matrix en leveren van directe cytoplasmatische verbindingen via gap junction kanalen1,2. Deze unieke structuur is de myoendothelial kruising (MEJ) genoemd. De MEJ is een klein (ongeveer 0,5 µm x 0,5 µm, afhankelijk van het vasculaire bed), cellulaire projectie bestaat voornamelijk uit endotheliale cellen, maar kan voortkomen uit gladde spieren ook3,4. Een aantal onderzoekers hebben aangetoond dat de enorme complexiteit van de netwerken die zich selectief bij de MEJ voordoen, waardoor zij een bijzonder belangrijke locatie voor het vergemakkelijken van de bi-directionele signalen tussen endotheel en gladde spieren5 signalering ,6,7,8,9,10.
Een mechanistische dissectie van signaalroutes op de MEJ is echter moeilijk in een intact slagader. Omdat de MEJ een cellulaire projectie is, is het momenteel niet mogelijk om te isoleren een in vivo MEJ van de vasculaire muur. Om deze reden werd de VCCC model1 ontwikkeld. Nog belangrijker is, de VCCC repliceert fysiologische endothelial morfologie11 en polarisatie van de signalen tussen de apicale en MEJ gedeelten van de cel-12. Het was dit unieke model, dat de ontdekking dat alfa hemoglobine in de endothelial cel vergemakkelijkt is, gepolariseerde aan de MEJ. Dit is in tegenstelling tot conventioneel gekweekte endotheliale cellen die niet Alfa hemoglobine13 uitdrukken doen. Voor onderzoekers microvasculaire endotheel kochten, kan het dienstig meer gebruik van endotheliale cellen die hebben zijn gekweekt in de VCCC, vooral als de bedoeling is om te ontleden signaalroutes die zich in een kleine diameter weerstand slagaders voordoen.
Met behulp van een stevige plastic invoegen met een filter met een kleine diameter poriën (0.4 µm in diameter) te co cultuur twee verschillende celtypes voorkomt dat de cellen migreren tussen lagen. Het resulteert in een 10 µm-afstand tussen de cellen, die is aanzienlijk langer dan in vivo, maar nog steeds wordt gerepliceerd veel van de in-vivo -kenmerken van MEJs, waaronder eiwitten lokalisatie en tweede messenger signalering1 , 14. verder de VCCC staat voor het targeten van cel type-specifieke signalering via de toevoeging van een agonist of -antagonist tot de specifieke cellulaire compartiment. Bijvoorbeeld, laden van de EG met BAPTA-AM aan chelaat de calcium, en het stimuleren van de SMC met phenylephrine14. In tegenstelling tot andere beschrijvingen van co cultuur modellen15,16,17,18,19,20,21biedt dit instructies over het isoleren van de verschillende fracties voor mRNA en eiwit, met inbegrip van de verschillende MEJ breuk binnen de poriën van het filter. De toevoeging van deze techniek aan de VCCC voorziet in specifieke onderzoek naar veranderingen in mRNA lokalisatie of transcriptie22, proteïne fosforylatie12,23, en eiwit activiteit12. Dit artikel beschrijft plating van EG bovenop de filter en SMC op de bodem, hoewel het mogelijk is om de cultuur van de twee celtypes in verschillende conformaties11,18,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plating cellen voor de VCCC
- cultuur grote 225 cm 2 flacons van EG en SMC onder steriele omstandigheden bij 37 ° C, tot 70-90% heuvels. Zorgen dat meer EG dan SMC worden gebruikt; Als met behulp van primaire menselijke EG en SMC, meestal 3 grote maatkolven van EG aan 1 grote maatkolf van SMC.
- Gebruik van primaire cellen op lagere passages en gebruik geen verleden passage 10. Kies de voedingsbodems op basis van de cellen die moeten worden mede gekweekt. Voor primaire menselijke coronaire EG, EBM-2 EG basale media met EGM2 MV groeifactoren te gebruiken. Voor primaire menselijke coronaire SMC, SmBM SMC basale media met SmGM-2 groeifactoren te gebruiken. Vóór gebruik met gekweekte cellen, groeifactoren aan de media toevoegen.
- Bouw van de VCCC dag 1: grote (150 mm) petrischalen en deksels Spray met een ontsmettingsmiddel (b.v. Cavicide) en weg te vegen met een papieren handdoek of pluisvrije doekjes. Daarna spray de petrischaaltjes met 70% ethanol (EtOH) en plaats hen in de kap in de lucht droog.
- Open de plaat van filter tussenvoegsels (Zie de Tabel van materialen) onder steriele omstandigheden en jas de SMC kant (onderkant van filter) van het donormateriaal met fibronectine oplossing. Rekening houdend met de invoegen de verstrekte 6-well-plaat, Pipetteer de fibronectine oplossing door de kant Zijsplitjes naar de onderkant van de plaat, om ervoor te zorgen dat de helft van het filter is bodem bedekt (niet meer dan 1 mL).
- Na 30 min van behandeling met fibronectine oplossing bij kamertemperatuur in de cel cultuur kap, nemen inzetstukken uit de plaat, vacuüm van enige overtollige oplossing en omkeren, plaatsen in de onderste helft van de schone petrischaal. Gereserveerd. Zorg dat u niet te verstoren de membraan filter invoegen wanneer het suctioning van overtollige oplossing; Dit kan vermeden worden door zachtjes kantelen van de plaat, en stofzuigen van de oplossing van de rand van het inzetstuk.
- Trypsinize een 225 cm 2 kolf van SMC met 3 mL voorverwarmde 2 X trypsine-EDTA-oplossing, en zodra de cellen hebben getild aan de plaat, 9 mL SMC media te neutraliseren de trypsine (3:1, media: trypsine) toevoegen. Overbrengen naar een conische buis, meng goed en Pipetteer 10 µL op een hemocytometer om te bepalen van celaantal.
- Tellen het aantal cellen in 5 x 5 vakken (d.w.z., 18), vermenigvuldig dit met 10.000 om het aantal cellen in 1 mL (180.000). Vervolgens vermenigvuldigt u met 12 mL (totale hoeveelheid celsuspensie, 2,16 miljoen SMC). Zorg ervoor dat er genoeg SMC om de plaat het gewenste aantal wells.
Opmerking: bijvoorbeeld, 1 goed moeten 75.000 SMC en dus 18 putten 1,35 miljoen totale SMC zou hebben. Verdeel 1,35 miljoen cellen die nodig zijn voor 180.000 cellen per 1 mL en dit resulteert in 7,5 mL van de celsuspensie die nodig zullen zijn voor de beplating. Vervolgens berekent het eindvolume nodig (18 putten x 750 µL = 13,5 mL). Dus, neem 7,5 mL celsuspensie, zodat het volume met voorverwarmde SMC media, en meng goed tot 13,5 mL.
- Tellen het aantal cellen in 5 x 5 vakken (d.w.z., 18), vermenigvuldig dit met 10.000 om het aantal cellen in 1 mL (180.000). Vervolgens vermenigvuldigt u met 12 mL (totale hoeveelheid celsuspensie, 2,16 miljoen SMC). Zorg ervoor dat er genoeg SMC om de plaat het gewenste aantal wells.
- Plaat 750 µL van de celsuspensie met ongeveer 75.000 SMC op de onderkant van elk filter, voorzichtig om niet morsen een van de media en mobiele oplossing. Plaats het deksel op de top en zorgvuldig Breng de petrischaal met de inzetstukken in de incubator bij 37 ° C's nachts.
Opmerking: De optimale celdichtheid voor andere celtypes zal moeten worden empirisch bepaald. - Op dag 2, vul schone 6-well gerechten met 2 mL verse, voorverwarmde SMC media. Verwijder de platen uit de incubator. Neem de inserts uit één filter tegelijk en verwijder het medium door afzuigen, dan plaatst u in de 6-well schotel met SMC media.
- Jas van de overkant van het filter (EG kant) met 1 mL van een oplossing van 0.5% boviene gelatine gedurende ten minste 30 minuten bij 37 ° C.
- Trypsinize de 225 cm 2 flask(s) van de EG met 3 mL voorverwarmde 2 X trypsine-EDTA (10 x verdund in een steriele Dulbecco ' s PBS) oplossing, met zachte aftappen van de kolf om te heffen van de cellen uit de plaat.
Opmerking: Het kan moet de kolf plaats terug in de incubator bij 37 ° C gedurende 1-3 minuten.- Één keer de cellen hebben getild van de plaat, voeg 9 mL EG media te neutraliseren de trypsine (3:1). Overbrengen naar een conische buis, zwembad samen, meng goed, en Pipetteer 10 µL op een hemocytometer om te bepalen aantal cellen.
- Tellen het aantal cellen in 5 x 5 vakken (d.w.z., 60), vermenigvuldig dit met 10.000 om het aantal cellen in 1 mL (600.000). Vervolgens vermenigvuldigt u met 12 mL (totale hoeveelheid celsuspensie, 7,2 miljoen EG). Zorg ervoor dat er genoeg EG aan de plaat het gewenste aantal wells.
Let op: Ongeveer 360.000 EG zijn verplicht per putje. Bijvoorbeeld, vereisen 18 putten 6,48 miljoen EC. Verdeel 6,48 miljoen cellen die nodig zijn voor 600.000 EG per 1 mL en dit resulteert in 10,8 mL van de celsuspensie die nodig zullen zijn voor de beplating. Vervolgens berekent het eindvolume nodig (18 putten x 1 mL = 18 mL). Dus, neem 10,8 mL celsuspensie, zodat het volume maximaal 18 mL met vooraf opgewarmd EG media, en zachtjes resuspendeer.
- Tellen het aantal cellen in 5 x 5 vakken (d.w.z., 60), vermenigvuldig dit met 10.000 om het aantal cellen in 1 mL (600.000). Vervolgens vermenigvuldigt u met 12 mL (totale hoeveelheid celsuspensie, 7,2 miljoen EG). Zorg ervoor dat er genoeg EG aan de plaat het gewenste aantal wells.
- Één keer de cellen hebben getild van de plaat, voeg 9 mL EG media te neutraliseren de trypsine (3:1). Overbrengen naar een conische buis, zwembad samen, meng goed, en Pipetteer 10 µL op een hemocytometer om te bepalen aantal cellen.
- Plaat 1 mL 360.000 EG op de bovenzijde van elk filter invoegen. Laat de cellen Incubeer ongestoord bij 37 ° C gedurende 24 h. vervangen middellange op dag 4. Oogst op dag 5.
2. Oogsten van breuken uit de VCCC
- het uitvoeren van het isolement in een kamer van 4 ° C en houden alle instrumenten op ice.
- Houd in mening het aantal individuele inzetstukken afgezonderd en lysis-buffermengsel toevoegen aan een tube van 50 mL MEJ label (voor de geïsoleerde filters). Label vervolgens twee 10 mm gerechten; één voor EG en één voor SMC.
- Aanpassen, het volume van lysis buffer afhankelijk van hoe geconcentreerd de lysate moet worden; voor 15 voegt, 500 µL van lysis buffer voor de buis MEJ en 250 µL per petrischaal wordt aanbevolen.
- Werk met een 6-well plaat van tussenvoegsels tegelijk. Zuig uit het medium in de cel cultuur kap en vervolgens transport naar een koude kamer op ice.
Opmerking: De volgende instructies gelden voor 1 isolatie plaast. - Pipetteer 10 µL van 1 x PBS op de SMC kant van het donormateriaal.
- Gebruik de cel lifter aan Schraap vaststelling van de cellen op één uiteinde van de insert, en de overdracht van de cellen van de lifter aan de SMC petrischaal die heeft lysis-buffermengsel in IT
- Zodra de cel lifter heeft aangeraakt de lysis-buffermengsel in de schotel, niet laat het aan het filter invoegen aanraken totdat deze is volledig geveegd en gedroogd uit op keukenpapier. Herhaal het schrapen van het SMC filter minstens één tot twee keer volledig verwijderen van de resterende SMC cel puin.
- Draai de invoegen boven en Pipetteer 10 µL van 1 x PBS in de zijkant van de bovenste/EG van het filter invoegen. Herhaal stap 2.6 en 2.7 met een cel schraper en de EG petrischaal.
- Verzamelen de resterende cel en PBS drijfmest van de EG-kant van de filter met een pipet en de overdracht naar de EG petrischaal met lysis-buffermengsel. Worden zeer grondig schrapen de cellen uit beide zijden van het filter dat minimale EG/SMC contaminatie in de Fractie MEJ.
- Gebruik zorgvuldig de scalpel te snijden uit het filter van de plastic invoegen. Doe dit door snijden 70-80% van het uit de buurt van de plastic en gebruik pincet te trekken van het filter helemaal buiten de plastic structuur invoegen. Zet het filter in de conische tube van 50 mL MEJ aangeduid met lysis-buffermengsel, en ervoor zorgen het zit in de lysis-buffermengsel en blijft nat.
- Herhaalt u de stappen van isolatie, in groepen van 6, totdat alle de inserts zijn verwerkt.
- Ervoor dat de verschillende behandeling in groepen worden gehouden in afzonderlijke buizen en gerechten.
- Vortex de conische tube van 50 mL MEJ op volle sterkte voor 15 s of tot goed gemengd. Verwijder de filters van de conische MEJ met pincet, langs de zijwanden van de buis dat de maximale hoeveelheid eiwitten en vloeistof in de buis te verslepen. Na dit punt, het negeren van de filters.
- Zodra alle filters zijn verwijderd uit de MEJ conische buis, doen een snelle draaien (10-15 s max snelheid ~ 16.000 x g) in een centrifuge te trekken alle vloeistof en eiwitten aan de onderkant van de buis. Breng de inhoud van de MEJ buis en de EG en SMC Petri gerechten in afzonderlijke, kleinere centrifuge buizen.
- Optioneel: Bewerk de inhoud van de buizen MEJ/SMC/EG ultrasone trillingen ten op instelling 4 voor drie 10 s pulsen op ijs of meng zachtjes met de hand.
- Centrifugeer bij max snelheid (~ 16.000 x g) 15 min bij 4 ° C. Pipet uit het supernatant en assay de lysate voor eiwitgehalte met behulp van de methode van bicinchoninic assay.
3. De VCCC oogsten voor En Face immunofluorescentie
- op de dag 5 van en met VCCC incubatie, verwijder de inserts uit de incubator. Werken in de cel cultuur kap, zuiging uit de SMC-media uit elk van de lagere putjes van de filter invoegen en spoel tweemaal met 1 x PBS. Herhaal met de EG zijde.
- Houden de inserts intact en heeft daar in de plaat, het toevoegen van 4% paraformaldehyde (PFA) voor 10-20 min in een kamer inloop 4 ° C op een zachte shaker. Was beide zijden van het filter invoegen met 1 x PBS gedurende 5 minuten en herhaal dit twee keer.
Let op: PFA is giftig en moet voorzichtig worden omgegaan. - De blokkerende, primaire en secundaire antilichaam-incubations uitvoeren in de plaat, ervoor te zorgen dat beide kanten van het filter worden gehouden in het antilichaam + blokkeren oplossing (9 mL PBS, 25 µL Triton X100, 50 mg bovien serumalbumine, 500 µL normale serum)
- Voor montage van het filter op een dia, knip het filter uit de plastic invoegen met een scalpel gemonteerd op een handvat en plaats op een microscoopglaasje met montage medium.
4. De VCCC oogsten voor transversale immunofluorescentie
- op de dag 5 van en met VCCC incubatie, verwijder de inserts uit de incubator. Zuiging uit de media aan beide zijden van het filter invoegen in de cel cultuur kap en spoel van elke zijde van het filter twee keer met 1 x PBS.
- Houden de inserts intact en heeft daar in de 6-well plaat, 4% toevoegen PFA en na een nacht bebroeden in een kamer inloop 4 ° C op een zachte shaker.
Let op: PFA is giftig en moet voorzichtig worden omgegaan.
5. De VCCC insluiten voor transversale immunofluorescentie
- na filter voegt ongeveer gedurende 24 uur in 4% zijn opgelost PFA, overdracht naar 70% EtOH gedurende ten minste 24 uur, maar maximaal enkele weken.
- Verwerken de filters op een lange ('s nachts) uitgevoerd op een geautomatiseerde weefsel-processor. Gebruik van het programma als volgt: 70% EtOH voor 30 min, 85% EtOH 30 min. 95% EtOH 30 min, 100% EtOH 30 min, 100% EtOH 45 min, 100% EtOH 45 min, xyleen 30 min, xyleen 30 min, xyleen 45 min, 60 ° C paraffine 30 min, 60 ° C paraffine 30 min , 60 ° C paraffine 45 min.
- Na verwerking, breng de geoogste filters naar het insluiten station in vloeibare paraffine, houden van het filter in de cassette.
- Verwijder het filter uit de cassette, pincet zorgvuldig gebruik te maken om het te houden net aan de rand. Met een schaar, het filter in tweeën gesneden, vormen twee semi-circulaire vormige helften. Leggen, elk van de 2 helften op de koude plaat gedeelte van het insluiten station net lang genoeg om te vullen de inbedding schimmel met vloeibare paraffine.
- Eens gevuld met vloeibare paraffine, heel in het kort raken de insluiten schimmel aan de koude plaat en vervolgens insluiten van elk halfjaar van het filter in het insluiten van de schimmel (gesneden kant naar beneden); Dit zorgt ervoor dat tijdens het segmenteren, een vanaf het midden van het filter naar de rand snijden zal .
- Tijdens het insluiten, gebruik pincet te houden van het filter om te voorkomen dat de helften in elkaar vallen totdat de paraffine is koel genoeg voor hen alleen te staan. De insluiten mal verplaatsen naar een koude plaat totdat volledig verhard.
Opmerking: Koeling van de blokken op ijs trays helpt te voorkomen dat gerimpeld secties.
6. Afdelen en de VCCC kleuring voor transversale immunofluorescentie
- voor de paraffineblokken afdelen en schuif montage: 5 µm delen knippen, plaatst u de secties in een waterbad van 42 ° C en halen van de secties met positief geladen dia's. Dan houden dia's 's nachts in een oven van 42 ° C te drogen.
- Voordat u begint de rehydratie stappen, de dia's op 60 ° C te smelten de paraffine bak en helpen houden de VCCC secties aan de dia. Cool kort en hydrateren van de dia's door middel van twee wijzigingen van xyleen, 100% EtOH, 95% EtOH, een verandering van 70% EtOH, en twee veranderingen in gedestilleerd water.
- Voorkomen antigeen ophalen methoden waarbij magnetron of verwarming zoals secties van de dia wegslepen vallen kunnen.
- Uitvoeren de standaard blokkeren gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, vervolgens de overnachting incubatie met het primaire antilichaam bij 4 ° C, gevolgd door wassen stappen en secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Monteren met de montage media en dekglaasje aan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De filter-inzetstukken gebruikt voor de VCCC hebben kleine, 0.4 µm gaten. Figuur 1A, een weergave van de nl-gezicht van de VCCC filter inzet, toont de poriën waarin de MEJ in vitrokan vormen. Het schema toont de zachte spiercellen verguld aan de onderkant van het filter een dag voordat de endotheliale cellen zijn verguld aan de overkant (figuur 1B). Zodra de cellen zijn verguld, kunnen de EG, MEJ en SMC breuken geïsoleerd drie dagen later. Een voorbeeld hiervan is weergegeven in figuur 2A, waar plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) zeer wordt uitgedrukt in de Fractie MEJ ten opzichte van de rest van de EG, die ook te op de in vivo MEJs25 zien is. Deze gegevens tonen het nut van de VCCC in de vaatwand intact arteriolar bloed Recapitulerend.
Vervolgens wordt de VCCC in immunofluorescentie en elektronenmicroscopie aangetoond. De VCCC blijft intact en vaste met PFA voor transversale immunofluorescentie. Figuur 3A geeft de gladde spieren specifieke alpha-1 adrenergic receptoren en de receptor endothelial specifieke bradykinine. Phalloidin kleuring van F-actine toont de actine-bruggen in de MEJ (witte pijl) tussen de twee cellen, die wordt uitgevoerd, repliceert de expressie in een intact slagader26gezien. In figuur 3B, is een dwarsdoorsnede van de VCCC zoals weergegeven door transmissie-elektronenmicroscopie aangetoond, die wordt weergegeven in 3D in Figuur 3 c. Deze weergaven van de VCCC tonen de mogelijkheid om specifiek lokaliseren eiwitten, receptoren en ultrastructuur in vitro MEJs.
Figuur 1: Plating van de vasculaire co celcultuur (VCCC). (A) En face licht opname van de poriën in het filter invoegen. Zwarte pijlen duiden individuele gaten. (B) Schematische voorstelling van de VCCC plating. Dag 1 toont inversie van de filter invoegen en plating SMC op de bodem. Op dag 2, de EG zijn vergulde aan de andere kant van het filter en de VCCC blijft in deze conformatie in een 6-well-plate tot oogst. Witte pijlen geven aan de kant van de filter waar de cellen zijn verguld en zal groeien. Schaal bar = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: eiwitverrijking in de MEJ. (A) Immuno-transmissie elektronenmicroscoop afbeelding van muis slagader met expressie van Alfa globine op de MEJ (gouden kralen die als zwarte stippen verschijnen). (B) westelijke vlek tonen plasminogen activator inhibitor (PAI-1) 1 expressie wordt verrijkt in de MEJ fractie tegenover de EG of SMC breuken. Kunststof EG geeft EG geteeld op een kunststof schotel, die vormen geen MEJ. Schaal bar = 1 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Transverse immunofluorescentie en elektronenmicroscopie in dwarse secties van de VCCC. (A) Staining voor gladde spieren en endotheel specifieke proteïnen. F-actine kleuring is in de gehele celtypes zowel de in vitro MEJ (witte pijl). Een voorbeeld van elektronenmicroscopie gebruikte om te bestuderen ultrastructuur van de in vitro MEJs zowel in 2D (B) en 3D (C). Schaal bar = 10 µm (A); 2,5 µm (B); en ongeveer 2,5 µm verticale en horizontale 0,5 µm (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De VCCC heeft een aantal voordelen in termen van Recapitulerend MEJs in vitro, maar er zijn punten van discussie bij de vaststelling als de VCCC kan worden gebruikt voor specifieke toepassing. Bijvoorbeeld, als verschillende soorten cellen zijn voor gebruik met dit model, zal het moeten worden geoptimaliseerd. We hebben gebruik gemaakt van primaire menselijke cellen, maar het is mogelijk te isoleren van de cellen van boviene aortas24, of wildtype of knock-out muizen, en gebruik ze in de VCCC1,5,14.
Als de VCCC voor MEJ isolatie gebruikt, is de belangrijkste techniek aan kapitein grondige schrapen van het filter om ervoor te zorgen dat de zuiverheid van de MEJ breuk niet door overtollige endothelial of gladde spier cellen wordt gewijzigd. Wij hebben getoond via het westelijke bevlekken dat alfa hemoglobine de beste teller voor een "zuivere" MEJ isolatie13 is, zoals het sterk in de Fractie MEJ versus de endothelial cel fractie moet worden uitgedrukt. Een ander voorbeeld is de PAI-1, die de vorming van MEJ (Figuur 2)25regelt. Wij vinden dat deze kunnen met name goede markers voor een robuuste MEJ isolatie. Voor extra vertrouwen in de techniek van de oogst, kunnen de filters worden gehouden na het slijmen voor oogst en gekleurd voor EG/SMC markeringen25.
Imaging eiwituitdrukking in de VCCC kan worden uitgevoerd in twee belangrijke manieren: nl gezicht (figuur 1A) of gekanteld (Figuur 3). Beide preparaten toestaan voor de visualisatie van eiwitten in de gaten van het filter vanuit twee verschillende perspectieven. De techniek van nl gezicht impliceert slagaders die lengterichting opengesneden en vervolgens vastgemaakt plat, met de EG naar boven om te visualiseren van zowel de EG enkelgelaagde en de gaten in de IEL, de enige plek waar MEJ kan vormen. Een fluorescent signaal binnen de gaten van de IEL geeft aan localisatie van het eiwit binnen de MEJ10,27. Dit zelfde beginsel kan vertaald worden naar de VCCC door imaging de EG enkelgelaagde van bovenaf, zonder te hoeven insluiten in paraffine of secties maken. De dwarse methode is meer complex te beheersen, maar is kritisch voor verschillende visualisatie van eiwitten in de EG ten opzichte van de SMC monolayers (Figuur 3).
Het ontbreken van stroom of rek in het systeem is een mogelijke beperking, maar het is mogelijk om toe te voegen van stroom in een endotheel-gladde spier cel co cultuur16,19. Het lijkt erop dat statische toestanden nog toestaan voor fysiologisch nauwkeurige eiwit expressie en activering, dus het zijn kan dat de heterocellular contact is de belangrijkste factor in de dissectie van MEJ signalering trajecten.
Er zijn meerdere toepassingen van deze techniek dan weerstand slagader signalering zoals de VCCC niet noodzakelijkerwijs beperkt tot specifieke celtypes is. Andere co cultuur modellen hebben gebruikt uitgroei endotheliale cellen en botcellen17, of de bloed-hersenbarrière met endothelial gemodelleerd en pericyte/Astrocyt culturen samen21. Uitzaaiing van tumorcellen via het endotheel kan ook worden gekwantificeerd aan de hand dit model21. Het is ook mogelijk om te groeien van cellen op het filter en de cultuur een andere cel typt in de onderkant van de schotel 6-well voor het testen van paracrine signalering of groeien endotheliale cellen op het bovenste gedeelte van het membraan te kijken van de polarisatie van de cel (onze niet-gepubliceerde opmerkingen). Leukocyten of andere circulerende cellen kunnen worden toegevoegd aan de media van de EG en de hechting van de cellen kan gekwantificeerde12. Daarnaast is de VCCC inzetbaar te onderzoeken van ziektebeelden zoals gladde spieren migratie24 en verspreiding in reactie op endotheel letsel15,18.
Tot slot hebben wij een methode om te isoleren MEJ van een in vitro celcultuur, die het mogelijk voor het onderzoek maakt van de processen tussen twee gekoppelde celtypes signalering gepresenteerd. Nog belangrijker is, het systeem co cultuur is niet beperkt tot de studie van de MEJ en kan waardevol zijn voor het beantwoorden van een aantal vragen, met name die waarbij de mededeling van de heterocellular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de National Heart, verleent Lung and Blood Institute R01088554, de T32HL007284 en de American Heart Association predoctoraal fellowship 14PRE20420024. Wij bedanken met name de St. Jude cellulaire Imaging gedeeld onderzoek kern, met inbegrip van Randall Wakefield en Linda Horner voor de beelden van elektronenmicroscopie, Adam Straub voor hulp bij representatieve immunofluorescentie beelden en Pooneh Bagher voor haar waardevolle feedback over het manuscript-protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225 cm flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10 mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1x PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
- Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
- Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
- Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix? Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
- Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
- Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
- Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
- Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
- Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
- Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
- Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
- Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
- Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
- Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
- Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123 (2014).
- Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
- Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
- Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
- Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
- Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
- Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
- Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).
