Summary
È descritto un modello di coltura cellulare di arterie di resistenza, permettendo per la dissezione delle vie nell'endotelio, muscolo liscio, o tra endotelio e muscolo liscio (bivio myoendothelial) di segnalazione. L'applicazione selettiva di agonisti o isolamento della proteina, microscopia elettronica o immunofluorescenza può essere utilizzata usando questo modello della coltura cellulare.
Abstract
La giunzione di myoendothelial (MEJ), un unico microdomain segnalazione nelle arterie della resistenza di piccolo diametro, esibisce localizzazione di proteine specifiche e processi di segnalazione che possono controllare il tono vascolare e della pressione sanguigna. Come è una proiezione da entrambi la cellula endoteliale o del muscolo liscio e a causa della sua piccola dimensione (in media, un'area di ~ 1 µm2), il MEJ è difficile da studiare in isolamento. Tuttavia, abbiamo sviluppato un modello di coltura cellulare chiamato vascolare delle cellule co-cultura (VCCC) che consente di in vitro MEJ formazione, polarizzazione delle cellule endoteliali e la dissezione dei processi nella parete vascolare di resistenza e proteine di segnalazione arterie. Il VCCC ha una moltitudine di applicazioni e può essere adattata a diversi tipi di cellule. Il modello è costituito da due tipi di cellule coltivati su lati opposti di un filtro con 0,4 µm pori in cui lo in vitro MEJs può formare. Qui descriviamo come creare il VCCC tramite placcatura delle cellule e l'isolamento di endoteliale, MEJ e frazioni di muscolo liscio, che quindi possono essere utilizzate per l'isolamento di proteine o attività saggi. Può essere fissato il filtro con strati di cellule intatte, embedded e sezionati per analisi immunofluorescente. Soprattutto, molte delle scoperte da questo modello sono stati confermati tramite arterie della resistenza intatto, sottolineando la rilevanza fisiologica.
Introduction
Nelle arterie della resistenza di piccolo diametro, una sottile lamina elastica interna (IEL) separa endoteliali (EC) e cellule muscolari lisce (SMC). Le cellule possono progetto attraverso i fori in questa matrice elastica e connessioni dirette citoplasmatico attraverso gap junction canali1,2. Questa struttura unica è definita il bivio di myoendothelial (MEJ). Il MEJ è un piccolo (circa 0,5 µm x 0,5 µm, a seconda della base vascolare), proiezione cellulare composto principalmente di cellule endoteliali ma può provenire dal muscolo liscio anche3,4. Un numero di investigatori hanno dimostrato l'immensa complessità di reti che si verificano in modo selettivo a MEJ, rendendolo un luogo particolarmente importante per facilitare la segnalazione di bi-direzionale tra endotelio e muscolo liscio5 di segnalazione ,6,7,8,9,10.
Tuttavia, una dissezione meccanicistica di vie di segnalazione presso il MEJ è difficile in un'arteria intatta. Perché il MEJ è una proiezione cellulare, non è attualmente possibile isolare un in vivo MEJ da parete vascolare. Per questo motivo, è stato sviluppato il modello VCCC1 . D'importanza, il VCCC replica fisiologica morfologia endoteliale11 e polarizzazione di segnalazione tra l'apicale e MEJ porzioni della cella12. Era questo modello unico che hanno facilitato la scoperta che l'emoglobina alfa è in cellule endoteliali, polarizzata per il MEJ. Questo è in contrasto con le cellule endoteliali convenzionalmente coltivate che non esprimono emoglobina alfa13. Per i ricercatori interessati a endotelio microvascolare, può essere più opportuno utilizzare le cellule endoteliali che sono state coltivate in VCCC, particolarmente se l'intento è quello di sezionare le vie di segnalazione che si verificano nelle arterie della resistenza di piccolo diametro.
Usando un robusto inserto in plastica contenente un filtro con pori di diametro piccolo (0,4 µm di diametro) per tipi distinti delle cellule co-coltura due impedisce che le cellule migrano tra strati. Il risultato è una distanza di 10 µm tra le cellule, che è significativamente più lungo di in vivo, ma ancora molte delle caratteristiche in vivo di MEJs, tra cui la localizzazione della proteina e secondo messaggero segnalazione1 replica , 14. Inoltre, la VCCC consente per il targeting di cella specifica del tipo di segnalazione tramite l'aggiunta di un agonista o antagonista al compartimento cellulare specifico. Ad esempio, caricando la CE con BAPTA-AM di chelato del calcio e stimolando la SMC con fenilefrina14. A differenza di altre descrizioni di co-coltura modelli15,16,17,18,19,20,21, questo fornisce istruzioni su come isolare le frazioni distinte per mRNA e proteine, tra cui la frazione MEJ distinta all'interno dei pori del filtro. L'aggiunta di questa tecnica per il VCCC permette per indagine specifica dei cambiamenti nella localizzazione di mRNA o trascrizione22, fosforilazione della proteina12,23e proteina attività12. Questo articolo descriverà placcatura della CE in cima al filtro e SMC sul fondo, anche se è possibile alla cultura due tipi cellulari differenti conformazioni11,18,24.
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Protocol
1. placcatura di cellule per la VCCC
- cultura grande 225 cm 2 fiaschi di CE e SMC a 37 ° C, fino al 70-90% confluenti in condizioni di sterilità. Garantire che vengano utilizzati più EC rispetto SMC; Se si utilizza CE umano primario e SMC, in genere 3 boccette grande della CE alla grande 1 boccetta di SMC.
- Utilizzare cellule primarie a passaggi più bassi e non utilizzare oltre passaggio 10. Scegliere i mezzi di coltura basato su cellule per essere co-coltivate. Per primaria coronarica umana CE, è necessario utilizzare supporti basali di EBM-2 CE con fattori di crescita EGM2 MV. Per SMC coronarica umana primaria, è necessario utilizzare SmBM SMC media basale con fattori di crescita SmGM-2. Prima dell'uso con cellule coltivate, aggiungere fattori di crescita ai media.
- Costruzione del VCCC giorno 1: Spray Petri di grandi dimensioni (150 mm) e coperchi con un disinfettante (ad es., Cavicide) e asciugare con un tovagliolo di carta o salviette privo di lanugine. Quindi spruzzare le capsule di Petri con 70% di etanolo (EtOH) e metterli nella cappa di aria secca.
- Aprire la piastra di inserti filtro (Vedi la Tabella materiali) in condizioni sterili e rivestire il lato SMC (lato inferiore del filtro) dell'inserto con soluzione di fibronectina. Tenendo l'inserto la piastra 6-ben fornita, dispensare la soluzione di fibronectina attraverso il lato fessure sul fondo della piastra, assicurandosi che la metà inferiore del filtro è coperto (non più di 1 mL).
- Dopo 30 min di trattamento con soluzione di fibronectina a temperatura ambiente nella cappa cultura cellulare, prendere inserti dalla piastra, vuoto qualsiasi soluzione in eccesso e Inverti, immissione nella parte inferiore la metà del piatto Petri pulita. Mettere da parte. Essere sicuri di non disturbare la membrana di inserto filtro quando l'aspirazione di soluzione in eccesso; Questo può essere evitato delicatamente inclinando la piastra, e aspirare la soluzione fuori dal bordo dell'inserto.
- Trypsinize un 225 cm 2 boccetta di SMC con 3 mL di soluzione di tripsina-EDTA X 2 pre-riscaldato, e una volta che le cellule hanno tolto la piastra, aggiungere 9 mL SMC media per neutralizzare la tripsina (3:1, media: tripsina). Trasferire in una provetta conica, mescolare bene e dispensare 10 µ l in un emocitometro per determinare il numero di cell.
- Il numero di cellule in 5x5 caselle (cioè, 18), moltiplicare questo valore per 10.000 per ottenere il numero di cellule in 1 mL (180.000). Quindi moltiplicare per 12 mL (volume totale della sospensione di cellule, SMC 2,16 milioni). Assicurarsi che ci siano abbastanza SMC a piastre il numero desiderato di pozzetti.
Nota: ad esempio, 1, Beh, dovrebbe avere 75.000 SMC e così 18 pozzetti avrebbe totale 1,35 milioni di SMC. Dividere le celle 1,35 milioni necessari da 180.000 cellule per 1 mL e questo si traduce in 7,5 mL della sospensione delle cellule che sarà necessarie per la placcatura. Quindi calcolare il volume finale necessario (18 pozzetti x 750 µ l = 13,5 mL). Così, prendere 7,5 mL di sospensione cellulare, portare il volume fino a 13,5 mL con SMC media pre-riscaldato e mescolare bene.
- Il numero di cellule in 5x5 caselle (cioè, 18), moltiplicare questo valore per 10.000 per ottenere il numero di cellule in 1 mL (180.000). Quindi moltiplicare per 12 mL (volume totale della sospensione di cellule, SMC 2,16 milioni). Assicurarsi che ci siano abbastanza SMC a piastre il numero desiderato di pozzetti.
- Piastra 750 µ l della sospensione delle cellule contenenti circa 75.000 SMC sulla parte inferiore di ogni filtro, facendo attenzione a non versare la soluzione media e cella. Mettere il coperchio sulla parte superiore e trasferire con cautela la capsula di Petri con gli inserti in incubatore a 37 ° C durante la notte.
Nota: La densità di cella ottimale per altri tipi di cellule dovrà essere determinata empiricamente. - Il giorno 2, riempire piatti puliti 6-pozzetti con 2 mL di fresco, pre-riscaldato SMC media. Rimuovere le piastre dall'incubatrice. Prendere gli inserti fuori uno alla volta e rimuovere il supporto di aspirazione, quindi porre nel piatto 6-pozzetti con SMC media.
- Cappotto il lato opposto del filtro (lato CE) con 1 mL di una soluzione di gelatina bovina di 0,5% per almeno 30 min a 37 ° C.
- Tripsinizzano la flask(s) di 2 cm 225 della CE con 3 mL di pre-riscaldato 2 X tripsina-EDTA (10x diluita in Dulbecco sterile ' s PBS) soluzione, con picchiettando il pallone per sollevare le cellule fuori la piastra di.
Nota: Potrebbe essere necessario inserire nuovamente il pallone dell'incubatore a 37 ° C per 1-3 min.- Una volta le cellule hanno tolto la piastra, aggiungere 9 mL CE media per neutralizzare la tripsina (3:1). Trasferire in una provetta conica, piscina insieme, mescolare bene e dispensare 10 µ l in un emocitometro per determinare il numero di cellulare.
- Il numero di cellule in 5x5 caselle (cioè, 60), moltiplicare questo valore per 10.000 per ottenere il numero di cellule in 1 mL (600.000). Quindi moltiplicare per 12 mL (volume totale della sospensione cellulare, CE 7,2 milioni). Assicurarsi che ci siano abbastanza CE a piastre il numero desiderato di pozzetti.
Nota: Circa 360.000 CE sono necessari per pozzetto. Ad esempio, 18 pozzetti richiedono 6,48 milioni EC. Dividere le celle 6,48 milioni necessari da 600.000 CE / 1 mL e questo si traduce in 10,8 mL della sospensione delle cellule che sarà necessarie per la placcatura. Quindi calcolare il volume finale necessario (18 pozzetti x 18 mL = 1 mL). Così, prendere 10,8 mL di sospensione cellulare, portare il volume fino a 18 mL con pre-riscaldati media CE e Risospendere delicatamente.
- Il numero di cellule in 5x5 caselle (cioè, 60), moltiplicare questo valore per 10.000 per ottenere il numero di cellule in 1 mL (600.000). Quindi moltiplicare per 12 mL (volume totale della sospensione cellulare, CE 7,2 milioni). Assicurarsi che ci siano abbastanza CE a piastre il numero desiderato di pozzetti.
- Una volta le cellule hanno tolto la piastra, aggiungere 9 mL CE media per neutralizzare la tripsina (3:1). Trasferire in una provetta conica, piscina insieme, mescolare bene e dispensare 10 µ l in un emocitometro per determinare il numero di cellulare.
- Piastra 1 mL di 360.000 CE sul lato superiore di ogni inserimento del filtro. Lasciare che le celle Incubare indisturbato a 37 ° C per mezzo di sostituire h. 24 il giorno 4. Raccolto il giorno 5.
2. Raccolta frazioni dalla VCCC
- eseguire l'isolamento in una stanza di 4 ° C e mantenere tutti gli strumenti su ghiaccio.
- Tenere a mente il numero di singoli inserti essere isolata e aggiungere tampone di lisi per un tubo da 50 mL con l'etichetta MEJ (per i filtri isolati). Quindi etichettare due piatti di 10 mm; uno per uno per SMC e CE.
- Regola il volume di tampone di Lisi a seconda di come concentrato deve essere lisato; per 15 inserti, 500 µ l di tampone di lisi per il tubo MEJ e 250 µ l in ogni capsula di Petri è consigliati.
- Lavoro con una piastra 6 inserti in un momento. Aspirazione fuori il mezzo di cella cultura cappuccio e poi trasporto in una camera fredda su ghiaccio.
Nota: Le istruzioni seguenti sono ad 1 Inserire isolamento. - Dispensare 10 µ l di PBS 1X sul fianco dell'inserto SMC.
- Utilizzare il sollevatore di cella per raschiare le cellule ad una estremità dell'inserto e trasferire le cellule dal sollevatore per la SMC di Petri che dispone di buffer di lisi in esso.
- Una volta che il sollevatore di cella ha toccato il buffer di lisi nel piatto, non permettono di toccare l'inserimento del filtro fino a quando è stato completamente spazzato via e asciugata su carta assorbente. Ripetere la raschiatura del filtro SMC almeno una o due volte per rimuovere completamente i restanti detriti cellulari SMC.
- Girare l'inserto sopra e dispensare 10 µ l di PBS 1X nel lato superiore/CE dell'inserimento del filtro. Ripetere i punti 2.6 e 2.7 con un raschietto di cella e la capsula di Petri CE.
- Raccogliere il rimanente cella e PBS liquame dal lato CE del filtro con una pipetta e trasferimento per il CE di Petri con tampone di lisi. Essere molto meticolosi nella raschiatura delle cellule fuori entrambi i lati del filtro da lasciare contaminazione minima CE/SMC nella frazione MEJ.
- Attentamente utilizzare il bisturi per tagliare fuori il filtro dall'inserto di plastica. A tale scopo di taglio 70-80% di esso dalla plastica e utilizzare pinze per tirare il filtro completamente fuori struttura dell'inserto in plastica. Mettere il filtro nel tubo conico di 50ml etichettato MEJ con buffer di lisi e assicurarsi che si siede nel buffer di lisi e rimane bagnato.
- Ripetere i passaggi di isolamento, in gruppi di 6, fino a quando non sono stati elaborati tutti degli inserti.
- Garantire che diversi gruppi di trattamento sono tenuti in piatti e tubi separati.
- Vortex la provetta conica da 50 mL MEJ in piena forza per 15 s o fino a ben miscelati. Rimuovere i filtri dal MEJ conica con le pinzette, trascinandoli lungo le pareti laterali del tubo da lasciare la massima quantità di proteine e di liquido nel tubo. Dopo questo punto, eliminare i filtri.
- Una volta che tutti i filtri sono stati rimossi dal tubo conico MEJ, fare un giro veloce (10-15 s a velocità max ~ 16.000 x g) in una centrifuga per estrarre tutto il liquido e le proteine alla parte inferiore del tubo. Trasferire il contenuto del tubo MEJ e i piatti CE e SMC Petri in provette da centrifuga separata, più piccola.
- Optional: trattare con ultrasuoni il contenuto delle provette MEJ/SMC/CE d'impostazione 4 per gli impulsi di tre 10 s su ghiaccio o omogeneizzare delicatamente a mano.
- Centrifugare a velocità max (~ 16.000 x g) 15 min a 4 ° C. Pipet fuori il surnatante e dosaggio lisato per contenuto proteico utilizzando il metodo di dosaggio bicinconinico.
3. Raccolta del VCCC per immunofluorescenza En Face
- incubazione il giorno 5 del VCCC, rimuovere gli inserti dall'incubatrice. Lavorando nella cappa di cultura cellulare, aspirare i SMC media da ciascuno dei pozzi più bassi dell'inserimento del filtro e sciacquare due volte con PBS 1X. Ripetere con il lato di CE.
- Mantenendo gli inserti intatti e nella piastra, aggiungere 4% paraformaldeide (PFA) per 10-20 min in camera cabina 4 ° C su un agitatore delicato. Lavare entrambi i lati del filtro inserto con PBS 1X per 5 min e ripetere due volte.
Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura. - Eseguire le incubazioni di anticorpo bloccante, primaria e secondaria nella piastra, assicurare che entrambi i lati del filtro siano mantenuti nell'anticorpo + soluzione bloccante (9 mL di PBS, 25 µ l Triton X100, 50 mg albumina di siero bovino, 500 µ l di siero normale)
- Per montare il filtro in una diapositiva, taglia il filtro fuori l'inserto di plastica con un bisturi montata su un manico e posto su un vetrino da microscopio con mezzo di montaggio a.
4. Raccolta del VCCC per immunofluorescenza trasversale
- incubazione il giorno 5 del VCCC, rimuovere gli inserti dall'incubatrice. Aspirare i media da entrambi i lati del filtro inserto nella cappa di cultura delle cellule e sciacquare ogni lato del filtro due volte con PBS 1X.
- Mantenendo gli inserti intatti e la piastra a 6 pozzetti, aggiungere 4% PFA e incubare per una notte in una camera di cabina 4 ° C su un agitatore delicato.
Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura.
5. L'incorporamento del VCCC per immunofluorescenza trasversale
- dopo filtro inserti sono stati corretti circa per 24 h a 4% PFA, trasferimento al 70% EtOH per almeno 24 h, ma fino a diverse settimane.
- Elaborare i filtri su un lungo (una notte) eseguito su un processore di tessuti automatizzato. Utilizzare il programma come segue: 70% EtOH per 30 min, 85% EtOH 30 min, 95% EtOH 30 min, 100% EtOH 30 min, 100% EtOH 45 min, 100% EtOH 45 min, xilene 30 min, xilene 30 min, xilene 45 min, 60 ° C paraffina 30 min, 30 min di paraffina 60 ° C , 45 min. di paraffina 60 ° C
- Dopo l'elaborazione, trasferire i filtri raccolti fino alla stazione di incorporamento in paraffina liquida, mantenendo il filtro nella cassetta.
- Rimuovere il filtro dal cassetto, attentamente con forcipe per tenerlo solo al bordo. Con le forbici, tagliare il filtro a metà, formando due semi-circolare, a forma di metà. Le 2 metà sulla parte piatto freddo della stazione incorporamento solo lungo abbastanza per riempire l'incorporamento della muffa con paraffina liquida laici ogni.
- Una volta riempito con paraffina liquida, molto brevemente toccare lo stampo incorporamento per il piatto freddo, quindi incorporare l'incorporamento della muffa (tagliata il lato giù) di ogni metà del filtro; ciò assicura che durante il sezionamento, uno tagli dal centro del filtro verso il bordo .
- Durante l'incorporamento, utilizzare pinze per tenere il filtro per prevenire le metà di cadere nella vicenda fino a quando la paraffina è abbastanza fresca per loro di stare da solo. Spostare lo stampo di incorporamento in un piatto freddo fino completamente solidificato.
Nota: Blocchi su vassoi di ghiaccio di raffreddamento aiuta a prevenire le sezioni rugose.
6. Sezionamento e la macchiatura del VCCC per immunofluorescenza trasversale
- per i blocchi di paraffina sezionamento e far scorrere il montaggio: tagliare 5 µm sezioni, inserire le sezioni in bagnomaria a 42 ° C e raccogliere le sezioni utilizzando carichi positivamente diapositive. Quindi mantenere diapositive durante la notte nel forno a 42 ° C per asciugare.
- Prima di iniziare la procedura di reidratazione, cuocere le diapositive a 60 ° C per sciogliere la paraffina e aiutare aderire le sezioni VCCC alla diapositiva. Raffreddare brevemente, poi reidratare le diapositive attraverso due cambi di xilene, 100% EtOH, 95% EtOH, un cambio di 70% EtOH e due cambi di acqua distillata.
- Evitare metodi di ricupero dell'antigene che coinvolgono microwaving o riscaldamento come sezioni possono cadere fuori della diapositiva.
- Eseguire il blocco standard per 1 h a temperatura ambiente, quindi il pernottamento incubazione con anticorpo primario a 4 ° C, seguita da lavaggio passaggi e anticorpo secondario per 1 h a temperatura ambiente. Montare con i mezzi di montaggio e il vetrino coprioggetti.
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Representative Results
Gli inserti filtro utilizzati per la VCCC hanno piccolo, 0,4 µm fori. Figura 1A, un'it faccia vista l'inserto del filtro VCCC, Mostra i pori in cui il MEJ può formare in vitro. Lo schema raffigura le cellule di muscolo liscio placcate sul lato inferiore del filtro un giorno prima che le cellule endoteliali sono placcate sul lato opposto (Figura 1B). Una volta che le cellule sono placcate, le frazioni di CE, MEJ e SMC possono essere isolati tre giorni più tardi. Un esempio di questo è mostrato nella Figura 2A, dove l'inibitore dell'attivatore del plasminogeno 1 (PAI-1) è altamente espressa nella frazione MEJ rispetto al resto della CE, che si è visto anche in vivo MEJs25. Questi dati dimostrano l'utilità di VCCC a ricapitolare la parete del vaso sanguigno arteriolare intatto.
Successiva è dimostrato VCCC in immunofluorescenza e microscopia elettronica. Il VCCC è rimasto intatto e fissa con PFA per immunofluorescenza trasversa. Figura 3A Mostra il muscolo liscio specifici recettori adrenergici alfa-1 e il recettore endoteliale bradichinina specifici. Falloidina macchiatura di F-actina illustra i ponti di actina in MEJ (freccia bianca) tra le due celle, che replica l'espressione visto in un' arteria intatto26. In Figura 3B, una sezione trasversale di VCCC come visualizzato da microscopia elettronica di trasmissione è dimostrata, che viene eseguito il rendering in 3D in Figura 3. Questi punti di vista della VCCC dimostrare la capacità di localizzare in particolare proteine, recettori e ultrastruttura di in vitro MEJs.
Figura 1: placcatura della co-cultura vascolare delle cellule (VCCC). (A) En face luce microfotografia dei pori del filtro inserto. Le frecce nere indicano singoli fori. (B) schema di placcatura del VCCC. Giorno 1 Mostra inversione dell'inserto filtro e placcatura SMC sul fondo. Il giorno 2, la CE sono placcati sul lato opposto del filtro e del VCCC rimane in questa conformazione in una piastra a 6 pozzetti fino alla raccolta. Frecce bianche per indicare il lato del filtro dove le cellule sono placcate e cresceranno. Barra della scala = 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: arricchimento di proteina nel MEJ. (A) immagine del microscopio elettronico di Immuno-trasmissione dell'arteria del mouse con l'espressione di alfa globina presso il MEJ (perline oro che appaiono come puntini neri). Western blot (B) risultati dell'inibitore dell'attivatore del plasminogeno 1 (PAI-1) espressione è arricchita nella frazione MEJ contro le frazioni CE o SMC. Plastica CE indica CE coltivate su un piatto di plastica, che non formano MEJ. Barra della scala = 1 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: trasversale di immunofluorescenza e microscopia elettronica in sezioni trasversali della VCCC. (A) colorazione per muscolari lisce ed endoteliali specifiche proteine. Macchiatura di F-actina è in tutto di entrambi i tipi di cella e lo in vitro MEJ (freccia bianca). Un esempio di microscopia elettronica usato per studiare l'ultrastruttura in vitro MEJs entrambi in 2D (B) e 3D (C). Barra della scala = 10 µm (A); 2,5 µm (B); e circa 2,5 µm verticale e orizzontale di 0,5 µm (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il VCCC ha una serie di vantaggi in termini di ricapitolare MEJs in vitro, ma ci sono punti di discussione quando si determina se il VCCC può essere utilizzato per applicazioni specifiche. Ad esempio, se diversi tipi di cellule devono essere usati con questo modello, esso sarà necessario essere ottimizzato. Abbiamo usato cellule umane primarie, ma è possibile isolare le cellule da bovino aorte24, o topi wildtype o ad eliminazione diretta, e li usa a VCCC1,5,14.
Se utilizza il VCCC per l'isolamento di MEJ, la tecnica più importante al master è di raschiatura accurata del filtro per garantire che la purezza della frazione MEJ non è alterata dalle cellule endoteliali o del muscolo liscio in eccesso. Abbiamo indicato tramite Western blotting che emoglobina alfa è il miglior marcatore di un «puro» MEJ isolamento13, come dovrebbe essere fortemente espresso nella frazione MEJ contro la frazione delle cellule endoteliali. Un altro è il PAI-1, che regola la formazione di MEJ (Figura 2)25. Riteniamo che questi possono essere indicatori particolarmente buoni per un robusto isolamento MEJ. Per extra fiducia nella tecnica del raccolto, i filtri possono essere mantenuti dopo la raschiatura per il raccolto e macchiati per CE/SMC marcatori25.
Espressione della proteina nella VCCC di imaging può essere eseguita in due modi principali: face it (Figura 1A) o trasversale (Figura 3). Entrambe le preparazioni consentono la visualizzazione delle proteine all'interno i fori del filtro da due prospettive diverse. La tecnica di face it coinvolge le arterie che sono tagliate longitudinalmente e quindi appuntate fuori piatto, con la CE rivolto verso l'alto, per visualizzare sia il monostrato di CE e i fori nella IEL, l'unico posto dove possono formarsi MEJ. Un segnale fluorescente all'interno di fori della IEL indica la localizzazione della proteina nel MEJ10,27. Questo stesso principio può essere tradotto per il VCCC da imaging il monostrato CE dall'alto, senza bisogno di incorporarlo in paraffina o fare sezioni. Il metodo trasversa è più complesso da padroneggiare, ma è critico per la visualizzazione distinte delle proteine nella CE contro i monostrati SMC (Figura 3).
La mancanza di flusso o tratto nel sistema è una limitazione potenziale, ma è possibile aggiungere il flusso in un muscolo liscio endoteliale delle cellule co-coltura16,19. Sembra che le condizioni statiche consentono ancora per l'espressione della proteina fisiologicamente accurata e l'attivazione, quindi potrebbe essere che il contatto di heterocellular è il fattore più importante nella dissezione di MEJ vie di segnalazione.
Non ci sono più applicazioni di questa tecnica di là di resistenza dell'arteria segnalazione come il VCCC non è necessariamente limitato ai tipi cellulari specifici. Altri modelli di co-coltura hanno utilizzato cellule endoteliali escrescenza e osteoblasti17, o modellato la barriera ematoencefalica con endoteliali e periciti/astrocyte co-culture21. Metastasi delle cellule tumorali attraverso l'endotelio può essere quantificata anche utilizzando questo modello21. È anche possibile far crescere cellule sul filtro e cultura in un'altra cella digitare nella parte inferiore del piatto 6 pozzetti per testare la segnalazione paracrina, o crescere cellule endoteliali sulla parte superiore della membrana a guardare la polarizzazione della cellula (nostre osservazioni non pubblicate). Leucociti o altre cellule circolanti possono essere aggiunti ai media CE e l'adesione delle cellule possa essere quantificati12. Inoltre, il VCCC può essere utilizzato per indagare patologie quali il muscolo liscio migrazione24 e proliferazione in risposta alla lesione endoteliale15,18.
In conclusione, abbiamo presentato un metodo per isolare MEJ da un in vitro delle cellule sistema della coltura, che consente per l'indagine dei processi tra due tipi di cellule accoppiato di segnalazione. D'importanza, il sistema di co-coltura non è limitato allo studio del MEJ e possa essere prezioso per rispondere a una serie di domande, soprattutto quelli che coinvolgono heterocellular comunicazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Heart, polmone ed Istituto del sangue concede 14PRE20420024 fellowship predoctoral R01088554, T32HL007284 e American Heart Association. Ringraziamo in particolare la St. Jude cellulare Imaging ha condiviso la ricerca Core, tra cui Randall Wakefield e Linda Horner per le immagini di microscopia elettronica, Adam Straub per assistenza con immagini rappresentative di immunofluorescenza e Pooneh Bagher per lei prezioso feedback sul protocollo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225 cm flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10 mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1x PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
- Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
- Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
- Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix? Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
- Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
- Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
- Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
- Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
- Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
- Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
- Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
- Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
- Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
- Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
- Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123 (2014).
- Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
- Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
- Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
- Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
- Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
- Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
- Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).
