Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

प्रतिरोध धमनियों का एक सेल संस्कृति मॉडल

Published: September 8, 2017 doi: 10.3791/55992
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 3, 1,2
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Hematology, St. Jude Children's Research Hospital, 4Research Histology Core, University of Virginia School of Medicine

Summary

प्रतिरोध धमनियों का एक सेल संस्कृति मॉडल, endothelium, चिकनी मांसपेशी, या endothelium और चिकनी मांसपेशी (myoendothelial जंक्शन) के बीच में संकेत रास्ते के विच्छेदन के लिए अनुमति का वर्णन किया गया है । एगोनिस्ट या प्रोटीन अलगाव, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, या इम्यूनोफ्लोरेसेंस के चयनात्मक आवेदन इस सेल संस्कृति मॉडल का उपयोग कर उपयोग किया जा सकता है ।

Abstract

myoendothelial जंक्शन (MEJ), छोटे व्यास प्रतिरोध धमनियों में एक अनूठा संकेत microdomain, विशिष्ट प्रोटीन और संकेतन प्रक्रियाओं है कि संवहनी टोन और रक्तचाप को नियंत्रित कर सकते हैं की स्थानीयकरण दर्शाती है । के रूप में यह या तो endothelial या चिकनी मांसपेशी सेल से एक प्रक्षेपण है, और इसके छोटे आकार के कारण (औसत पर, एक क्षेत्र के ~ 1 µm2), MEJ अलगाव में अध्ययन करने के लिए मुश्किल है । हालांकि, हम एक सेल संस्कृति मॉडल संवहनी कोशिका सह संस्कृति (VCCC) कहा जाता है कि के लिए अनुमति देता है विकसित किया है इन विट्रो MEJ गठन, endothelial सेल ध्रुवीकरण, और प्रतिरोध के संवहनी दीवार में प्रोटीन और प्रक्रियाओं संकेत के विच्छेदन धमनियों. VCCC आवेदनों की एक भीड़ है और विभिंन प्रकार के सेल सूट अनुकूलित किया जा सकता है । मॉडल दो सेल ०.४ µm pores जिसमें में इन विट्रो MEJs फार्म कर सकते है के साथ एक फिल्टर के विपरीत पक्षों पर हो प्रकार के होते हैं । यहां हम वर्णन कैसे कोशिकाओं और endothelial, MEJ, और चिकनी मांसपेशी भागों, जो तब प्रोटीन अलगाव या गतिविधि की परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की अलगाव की चढ़ाना के द्वारा VCCC बनाने के लिए । बरकरार सेल परतों के साथ फिल्टर, एंबेडेड, और immunofluorescent विश्लेषण के लिए खोदी तय किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, इस मॉडल से खोजों के कई बरकरार प्रतिरोध धमनियों का उपयोग कर पुष्टि की गई है, अपनी शारीरिक प्रासंगिकता रेखांकित ।

Introduction

छोटे व्यास प्रतिरोध धमनियों में, एक पतली आंतरिक लोचदार लेमिना (IEL) endothelial (ईसी) और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (एसएमसी) अलग करती है । कोशिकाओं को इस लोचदार मैट्रिक्स में छेद के माध्यम से परियोजना और गैप जंक्शन चैनल1,2के माध्यम से प्रत्यक्ष cytoplasmic कनेक्शन कर सकते हैं । इस अनूठी संरचना myoendothelial जंक्शन (MEJ) का कार्यकाल है । MEJ एक छोटा है (लगभग ०.५ µm x ०.५ µm, संवहनी बिस्तर पर निर्भर करता है), सेलुलर प्रक्षेपण endothelial कोशिकाओं के मुख्य रूप से बना है, लेकिन चिकनी मांसपेशियों से उत्पंन कर सकते है के रूप में अच्छी तरह से3,4। जांचकर्ताओं के एक नंबर नेटवर्क है कि MEJ में चुनिंदा होते है संकेतन की अपार जटिलता का प्रदर्शन किया है, यह द्वि-endothelium और चिकनी मांसपेशियों के बीच सिग्नलिंग की सुविधा के लिए एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण स्थान प्रतिपादन5 ,6,7,8,9,10.

हालांकि, MEJ में रास्ते संकेत के एक यंत्रवत विच्छेदन एक बरकरार धमनी में मुश्किल है । क्योंकि MEJ एक सेलुलर प्रक्षेपण है, यह वर्तमान में संवहनी दीवार से एक vivo MEJ में अलग करने के लिए संभव नहीं है । इस कारण से, VCCC मॉडल1 विकसित किया गया था । महत्वपूर्ण बात, VCCC शारीरिक endothelial आकृति विज्ञान11 और सेल12के शिखर और MEJ भागों के बीच संकेतन के ध्रुवीकरण प्रतिकृति । यह इस अनूठी मॉडल है कि खोज की सुविधा है कि अल्फा हीमोग्लोबिन endothelial सेल में है, MEJ के लिए ध्रुवीकरण किया गया । यह पारंपरिक प्रसंस्कृत endothelial कोशिकाओं के विपरीत है जो अल्फा हीमोग्लोबिन13एक्सप्रेस नहीं है । microvascular endothelium में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए, यह endothelial कोशिकाओं है कि VCCC में cultureed किया गया है का उपयोग करने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है, विशेष रूप से अगर आशय टुकड़े संकेत रास्ते कि छोटे व्यास प्रतिरोध धमनियों में होने वाली है ।

सह संस्कृति के लिए छोटे व्यास pores (व्यास में ०.४ µm) के साथ एक फिल्टर युक्त एक तगड़ा प्लास्टिक डालने का प्रयोग दो अलग कक्ष प्रकार परतों के बीच पलायन से कोशिकाओं को रोकता है । यह कोशिकाओं के बीच एक 10 µm दूरी में परिणाम है, जो काफी लंबे समय से vivo मेंहै, लेकिन अभी भी vivo में कई MEJs की विशेषताओं, प्रोटीन स्थानीयकरण और दूसरा दूत सहित संकेतन1 प्रतिकृति , 14. इसके अलावा, VCCC एक एगोनिस्ट या विशिष्ट सेलुलर डिब्बे को प्रतिपक्षी के अलावा के माध्यम से सेल प्रकार विशेष संकेतन के लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है । उदाहरण के लिए, BAPTA के साथ चुनाव आयोग लोड-हूं कैल्शियम chelate के लिए, और phenylephrine के साथ एसएमसी उत्तेजक14। सह संस्कृति मॉडल के अंय विवरण के विपरीत15,16,17,18,19,20,21, यह प्रदान करता है mRNA और प्रोटीन फिल्टर के भीतर अलग MEJ अंश सहित के लिए अलग भिन्न पर निर्देश, pores. VCCC करने के लिए इस तकनीक के अलावा mRNA स्थानीयकरण या प्रतिलेखन में परिवर्तन की विशिष्ट जांच के लिए अनुमति देता है22, प्रोटीन फास्फारिलीकरण12,23, और प्रोटीन गतिविधि12। यह लेख नीचे पर फिल्टर और एसएमसी के शीर्ष पर चुनाव आयोग की चढ़ाना का वर्णन है, हालांकि यह संस्कृति के लिए संभव है दो अलग संरचनाओं11,18,24में कोशिका प्रकार ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. VCCC के लिए चढ़ाना कोशिकाओं

  1. संस्कृति बड़ी २२५ cm 2 में बाँझ शर्तों के तहत चुनाव आयोग और एसएमसी की कुप्पी ३७ & #176; C, जब तक 70-90% धाराप्रवाह । यह सुनिश्चित करें कि एसएमसी से अधिक ईसी का उपयोग किया जाए; यदि प्राथमिक मानव चुनाव आयोग और एसएमसी का प्रयोग, आम तौर पर चुनाव आयोग के 3 बड़े कुप्पी एसएमसी की एक बड़ी कुप्पी के लिए ।
    1. कम मार्ग पर प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करें और पिछले पारित 10 का उपयोग नहीं करते । संस्कृति को सह-कल्चरित होने के लिए कक्षों पर आधारित मीडिया चुनें । प्राथमिक मानव कोरोनरी धमनी चुनाव आयोग के लिए, EGM2 एमवी विकास कारकों के साथ इबीएम-2 चुनाव आयोग बेसल मीडिया का उपयोग करें । प्राथमिक मानव कोरोनरी एसएमसी के लिए, SmGM-2 वृद्धि कारकों के साथ SmBM एसएमसी बेसल मीडिया का उपयोग करें । पहले कल्चर्ड कक्षों के साथ उपयोग करने के लिए, मीडिया में वृद्धि कारक जोड़ें ।
  2. निर्माण के VCCC दिन 1: बड़ी (१५० मिमी) स्प्रे पेट्री ( जैसे , Cavicide) और एक कागज तौलिया या एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त पोंछे के साथ दूर पोंछे । फिर ७०% इथेनॉल (ेतोः) के साथ पेट्री व्यंजन स्प्रे और उंहें हुड में सूखी हवा के लिए जगह है ।
  3. फ़िल्टर आवेषण की थाली खुला (सामग्री के तालिका देखें) बाँझ शर्तों के तहत, और कोट एसएमसी पक्ष (फिल्टर के नीचे की ओर) fibronectin समाधान के साथ डालने के । दिए गए 6-वेल प्लेट में डालने को ध्यान में रखते हुए, प्लेट के नीचे की ओर slits के माध्यम से fibronectin सॉल्यूशन को प्लास्टिक, यह सुनिश्चित कर लें कि फिल्टर का निचला हिस्सा (1 मिलीलीटर से ज़्यादा) ढका हुआ है ।
    4. कक्ष संस्कृति हूड में कमरे के तापमान पर fibronectin समाधान के साथ उपचार के 30 मिनट के बाद
  4. , प्लेट के बाहर आवेषण ले, किसी भी अतिरिक्त समाधान निर्वात, और पलटना, स्वच्छ पेट्री डिश के नीचे आधे में रखने. अलग सेट करें । अधिक समाधान सक्शन करते समय फ़िल्टर डालने झिल्ली परेशान करने के लिए सुनिश्चित नहीं है; यह धीरे प्लेट झुका द्वारा बचा जा सकता है, और डालने के किनारे से समाधान vacuuming ।
  5. Trypsinize एक २२५ सेमी 2 पूर्व गर्म 2x Trypsin-EDTA समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ एसएमसी की कुप्पी, और एक बार कोशिकाओं से प्लेट उठा लिया है, 9 मिलीलीटर एसएमसी मीडिया जोड़ने के लिए Trypsin (3:1, मीडिया: Trypsin) बेअसर । एक शंकु ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण, अच्छी तरह से मिश्रण, और प्लास्टिक 10 & #181; L पर एक hemocytometer कक्ष संख्या निर्धारित करने के लिए.
    1. 5 x 5 बक्से ( अर्थात् , 18) में कोशिकाओं की संख्या गिनती, १०,००० द्वारा इस गुणा 1 मिलीलीटर (१८०,०००) में कोशिकाओं की संख्या प्राप्त करने के लिए । फिर 12 मिलीलीटर (सेल निलंबन, २,१६०,००० एसएमसी की कुल मात्रा) से गुणा करें । यह सुनिश्चित करें कि कुओं की वांछित संख्या को प्लेट करने के लिए पर्याप्त एसएमसी हों ।
      नोट: उदाहरण के लिए, 1 अच्छी तरह से ७५,००० एसएमसी होना चाहिए और इस प्रकार 18 कुओं १,३५०,००० कुल एसएमसी होगा । १,३५०,००० कोशिकाओं 1 मिलीलीटर प्रति १८०,००० कोशिकाओं और सेल निलंबन है कि चढ़ाना के लिए आवश्यक हो जाएगा की ७.५ मिलीलीटर में इस परिणाम की जरूरत विभाजित करें । फिर अंतिम मात्रा की आवश्यकता की गणना (18 कुओं x ७५० & #181; L = १३.५ मिलीलीटर). इस प्रकार, सेल निलंबन के ७.५ मिलीलीटर ले लो, पूर्व गर्म एसएमसी मीडिया के साथ १३.५ मिलीलीटर के लिए मात्रा लाने, और अच्छी तरह से मिश्रण ।
  6. प्लेट ७५० & #181; सेल निलंबन के एल प्रत्येक फिल्टर के नीचे की ओर लगभग ७५,००० एसएमसी युक्त, मीडिया और सेल समाधान के किसी भी फैल नहीं करने के लिए सावधान किया जा रहा. शीर्ष पर ढक्कन प्लेस और ध्यान से ३७ & #176 में आवेषण के साथ पेट्री पकवान स्थानांतरण, सी रात भर ।
    नोट: अंय प्रकार के सेल के लिए इष्टतम कोशिका घनत्व empirically निर्धारित किया जा करने की आवश्यकता होगी ।
    7. 2 दिन पर
  7. , साफ 6-ताजा, पूर्व गर्म एसएमसी मीडिया के 2 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से बर्तन भरें । मशीन से प्लेटें हटा दें । एक बार में एक बाहर आवेषण ले लो और चूषण द्वारा मीडिया को हटा दें, तो 6 में जगह एसएमसी मीडिया के साथ अच्छी तरह से पकवान ।
  8. कोट फिल्टर के विपरीत पक्ष (चुनाव आयोग की ओर) के साथ एक ०.५% गोजातीय जिलेटिन समाधान के 1 मिलीलीटर से कम 30 मिनट के लिए ३७ & #176; C.
  9. Trypsinize २२५ cm 2 कुप्पी (एस) ईसी की 3 एमएल के साथ पूर्व गरम 2x Trypsin-EDTA (10x पतला बाँझ Dulbecco & #39 में; एस के पंजाबियों) समाधान, कुप्पी के कोमल दोहन के साथ क्रम में थाली से कोशिकाओं को उठाने के लिए ।
    नोट: यह ३७ & #176 पर मशीन में वापस कुप्पी जगह के लिए आवश्यक हो सकता है, 1-3 मिनट के लिए सी ।
    1. एक बार कोशिकाओं से प्लेट उठा लिया है, trypsin (3:1) बेअसर करने के लिए 9 मिलीलीटर ईसी मीडिया जोड़ें । एक शंकु ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण, एक साथ पूल, अच्छी तरह से मिश्रण, और प्लास्टिक 10 & #181; L पर एक hemocytometer कक्ष संख्या निर्धारित करने के लिए.
      1. 5 x 5 बक्से ( अर्थात् , ६०) में कोशिकाओं की संख्या गिनती, १०,००० द्वारा इस गुणा 1 मिलीलीटर (६००,०००) में कोशिकाओं की संख्या प्राप्त करने के लिए । फिर 12 मिलीलीटर (सेल निलंबन, ७,२००,००० ईसी की कुल मात्रा) से गुणा करें । सुनिश्चित करें कि कुओं की वांछित संख्या को प्लेट करने के लिए पर्याप्त चुनाव आयोग हैं.
        नोट: लगभग ३६०,००० चुनाव आयोग के प्रति अच्छी तरह से आवश्यक हैं । उदाहरण के लिए, 18 कुओं ६,४८०,००० चुनाव आयोग की आवश्यकता है । विभाजन ६,४८०,००० 1 मिलीलीटर प्रति ६००,००० चुनाव आयोग द्वारा की जरूरत है और सेल निलंबन की है कि चढ़ाना के लिए आवश्यक हो जाएगा १०.८ मिलीलीटर में इस परिणाम । फिर अंतिम खंड की आवश्यकता की गणना (18 कुओं x 1 मिलीलीटर = 18 मिलीलीटर) । इस प्रकार, सेल निलंबन के १०.८ मिलीलीटर ले, पहले से गर्म चुनाव आयोग मीडिया के साथ 18 मिलीलीटर की मात्रा लाने के लिए, और धीरे से reसस्पैंड ।
  10. प्लेट ३६०,००० चुनाव आयोग के 1 मिलीलीटर प्रत्येक डालने फिल्टर के शीर्ष पक्ष पर । कोशिकाओं को ३७ पर परेशान न करें... 24 ज के लिए C. 4 दिन पर मध्यम बदलें । 5.
    11. दिन पर हार्वेस्ट
< p class = "jove_title" > 2. VCCC

  1. से संचयन अंश एक 4 & #176 में अलगाव प्रदर्शन, सी कमरे और बर्फ पर सभी उपकरणों रखो ।
  2. ध्यान में रखें अलग किया जा रहा व्यक्तिगत आवेषण की संख्या और एक ५० एमएल ट्यूब लेबल MEJ (अलग फिल्टर के लिए) के लिए lysis बफर जोड़ें । फिर २ १० मिमी व्यंजन लेबल; चुनाव आयोग के लिए एक और एसएमसी के लिए एक.
  3. कैसे केंद्रित lysate की जरूरत है पर निर्भर करता है lysis बफर की मात्रा समायोजित करें; त्यात १५ न्या, ५०० & #181; l के लिए lysis बफर की MEJ ट्यूब और २५० & #181; एल प्रति पेट्री डिश की सिफारिश की है.
  4. एक समय में आवेषण के एक 6 अच्छी तरह से प्लेट के साथ काम करते हैं । सेल संस्कृति हूड में मध्यम चूषण और फिर बर्फ पर एक ठंडे कमरे में परिवहन.
    नोट: निम्न निर्देश 1 सम्मिलित आइसोलेशन के लिए हैं.
  5. प्लास्टिक 10 & #181; 1x के एसएमसी पक्ष पर insert.
    6. के एल
  6. को संमिलित करने के एक छोर पर कक्षों को स्क्रैप करने के लिए कक्ष भारोत्तोलक का उपयोग करें, और उस में lysis बफ़र है जो एसएमसी पेट्री डिश के लिए लिफ्टर से कोशिकाओं को स्थानांतरित ।
  7. एक बार सेल लिफ्टर पकवान में lysis बफर को छुआ है, यह डालने फिल्टर को छूने के लिए जब तक यह पूरी तरह से पोंछा गया है और कागज तौलिए पर बंद सूख अनुमति नहीं है । एसएमसी फिल्टर के परिमार्जन को दोहराते हुए शेष एसएमसी सेल मलबे को पूरी तरह से निकालने के लिए कम से एक दो बार करें ।
  8. डालने की बारी पर और प्लास्टिक 10 & #181;/संमिलित करें फ़िल्टर के ऊपरी/ईसी साइड में 1x पंजाबियों के एल । दोहराएं चरण २.६ और २.७ एक सेल खुरचनी और चुनाव आयोग पेट्री डिश के साथ ।
  9. एक पिपेट और lysis बफर के साथ चुनाव आयोग पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण के साथ फिल्टर के चुनाव आयोग की ओर से शेष सेल और पंजाबियों घोल इकट्ठा । MEJ अंश में ंयूनतम चुनाव आयोग/एसएमसी संदूषण छोड़ने के रूप में फिल्टर के दोनों किनारों से दूर कोशिकाओं परिमार्जन में बहुत गहन बनो ।
  10. ध्यान से प्लास्टिक डालने से फिल्टर को काटने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें । यह की 70-80% से दूर प्लास्टिक से और संदंश का उपयोग करने के लिए पूरी तरह से प्लास्टिक डालने संरचना बंद फिल्टर खींचने के द्वारा यह मत करो । ५० एमएल शंकु ट्यूब में फिल्टर रखो lysis बफर के साथ MEJ लेबल, और यह सुनिश्चित lysis बफर में बैठता है और गीला रहता है ।
  11. के सभी सम्मिलित करता है संसाधित किया गया है, जब तक कि 6 के समूह में, आइसोलेशन चरणों को दोहराएँ ।
  12. सुनिश्चित करें कि विभिंन उपचार समूहों अलग ट्यूबों और व्यंजन में रखा जाता है ।
  13. भंवर 15 एस के लिए पूरी ताकत पर ५० मिलीलीटर MEJ शंकु ट्यूब या मिश्रित अच्छी तरह से जब तक । संदंश के साथ MEJ शंकु से फिल्टर निकालें, उंहें ट्यूब के पक्ष दीवारों के साथ खींच के रूप में प्रोटीन की अधिकतम राशि और ट्यूब में तरल छोड़ने के लिए । इस बिंदु के बाद, फ़िल्टर छोड़ें ।
  14. एक बार सभी फिल्टर MEJ शंकु ट्यूब से हटा दिया गया है, एक त्वरित स्पिन (अधिकतम गति पर 10-15 एस ~ १६,००० एक्स जी) एक केंद्रापसारक में सभी तरल और ट्यूब के नीचे करने के लिए प्रोटीन खींचने के लिए । अलग, छोटे केंद्रापसारक ट्यूबों में MEJ ट्यूब और चुनाव आयोग और एसएमसी पेट्री व्यंजन की सामग्री स्थानांतरण ।
  15. वैकल्पिक: Sonicate की सामग्री पर MEJ/एसएमसी/EC ट्यूबों 4 की स्थापना पर ३ १० s दालों के लिए बर्फ पर या धीरे से हाथ से homogenize.
    16. अधिकतम गति पर
  16. केंद्रापसारक (~ १६,००० x g) 15 मिनट में 4 & #176; C. प्लास्टिक बाहर supernatant और परख प्रोटीन सामग्री के लिए lysate bicinchoninic परख विधि का उपयोग कर ।
< p class = "jove_title" > 3. कटाई के लिए VCCC En Face इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. VCCC के दिन 5 पर, मशीन से आवेषण निकालें । सेल कल्चर हुड में काम करना, सम्मिलित फिल्टर के निचले कुओं में से प्रत्येक से एसएमसी मीडिया बंद चूषण और 1x पंजाबियों के साथ दो बार कुल्ला । चुनाव आयोग की ओर से दोहराएं ।
  2. को बरकरार रखते हुए और प्लेट में, 10-20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) को एक वॉक-इन 4 & #176 में डालें, एक सौम्य शेखर पर सी रूम. 5 मिनट के लिए 1x पंजाबियों के साथ डालने के फिल्टर के दोनों पक्षों को धोने और दो बार दोहराएं ।
    चेतावनी: पीएफए विषाक्त है और ध्यान से संभाला जाना चाहिए ।
  3. प्लेट में ब्लॉकिंग, प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी की गर्मी को पूरा करना, यह सुनिश्चित करना कि फिल्टर के दोनों किनारों को एंटीबॉडी + ब्लॉकिंग सॉल्यूशन में रखा गया है (9 एमएल पंजाब, 25 & #181; l ट्राइटन X100, ५० मिलीग्राम गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन, ५०० & #181; l सामान्य सीरम)
  4. एक स्लाइड पर फिल्टर माउंट करने के लिए, एक स्केलपेल के साथ प्लास्टिक डालने के बाहर फिल्टर कट एक संभाल और बढ़ते माध्यम के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड पर जगह पर घुड़सवार.
< p class = "jove_title" > 4. अनुप्रस्थ इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. के लिए VCCC संचयन VCCC गर्मी के दिन 5 पर, मशीन से आवेषण हटा दें । सेल संस्कृति हूड में डालने फिल्टर के दोनों पक्षों से मीडिया को सक्शन और फिल्टर के प्रत्येक पक्ष को दो बार 1x पंजाबियों के साथ कुल्ला ।
  2. रखते हुए बरकरार रखे और 6 वेल प्लेट में, 4% पीएफए और एक वॉक में रात भर की गर्मी में डाल-4 & #176; सी कोमल शेखर पर एक कमरा.
    चेतावनी: पीएफए विषाक्त है और ध्यान से संभाला जाना चाहिए ।
< p class = "jove_title" > 5. अनुप्रस्थ के लिए VCCC एम्बेड करना इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. फ़िल्टर सम्मिलित करता है के बाद लगभग 24 घंटे में 4% पीएफए, करने के लिए ७०% ेतोः के लिए स्थानांतरण करने के लिए निर्धारित किया गया है, लेकिन कई सप्ताह तक.
  2. एक लंबे (रातोंरात) पर फिल्टर एक स्वचालित ऊतक प्रोसेसर पर चलने की प्रक्रिया । इस प्रकार के कार्यक्रम का प्रयोग करें: ७०% ेतोः 30 मिनट के लिए, ८५% ेतोः 30 मिनट, ९५% ेतोः 30 मिनट, १००% ेतोः 30 मिनट, १००% ेतोः ४५ मिनट, १००% ेतोः ४५ मिनट, Xylene 30 मिनट, Xylene 30 मिनट, Xylene ४५ मिनट, ६० & #176; c आयल 30 मिनट, ६० & #176; ग आयल 30 मिनट , ६० & #176; ग आयल ४५ min.
  3. प्रसंस्करण के बाद, तरल तेल में एंबेडिंग स्टेशन के लिए काटा फिल्टर हस्तांतरण, कैसेट में फिल्टर रखते हुए ।
  4. कैसेट से फिल्टर निकालें, ध्यान से संदंश का उपयोग करने के लिए यह सिर्फ किनारे पर पकड़ । कैंची के साथ, आधे में फिल्टर कट, दो अर्द्ध परिपत्र आकार आधा बनाने. एंबेडिंग स्टेशन के कोल्ड प्लेट भाग पर 2 हिस्सों में से प्रत्येक करना बस लंबे समय के लिए तरल तेल के साथ embedding मोल्ड भरने के लिए पर्याप्त है ।
  5. एक बार तरल तेल से भर गया, बहुत संक्षेप में ठंडा थाली embedding मोल्ड को छूने, तो एंबेडिंग मोल्ड में फिल्टर के प्रत्येक आधे एंबेड (नीचे की ओर कट); यह सुनिश्चित करता है कि अनुभाग के दौरान, एक धार की ओर फिल्टर के केंद्र से काटने होगा .
  6. एंबेडिंग के दौरान, संदंश का उपयोग करने के लिए जगह में फिल्टर पकड़ एक दूसरे में गिरने से रोकने के लिए जब तक तेल काफी शांत के लिए उंहें अकेले खड़े है । एंबेडिंग मोल्ड एक ठंडी थाली में ले जाएं जब तक पूरी तरह से जम ।
    नोट: आइस ट्रे पर ठंडा ब्लॉक झुर्रियों वर्गों को रोकने में मदद करता है ।
< p class = "jove_title" > 6. धारा और अनुप्रस्थ के लिए VCCC धुंधला इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. के लिए आयल ब्लॉक्स खोदी और स्लाइड बढ़ते हुए: कट 5 & #181; एम सेक्शन, सेक्शन को एक ४२ & #176 में रखें; सी जल स्नान, और सकारात्मक शुल्क का उपयोग कर वर्गों उठाओ स्लाइड्स. फिर एक ४२ & #176 में रात भर स्लाइड रखें; सी ओवन को ड्राय.
  2. से पहले निर्जलीकरण कदम, ६० पर स्लाइड सेंकना & #176; ग आयल पिघलने के लिए और स्लाइड करने के लिए VCCC अनुभागों का पालन करने में मदद । शांत संक्षेप में, तो xylene, १००% ेतोः, ९५% ेतोः, ७०% ेतोः के एक परिवर्तन, और आसुत जल के दो परिवर्तन के दो परिवर्तन के माध्यम से स्लाइड हाइड्रेट ।
  3. से बचने antigen पुनर्प्राप्ति विधियां शामिल microwaving या हीटिंग के रूप में खंड स्लाइड से गिर सकता है ।
  4. कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए मानक अवरुद्ध प्रदर्शन, तो 4 & #176 पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर मशीन, सी, धोने चरणों और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए 1 घंटे में कमरे के तापमान पर पीछा किया । बढ़ते मीडिया और coverslip.
    5. के साथ माउंट

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

VCCC के लिए इस्तेमाल किया फिल्टर आवेषण छोटे, ०.४ µm छेद है । चित्र 1a, VCCC फ़िल्टर इनसेट के एक एन चेहरा देखें, pores जिसमें MEJ इन विट्रो मेंफार्म कर सकते है दिखाता है । योजनाबद्ध endothelial कोशिकाओं को विपरीत दिशा में चढ़ाया जाता है (चित्र 1b) से पहले एक दिन फिल्टर के निचले हिस्से पर चढ़ाया चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं को दर्शाया गया है । एक बार कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है, चुनाव आयोग, MEJ, और एसएमसी अंश तीन दिन बाद अलग किया जा सकता है । इसका एक उदाहरण चित्र 2aमें दिखाया गया है, जहां plasminogen उत्प्रेरक अवरोधक 1 (पै-1) उच्च चुनाव आयोग के सापेक्ष MEJ अंश में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है, जिसे vivo MEJs25 में भी देखा जाता है । इन आंकड़ों को बरकरार arteriolar रक्त वाहिका दीवार recapitulating में VCCC की उपयोगिता का प्रदर्शन ।

अगला इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में VCCC का प्रदर्शन किया है । VCCC बरकरार है और अनुप्रस्थ इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए पीएफए के साथ तय छोड़ दिया है । चित्रा 3 ए चिकनी मांसपेशी विशिष्ट अल्फा-1 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर और endothelial विशिष्ट bradykinin रिसेप्टर से पता चलता है. एफ के Phalloidin धुंधला-actin दो कोशिकाओं है, जो एक बरकरार धमनी में देखा अभिव्यक्ति की प्रतिकृति के बीच में MEJ (सफेद तीर) में actin पुलों से पता चलता है26। चित्रा 3 बीमें, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा के रूप में VCCC के एक पार अनुभाग का प्रदर्शन किया है, जो 3 डी में चित्रा३ में गाया जाता है. VCCC के ये दृश्य विशेष रूप से करने के लिए प्रोटीन, रिसेप्टर्स, और ultrastructure स्थानीयकृत करने की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए इन विट्रो MEJs में .

Figure 1
चित्रा 1: संवहनी कोशिका सह संस्कृति (VCCC) के चढ़ाना. (क) एन चेहरा प्रकाश micrograph डालने के फिल्टर में pores । काले तीर व्यक्तिगत छेद निरूपित । (ख) VCCC को चढ़ाना की योजनाबद्ध । दिन 1 फिल्टर डालने और नीचे पर चढ़ाना एसएमसी के उलटा से पता चलता है । 2 दिन पर, चुनाव आयोग फिल्टर के विपरीत पक्ष पर चढ़ाया जाता है और VCCC इस अनुरूप में एक 6 अच्छी तरह से फसल तक प्लेट में रहता है । सफेद तीर फ़िल्टर की ओर संकेत करते हैं जहां कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है और बढ़ेगा । स्केल बार = 1 mm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: MEJ में प्रोटीन संवर्धन । (क) bliss-संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि माउस धमनी की अभिव्यक्ति के साथ MEJ पर अल्फा ग्लोबिन (सोने के मोती जो काले डॉट्स के रूप में दिखाई देते हैं). (ख) पश्चिमी plasminogen उत्प्रेरक अवरोधक दिखा रहा है 1 (पै-1) अभिव्यक्ति चुनाव आयोग या एसएमसी अंशों बनाम MEJ अंश में समृद्ध है । प्लास्टिक चुनाव आयोग का संकेत एक प्लास्टिक की डिश है, जो MEJ फार्म नहीं पर हो चुनाव आयोग । स्केल बार = 1 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: VCCC के अनुप्रस्थ वर्गों में अनुप्रस्थ इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी. (क) चिकनी मांसपेशी और endothelial विशिष्ट प्रोटीन के लिए दाग । F-actin धुंधला होना दोनों सेल प्रकारों और इन विट्रो MEJ (सफ़ेद तीर) के दौरान होता है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का एक उदाहरण इन विट्रो MEJs दोनों में 2d (B) और 3d (C) के ultrastructure का अध्ययन करते थे. स्केल बार = 10 µm (A); २.५ µm (ख); और लगभग २.५ µm ऊर्ध्वाधर और ०.५ µm क्षैतिज (ग) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

VCCC इन विट्रो मेंrecapitulating MEJs के मामले में लाभ की एक संख्या है, लेकिन अगर VCCC विशिष्ट आवेदन के लिए उपयोग किया जा सकता है निर्धारित जब चर्चा के अंक हैं. उदाहरण के लिए, यदि इस मॉडल के साथ भिंन कक्ष प्रकारों का उपयोग किया जाना है, तो इसे ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता होगी । हम प्राथमिक मानव कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है, लेकिन यह गोजातीय aortas24, या wildtype या नॉकआउट चूहों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए संभव है, और VCCC1,5,14में उन्हें इस्तेमाल करते हैं ।

MEJ अलगाव के लिए VCCC का उपयोग करते हैं, तो मास्टर करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण तकनीक MEJ अंश की शुद्धता अतिरिक्त endothelial या चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं द्वारा बदल नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए फिल्टर का पूरी तरह से scraping है । हम पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से पता चला है कि अल्फा हीमोग्लोबिन एक "शुद्ध" MEJ अलगाव13का सबसे अच्छा मार्कर है, के रूप में यह दृढ़ता से endothelial कोशिका अंश बनाम MEJ अंश में व्यक्त किया जाना चाहिए. एक और पै-1 है, जो MEJ (चित्रा 2)25के गठन को नियंत्रित करता है । हमें लगता है कि ये एक मजबूत MEJ अलगाव के लिए विशेष रूप से अच्छा मार्कर हो सकता है । फसल तकनीक में अतिरिक्त विश्वास के लिए, फिल्टर फसल के लिए स्क्रैप के बाद रखा जा सकता है, और चुनाव आयोग/एसएमसी मार्करों के लिए25दाग ।

VCCC में इमेजिंग प्रोटीन अभिव्यक्ति दो मुख्य तरीकों से किया जा सकता है: en face (figure) या अनुप्रस्थ (figure 3). दोनों तैयारी दो अलग दृष्टिकोण से फिल्टर के छेद के भीतर प्रोटीन के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं । en चेहरा तकनीक धमनियों कि खुले longitudinally में कटौती कर रहे है और फिर फ्लैट बाहर टिकी हुई है, ऊपर का सामना चुनाव आयोग के साथ, दोनों चुनाव आयोग monolayer और IEL में छेद कल्पना, ही जगह है जहां MEJ फार्म कर सकते हैं । IEL के छेद के भीतर एक फ्लोरोसेंट संकेत MEJ10,27के भीतर प्रोटीन के स्थानीयकरण इंगित करता है । यह एक ही सिद्धांत इमेजिंग द्वारा VCCC के लिए अनुवाद किया जा सकता ऊपर से चुनाव आयोग monolayer, यह तेल में एंबेड या वर्गों बनाने की जरूरत के बिना । अनुप्रस्थ विधि मास्टर करने के लिए अधिक जटिल है, लेकिन चुनाव आयोग में प्रोटीन की अलग दृश्य के लिए महत्वपूर्ण है एसएमसी monolayers बनाम (चित्रा 3).

प्रवाह या प्रणाली में खिंचाव की कमी एक संभावित सीमा है, लेकिन यह एक endothelial-चिकनी मांसपेशी सेल सह संस्कृति16,19में प्रवाह जोड़ने के लिए संभव है । ऐसा लगता है कि स्थिर शर्तों अभी भी शारीरिक रूप से सटीक प्रोटीन अभिव्यक्ति और सक्रियण के लिए अनुमति देते हैं, तो यह हो सकता है कि heterocellular संपर्क MEJ संकेत रास्ते के विच्छेदन में सबसे महत्वपूर्ण कारक है ।

वहां VCCC के रूप में जरूरी विशिष्ट कोशिका प्रकार तक ही सीमित नहीं है प्रतिरोध धमनी संकेत से परे इस तकनीक के कई आवेदन कर रहे हैं । अंय सह संस्कृति मॉडल endothelial कोशिकाओं और osteoblasts17, या endothelial और pericyte/astrocyte सह संस्कृतियों21के साथ रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडलिंग का उपयोग किया है । endothelium के माध्यम से ट्यूमर कोशिकाओं के मेटास्टेसिस भी इस मॉडल का उपयोग कर मात्रा जा सकते हैं21. यह भी फिल्टर और संस्कृति 6-अच्छी डिश के तल में एक और कोशिका प्रकार paracrine संकेतन परीक्षण करने के लिए, या झिल्ली के ऊपरी हिस्से पर endothelial कोशिकाओं को विकसित करने के लिए सेल के ध्रुवीकरण पर देखने के लिए कोशिकाओं को विकसित करने के लिए संभव है (हमारे अप्रकाशित टिप्पणियों) । ल्यूकोसाइट्स या अन्य परिचालित कोशिकाओं को चुनाव आयोग मीडिया में जोड़ा जा सकता है और कोशिकाओं के आसंजन12मात्रा जा सकता है । इसके अलावा, VCCC चिकनी मांसपेशी माइग्रेशन24 और endothelial चोट के जवाब में प्रसार15,18के रूप में विकृतियों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

अंत में, हम एक विधि के लिए एक इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणाली है, जो दो युग्मित सेल प्रकार के बीच संकेत प्रक्रियाओं की जांच के लिए अनुमति देता है से MEJ को अलग करने के लिए प्रस्तुत किया है । महत्वपूर्ण बात, सह संस्कृति प्रणाली MEJ के अध्ययन तक ही सीमित नहीं है और सवाल का एक संख्या का जवाब मूल्यवान हो सकता है, विशेष रूप से heterocellular संचार शामिल उन ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान अनुदान R01088554, T32HL007284 और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन डॉक्टरेट फैलोशिप 14PRE20420024 द्वारा समर्थित किया गया था । हम विशेष रूप से सेंट झड सेलुलर इमेजिंग साझा अनुसंधान कोर का धंयवाद, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों के लिए रान्डेल वेकफील्ड और लिंडा Horner सहित, एडम Straub प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियों के साथ सहायता के लिए, और उसके लिए Pooneh बाग पांडुलिपि प्रोटोकॉल पर बहुमूल्य प्रतिक्रिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert Corning 3450 This is one 6 well plate of inserts
225 cm flask Corning 431082
6 well plates (without filter inserts) Corning 3506
Primary human coronary artery endothelial cells Lonza CC-2585
Primary human coronary artery smooth muscle cells Lonza CC-2583
EBM-2 EC Basal media Lonza CC-3156
EC growth factors (EGM2 MV Single quots) Lonza CC-4147 Add to basal media before use
SmBM SMC basal media Lonza CC-3181
SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) Lonza CC-4149 Add to basal media before use
0.5% Trypsin-EDTA 10X Gibco 15400-054 Dilute to 2X with sterile dPBS
Hemocytometer VWR 15170-208
large petri dishes for SMC Plating (150mm) Corning 353025
Bovine gelatin Sigma G-9382
Human fibronectin Corning 356008 5µg/ml of fibronectin and store at -20
10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) Gibco 14065-056 Dilute to 1x with sterile water
10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) Gibco 14200-075 Dilute to 1x with sterile water
Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle Amazon MDS15210
Forceps Fisher 17-467-201
Cell lifter Corning 3008
Cell scraper BD Falcon 353085
50 mL conical tube Corning 352070
10 mm petri dishes Falcon 35-1008
Rneasy mini kit Qiagen 74104
RNA lysis reagent Qiagen 79306
Paraformaldehyde Sigma 158127 Make 4% solution with dPBS
70% ethanol Fisher 04-355-305
Cavicide disinfectant Fisher 131000
RIPA protein lysis buffer Sigma R0278
Sonic dismembranator Fisher Model 50
1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry Gibco 10010023 does not need to be sterile
Name Company Catalog Number Comments
Embedding/Sectioning/Staining
Paraffin Fisher P31-500
Automated tissue processer Excelsior ES
Embedding station + cold plate Leica HistoCore Arcadia
Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade VWR 25608-961 or 25608-964
Microscope slides Thermo Fisher 22-230-900
Coverslips Thermo Fisher 12-548-5E
Prolong Gold mounting medium Thermo Fisher P36931
Name Company Catalog Number Comments
Other Solutions **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells
Sterile dPBS Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter).
Final concentration: 1X
sterile HBSS Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter).
Final concentration: 1X
Fibronectin stock solution Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed
Final concentration: 100µg/mL
Fibronectin to coat SMC side of VCCC thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL.
Final concentration: 5µg/mL
2x Trypsin EDTA solution Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) .
Final concentration: 2X
Blocking/antibody solution (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum)
Bovine gelatin to coat EC VCCC Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions.
Final concentration: 0.50%
1x PBS for harvesting cells does not need to be sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
  2. Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
  3. Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix? Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
  4. Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
  5. Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
  6. Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
  7. Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
  8. Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
  9. Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
  10. Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
  11. Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
  12. Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
  13. Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
  14. Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
  15. Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
  16. Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
  17. Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123 (2014).
  18. Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
  19. Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
  20. van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
  21. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  22. Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
  23. Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
  24. Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
  25. Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
  26. Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
  27. Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).

Tags

चिकित्सा अंक १२७ Endothelial सेल चिकना स्नायु सेल heterocellular संचार सेल ध्रुवीकरण गैप जंक्शनों सेलुलर अनुमानों extracellular मैट्रिक्स सह संस्कृति
प्रतिरोध धमनियों का एक सेल संस्कृति मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biwer, L. A., Lechauve, C.,… More

Biwer, L. A., Lechauve, C., Vanhoose, S., Weiss, M. J., Isakson, B. E. A Cell Culture Model of Resistance Arteries . J. Vis. Exp. (127), e55992, doi:10.3791/55992 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter