Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la imagen en vivo de la fusión del paladar secundario de ratón mediante microscopía confocal. Este protocolo puede usarse en combinación con una variedad de líneas de ratón fluorescentes de reportero, y con inhibidores de vía para una visión mecánica. Este protocolo puede ser adaptado para imágenes en vivo en otros sistemas de desarrollo.
Abstract
La fusión de los estantes palatales secundarios para formar el paladar secundario intacto es un proceso clave en el desarrollo de los mamíferos y su alteración puede conducir a la hendidura del paladar secundario, una anomalía congénita común en los seres humanos. La fusión del paladar secundario ha sido ampliamente estudiada conduciendo a varios mecanismos celulares propuestos que pueden mediar en este proceso. Sin embargo, estos estudios se han realizado principalmente en tejidos embrionarios fijos en puntos de tiempo progresivos durante el desarrollo o en cultivos de explantes fijos analizados en puntos de tiempo estáticos. El análisis estático es limitado para el análisis de los procesos morfogenéticos dinámicos tales como una fusión del paladar y qué tipos de comportamientos celulares dinámicos median en la fusión palatal se entiende incompletamente. Aquí se describe un protocolo para la imagen en vivo de fusión de paladar secundario ex vivo en embriones de ratón. Para examinar los comportamientos celulares de la fusión del paladar, Keratin14 -cre específico epitelial se utilizó para etiquetar las células epiteliales del paladar en ROSEmbriones reporter flox A26-mTmG. Para visualizar la actina filamentosa, se utilizaron ratones reporteros Lifeact-mRFPruby . La imagen en vivo de la fusión del paladar secundario se realizó mediante la disección de estanterías palatales secundarias recientemente adheridas de embriones embrionarios de día (E) 14.5 y el cultivo en medios que contenían agarosa en un plato inferior de vidrio para permitir la formación de imágenes con un microscopio confocal invertido. Usando este método, hemos detectado una variedad de nuevos comportamientos celulares durante la fusión palatina secundaria. Una apreciación de cómo distintos comportamientos celulares se coordinan en el espacio y el tiempo contribuye en gran medida a nuestra comprensión de este proceso dinámico morfogenético. Este protocolo se puede aplicar a líneas de ratones mutantes, o cultivos tratados con inhibidores farmacológicos para avanzar en la comprensión de cómo se controla la fusión de paladar secundaria.
Introduction
La fusión de tejidos es un paso importante en el desarrollo de múltiples órganos. Los principales defectos de nacimiento humanos, tales como labio leporino y paladar hendido, espina bífida y malformaciones del corazón pueden ser resultado de defectos en la fusión de tejidos 1 . La fusión del paladar secundario del ratón ha sido ampliamente estudiada para identificar los mecanismos celulares y moleculares que controlan la fusión de tejidos en el desarrollo 2 , 3 , 4 . En el ratón, el desarrollo del paladar secundario comienza alrededor de E11.5 con el crecimiento de un estante palatino secundario de cada uno de los procesos maxilares bilaterales. El crecimiento inicial de los estantes palatales se produce verticalmente a lo largo de la lengua, hasta aproximadamente E14.0, momento en el cual los estantes palatales se elevan horizontalmente por encima de la lengua. El crecimiento medialmente dirigido da como resultado el contacto físico entre los epitelios de las dos estanterías palatinas, formando el epitelio de la línea mediaAl costura (MES) en E14.5. El MES intermedio debe ser removido de entre los estantes palatales secundarios para permitir la confluencia mesenquimal y el desarrollo de un paladar secundario intacto, completamente fusionado por E15.5 3 .
La forma en que se forma una capa epitelial compartida de células MES entre dos estantes palatales separados, y luego se eliminan para lograr la confluencia mesenquimal, ha sido una cuestión central en el desarrollo del paladar. Basado en estudios histológicos y de microscopía electrónica de ratón (EM), estudios de cultivos de explantes y experimentos genéticos de ratón, varios comportamientos celulares fundamentales han sido implicados en este proceso. Las proyecciones de tipo filopodia del epitelio del borde mediano MEE de cada estante palatino facilitan el contacto inicial 5 , 6 , seguido de la intercalación de estas células epiteliales a una MES única compartida 6 , 7 . Eliminación de la MES compartida resultanteHa sido propuesto para proceder por tres mecanismos no exclusivos. Los primeros estudios que emplean observación histológica y ex vivo linaje rastreo con colorantes vitales indicaron que las MES pueden ser removidos por transición epitelial a mesenquimal (EMT) de células MES 8, 9, aunque más recientemente, genética rastreo de linaje de las células epiteliales ha planteado incertidumbre en cuanto a La contribución a largo plazo de las células epiteliales al mesénquima del estante palatal 10 , 11 , 12 . Un número significativo de células apoptóticas, y una reducción en su número en algunos mutantes que no se someten a la fusión adecuada paladar ha llevado a la idea de que la apoptosis puede ser un importante conductor de MES disolución [ 2 , 3] . Finalmente, basándose inicialmente en estudios con etiquetado epitelial y observación estática en puntos de tiempo progresivos, las células MESSe propusieron migrar en las dimensiones oronasal y anteroposterior 11 , 13 , pero estos comportamientos celulares dinámicos fueron inicialmente no confirmados debido a la incapacidad de observarlos en tejido palatino vivo. Recientemente, hemos sido capaces de observar directamente estos comportamientos mediante el desarrollo de una nueva metodología de imagen en vivo que combina los métodos genéticos de ratón de marcado fluorescente con confocal imágenes en vivo de estantes palatales explantados.
Primero, para visualizar los comportamientos celulares dinámicos en las células epiteliales del paladar durante la fusión del paladar, se generó un ratón reportero epitelial específico cruzando ROSA26- mTmG ratones flox con ratones Keratin14-cre 14 , 15 . Confocal imágenes en vivo del cultivo de explante paladar de los embriones resultantes confirmó algunos propuesto anteriormente los comportamientos celulares e identificaron nuevos eventos en el proceso de fusión 6 6 , 16 . Este método de formación de imágenes se puede usar con otras líneas de reportero; Utilizamos Lifeact-mRFPruby ratones transgénicos 17 , 18 para examinar la dinámica del citoesqueleto actina durante el proceso de fusión. También se pueden emplear otros reporteros para observar otros aspectos específicos de la fusión del paladar y este método puede adaptarse a microscopía confocal de barrido láser o microscopía confocal de disco giratorio, dependiendo de las necesidades de formación de imágenes y de la disponibilidad del microscopio. La imagen en vivo se está convirtiendo cada vez más en un enfoque clave en la biología del desarrollo. PartiCularmente, la morfogénesis craneofacial es compleja y los defectos congénitos humanos que afectan la cara son comunes. Este método confocal de imágenes en vivo ayudará a permitir una mejor comprensión de los mecanismos básicos de desarrollo subyacentes, así como los orígenes de las anomalías craneofaciales humanas.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos de la Universidad de California en San Francisco Cuidado de Animales institucional y Comité de Uso.
1. Preparación de medios de imagen en vivo
- Preparación de medios de cultivo líquidos
- Añadir 20% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mu g / ml de estreptomicina, 200 mu g / ml de ácido L-ascórbico, 15 mM de HEPES a Dulbecco's Modified Eagle Medium medios de comunicación.
NOTA: Los medios de imagen en vivo se han fabricado justo antes de la obtención de imágenes. Este medio contiene fenol-rojo que puede conducir a la fototoxicidad a lo largo de cursos de tiempo de imágenes en vivo. La sustitución de los medios sin rojo de fenol puede mejorar la imagen a largo plazo.
- Añadir 20% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mu g / ml de estreptomicina, 200 mu g / ml de ácido L-ascórbico, 15 mM de HEPES a Dulbecco's Modified Eagle Medium medios de comunicación.
- Preparación de solución de agarosa de bajo punto de fusión
- Disolver 350 mg de agarosa de bajo punto de fusión en 10 ml de agua destilada en autoclave para obtener una solución madre al 3,5%.
- Mezclar el pocillo de la solución de agarosa e incubar a 70 ° C en un baño de agua para disolver completamente la agarosa.
- Enfriar la solución de agarosa en un baño de agua a 37 ° C antes de añadirlo a los medios de imagen en vivo.
- Añadir 1 ml de la solución madre de agarosa a 5 ml del medio de formación de imágenes en vivo líquido para obtener una concentración final (0,6%).
- Mantenga el medio con agarosa en un baño de agua a 37 ° C para evitar la solidificación prematura.
2. Preparación del cultivo de explantes de paladar para imágenes en directo
- Disección de estanterías palatales secundarias E14.5 recientemente adheridas
NOTA: En nuestra experiencia, la fusión de imágenes requiere comenzar con un par ligeramente adherido de estantes palatales; Esta adherencia evita movimientos de explante que evitan que se produzca fusión durante la formación de imágenes.- Dissect E14.5 embriones etapa en 1 x salino fosfato-tamponado (PBS) y elegir la proteína fluorescente verde (GFP) -expresando (deK14 - cre; ROSA26-mTmG flox ) o (proteína fluorescente roja) que expresan RFP (de Lifeact-mRFPruby ) embriones positivos utilizando un microscopio de disección equipado con lámparas fluorescentes. Transferir el tejido a medios de cultivo de imagen viva precalentados sin agarosa.
- Corte la cabeza del embrión y retire el área superior del cerebro usando dos pinzas finas No. 5 ( Figura 1 A-C ). Utilice una pinza No. 5 para sostener el embrión mientras que la otra pinza No. 5 cortará el tejido adicional fuera de los estantes palatales.
NOTA: Las tijeras finas se pueden utilizar para cortar la cabeza del embrión (el primer paso) en vez de una pinza No. 5. Sin embargo, dos fórceps finos No. 5 darán un mejor control para hacer cortes precisos. - Retire la mandíbula cuidadosamente sin dañar las estanterías palatinas como se muestra en la Figura 1 D y 1E . Para reducir la posibilidad de dañar los paladares, mantener la lengua a través de la disección de la mandíbula, fOllowed por la eliminación cuidadosa de la lengua.
- Después de retirar la mandíbula y la lengua, examinar el lado oral del paladar secundario con un estereomicroscopio con fluorescencia para confirmar la señal de un reportero fuerte en el MES ( Figura 1 M ).
- Disecar las partes posteriores, incluyendo el trasero y el tronco cerebral después de extraer la mandíbula y la lengua ( Figura 1 F ).
- Retire ambos maxilares con estantes palatinos adheridos ( Figura 1 G ).
- Corte el tejido anterior de la mandíbula superior manteniendo intacto el paladar primario y secundario ( Figura 1 H e I ).
- Quitar el tabique nasal en el lado nasal del explante exponiendo el MES.
NOTA: Estos pasos posteriores de las disecciones necesitan una atención cuidadosa para no interrumpir los contactos entre dos estantes palatales secundarios. La extirpación del tabique nasal ayuda aReducir la señal de fondo de otras áreas y también reducir el movimiento vertical del tejido, lo que permite una imagen estable ( Figura 1 J-L ). - Después de diseccionar las estanterías palatales, examine nuevamente la señal del reportero de la línea media para asegurarse de que no haya daños en la capa epitelial entre los tejidos.
- Preparación de explantes de paladar en un plato de cultivo con medios de imagen en vivo
- Coloque los medios de imagen en vivo en un plato inferior de vidrio de 35 mm.
- Coloque los estantes palatales disecados con el lado oral hacia abajo, lo más cerca posible del fondo de vidrio, para obtener imágenes con un microscopio confocal invertido ( Figura 1 N ).
- Coloque pastillas de hielo seco en una superficie conductora cerca de la placa de cultivo para acelerar la solidificación de agarosa disminuyendo rápidamente la temperatura o poner la cápsula de cultivo a 4 ° C. Una placa fría, como la que se utiliza para la incrustación de parafina también podría ser utilizado en este sTaje
NOTA: Cuando se usa hielo seco, el cambio de los medios de agarosa necesita ser monitoreado cuidadosamente para prevenir el congelamiento de los medios.
3. Confocal Time-lapse Imaging de Palate Explant
- Imaging y adquisición de datos
- Después de semi-solidificar la agarosa, montar el plato de cultivo en un microscopio confocal invertido equipado con cámara de incubación a 37ºC. Utilice un microscopio confocal de luz blanca y un microscopio confocal de disco giratorio de observador de células.
NOTA: Utilizamos un medio modificado que contenía HEPES 15 mM sin gas CO 2 . - Colocar vaselina entre el plato de cultivo y cubrir con una jeringa para evitar la evaporación de los medios de comunicación ( Figura 1 N ).
NOTA: Se produce algo de condensación en la parte superior de la cubierta del plato de cultivo después de un cultivo durante la noche (O / N), pero el volumen de medio no cambia, lo que sugiere que la vaselina evita que los medios se evaporen. - Localice la región de interés con objetivos de ampliación baja (10x) y utilice objetivos de ampliación más altos (objetivo 20x con zoom digital de 3x o objetivo de 40x con Immersol W) para imágenes en tiempo real.
NOTA: Los estantes palatales secundarios disecados no son planos. El paladar secundario es una estructura curvada y esto hace que sea difícil imaginar el MES completo en el mismo plano. Las imágenes de baja ampliación (10x) pueden permitir imágenes en paladar completo, pero los objetivos 40x proporcionarán una mejor resolución de imagen para examinar los movimientos celulares detallados en posiciones Z más profundas. La curvatura es alta en la región del paladar medio. El paladar anterior y posterior son relativamente planos en comparación con el paladar medio. A menudo nos fijamos en la mitad anterior del paladar secundario para evitar las regiones de mayor curvatura. - Escanear múltiples pilas Z con 5 μm cada paso durante 16-24 h usando la excitación láser apropiada (488 nm para GFP y 532/561 nm para RFP) ( Figura 2 ).
NOTA: Para reducir la fototoxicidad potencial, use la potencia láser mínima y el tiempo de exposición. Esto es importante especialmente en el caso de imágenes multicolor. Utilice un 22% de potencia láser de 552 nm para membranaTomato (mT), un 30% de potencia láser de 495 nm para membranaFPG (mG) y un 25% de potencia láser de 561 nm para membranaRFP. El tiempo medio de exposición fue de 550 ms. - Utilice el software de análisis de imágenes para realizar seguimiento celular y análisis cuantitativo.
- Después de semi-solidificar la agarosa, montar el plato de cultivo en un microscopio confocal invertido equipado con cámara de incubación a 37ºC. Utilice un microscopio confocal de luz blanca y un microscopio confocal de disco giratorio de observador de células.
4. Análisis de la imagen de datos
NOTA: Aquí, Imaris fue utilizado. Análisis de datos similares también pueden realizarse con paquetes de software ImageJ o Volocity.
- Representación de superficies tridimensionales (3D) a partir de secuencias de imágenes.
NOTA: Esta sección permite generar una superficie a partir de una película generada con una señal GFP de membrana.- Haga clic en Editar | Muestre el ajuste de la pantalla y utilice el deslizador del histograma para ajustar la intensidad de la señal de modo que la señal de membrana quede clara a través deLa duración de la película ( Figura 3 A ).
- Corregir la señal blanqueada utilizando Image Procesamiento | Corrección de atenuación . Ajuste los valores Intensity Front (Frente de intensidad) e Intensity Back (Retorno de intensidad) para que la señal de membrana se aclare a lo largo de la película. Es posible que se requieran algunas pruebas y errores al establecer estos valores.
NOTA: El valor de Intensity Back (posición de profundidad Z) será menor que el valor de Intensity Front (superficie Z) debido a la penetración limitada del láser. Estos valores también pueden cambiarse para normalizar la intensidad de la señal en la serie Z. Ambos valores pueden ajustarse para lograr la corrección de blanqueo. La corrección de atenuación también se denomina corrección de atenuación de emisiones 19 . - Con el fin de generar una superficie a partir de la señal de membrana, seleccione Surpass | Superficies , elija un canal de origen y un tipo de Umbral (Intensidad absoluta) y bajo los ajustes de algoritmoLección Segmente sólo una Región de Interés Y Proceso de la imagen entera finalmente , seguido haciendo clic en la flecha hacia adelante; Continúe presionando la flecha hacia adelante (utilice la configuración predeterminada o especifique los niveles de detalle de superficie y el método de umbral por ensayo y error), verificando si la superficie generada refleja la señal de fluorescencia. Para especificar una Región de Interés, seleccione la región y la (s) hora (s) a renderizar recortando las posiciones X, Y, Z.
NOTA: Seleccione Proceso de toda la imagen finalmente para que los ajustes y los umbrales se apliquen a través de toda la película. - Genere una superficie haciendo clic de nuevo en el botón de flecha hacia delante. A continuación, ajuste el umbral cambiando el histograma en Filtros para que corresponda a la señal de membrana.
- Después de que se genera la superficie, elija superficie en Superficies / Ajustes para visualizar la señal de superficie y terminar el proceso de generación de superficie empujando el doble remolqueArd ( Figura 3 B ).
- Ir a la superficie | Edite y haga clic en Mascarar todo en las propiedades de máscara para generar una imagen de canal enmascarada.
- Después de hacer clic en Aceptar, la ventana Canal de máscara se abrirá automáticamente; Seleccione el canal GFP, ajuste los voxels fuera de la superficie al valor máximo de intensidad de la señal (que se encuentra en el ajuste Edit | Display ) y voxels dentro de la superficie al valor mínimo de intensidad GFP (también encontrado en Editar | Ajuste de la pantalla ), en Ajustes de máscara para generar una máscara de la señal de membrana.
- Como la máscara de la señal de membrana se mostrará en la vista de volumen , generar imágenes invertidas mediante el procesamiento de imágenes | Cambio de Contraste | Invertir ( Figura 3 C ).
- Detección de manchas de imágenes de superficie invertida.
NOTA: Esta sección permite que el centro de cada celda seaMarcado con un lugar único y rastreado sobre el espacio y el tiempo.- Seleccione Surpass Scene | Spots | Crear ; En Ajustes de Algoritmo seleccione Segmento sólo una Región de Interés , Proceso de toda la imagen finalmente y Puntos de Pista (con el tiempo) .
- Haga clic en la flecha hacia adelante y especifique una región de interés; Seleccione la región y la (s) hora (s) para rastrear los puntos; Continúe presionando la flecha delantera, elija el canal enmascarado como canal fuente y determine el diámetro estimado de puntos XY.
- Al hacer clic en el botón de flecha hacia adelante se abrirá automáticamente una ventana de filtro; Ajustar el umbral de detección de puntos cambiando los valores en el histograma para generar puntos únicos en el centro de cada celda ( Figura 3 D ).
- Al hacer clic de nuevo en el botón de flecha hacia delante, se abrirá la ventana de Algoritmo ., Seleccione el modelo de seguimiento de movimiento automático 20 y especifique los datos de seguimiento máximoY el tamaño máximo de hueco para conectar las vías que se convierten en discontinuas durante un corto período de tiempo.
- Al hacer clic de nuevo en el botón de flecha hacia delante se abrirá la ventana Filtros, establezca el umbral de duración de pista ajustando el histograma para que cada celda sea rastreada. Al hacer clic en el botón de flecha de avance doble se finalizará la detección de puntos.
- Para corregir la deriva de tejido, haga clic en Spots | Track Editor y seleccione Correct Drift . Se abrirá automáticamente una ventana Algoritmo ; Seleccione la opción Derivación translacional, Incluir resultado completo y Posiciones correctas de objetos .
- Generación de parcelas ventajosas para el análisis cuantitativo.
NOTA: El Scatterplot del programa es una herramienta para generar gráficos multidimensionales (X, Y, Z, Color y Escala) con múltiples objetos. Estas parcelas son útiles para ver las tendencias de muchos movimientos celulares en el tiempo.- Realice tramas 2D o 3D de datos de seguimiento de celdasVantage-Añadir nuevo menú de trazado Vantage ( Figura 3 E y 3F ).
- Seleccione Volume o Spots y elija Create / Category y Plot Type
- Ajuste los valores de trazado para generar diferentes gráficos de Vantage.
- Exportación de gráficos mediante la función Snapshot .
NOTA: Los datos estadísticos también se pueden exportar como una hoja de cálculo para un análisis cuantitativo adicional haciendo clic en Área de números de trazado | Guardar .
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Representative Results
La visualización en vivo del cultivo de explantes de paladar reveló múltiples procesos celulares que median la fusión del paladar 6 . Los contactos iniciales entre dos células epiteliales se hacen por protrusiones de membrana ( Figura 2 B-2E ). Cuando dos capas epiteliales se encuentran, forman una MES multicelular, seguida de intercalación para formar una MES de capa celular integrada a través de la convergencia epitelial ( Figura 2 A-2E y Figura 2 K-2O ). Las células epiteliales en los niveles Z más profundos también se desplazan progresivamente al lado oral de la MES contribuyendo al proceso de convergencia epitelial ( Figura 2 K ). Posterior-dirigida migración celular se observó en el medio paladar MES ( Figura 2 F-2J ). Además, se encontró células epiteliales extRusal durante la fusión del paladar sugiriendo que las células epiteliales en el MES puede ser eliminado por este proceso activo ( Figura 2 Q, 2T ). La costura epitelial integrada se romperá finalmente para lograr la confluencia mesenquimal ( Figura 2 S, 2T ).
El paladar Lifeact-mRFPruby mostró reordenamientos dinámicos de citoesqueleto de actina durante la fusión del paladar 6 . La actina filamentosa se enriquece en el borde entre las áreas epitelial y mesenquimal que forman una estructura similar a un cable a lo largo del eje anterior-posterior ( Figura 2 K-2T) . La contractilidad actomiosina impulsa la convergencia epitelial y la rotura de MES debido a que la inhibición química de la actividad de la miosina o la polimerización de actina bloqueó estos procesos dinámicos 6 .
Hin-page = "1"> El software se utilizó para rastrear los comportamientos celulares durante la fusión del paladar. El mejor método para el seguimiento de células depende de la señal del reportero. Si se utiliza un ratón reportero nuclear, el programa puede rastrear el centro de las señales fluorescentes como centros celulares [ 21] . Ratón informador GFP nuclear, tal como ROSA26 GFP-NLS-lacZ ( GNZ) 22 puede por lo tanto ser usado para marcar células epiteliales usando líneas Cre específicas de tejidos; En nuestras manos, este reportero nuclear específico exhibió un blanqueamiento más rápido durante el largo período de tiempo usado en la imagen en vivo. Por lo tanto, hemos utilizado la membrana-GFP reportero ( ROSA26-mTmG flox ) para seguir los movimientos de células epiteliales en nuestros estudios. Esto requirió un método para identificar y rastrear células individuales mediante una señal de membrana. Para resolver este problema, hemos utilizado un método de seguimiento de células modificadas ( Figura 3 y Protocolo sección 4 ).
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Figura 1 : Vista esquemática de la disección del paladar secundario del ratón. ( A ) Vista lateral del embrión de ratón E14.5. Para disecar los estantes palatales, se cortó la cabeza a lo largo de la primera línea punteada blanca, # 1. ( B, C ) Se eliminó el cerebro superior (por encima de la segunda línea blanca, # 2). ( D, E ) Vista oral de la cabeza disecada. Se diseccionó la mandíbula inferior (# 3) y se retiró la lengua (# 4). ( F ) Se cortó la parte posterior de la cabeza a lo largo de la línea # 5. ( GI ) Tanto los maxilares (# 6, # 7) como la parte anterior de la mandíbula superior (# 8) fueron eliminados. ( JL ) Se extrajo el tabique nasal (# 9) ( M ) señales GFP en el MES del paladar diseccionado a partir de un K14-cre; ROSA26 mTmG embrión de ratón. ( N ) Configuración de imágenes en directo. El lado oral del amigoEl explante estaba mirando hacia abajo para ser fotografiado con microscopio confocal invertido. MES está indicado con puntas de flecha blancas ( FI ). El área de imagen está indicada por cajas punteadas blancas en L y M. Barras de escala = 2 cm en A, 1 cm en BI, 500 μm en JM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Imágenes en vivo de cultivos de explantes de paladar. ( AE ) Imágenes en vivo del paladar secundario anterior a partir de un K14-cre; ROSA26 mTmG (5 μm de profundidad). La punta de flecha blanca muestra una protrusión de membrana de una célula epitelial ( FJ ) Imágenes en vivo del paladar medio de K14-cre; ROSA26 mTmG explant (5 μm dEpth). Las flechas blancas indican la dirección de las migraciones celulares desde el paladar anterior al paladar posterior. ( KO ) Imágenes vivas del paladar anterior del explante Lifeact-mRFPruby (5 μm de profundidad). El desplazamiento de células epiteliales (flecha amarilla) a la superficie oral y la convergencia para formar un MES integrado con estructuras de actina tipo cable en la línea media. ( PT ) Imágenes vivas del paladar anterior del explante Lifeact-mRFPruby (25 μm de profundidad). La flecha roja indica un evento de extrusión celular ( Q, T ). Los puntos de ruptura futuros de la costura se indican mediante dos flechas verticales blancas en S y T. Barras de escala = 20 μm. Todos los datos de imágenes en vivo en esta figura se deriva de los experimentos publicados anteriormente en 6 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3 : Análisis de datos. ( AD ) Para rastrear células epiteliales con membrana GFP señales de K14-cre; ROSA26 mTmG explante de paladar ( A ), Se generó una superficie por volumen de la señal GFP de membrana ( B ). Las imágenes invertidas se generaron después de enmascarar la superficie creada ( C ). Se identificaron centros celulares a partir de las imágenes invertidas utilizando una función de detección de manchas en Imaris ( D ). ( E ) Las reconstrucciones 3D permiten el seguimiento de movimientos celulares en múltiples direcciones. A: anterior, P: posterior, N: nasal, O: oral ( F ) El análisis 2D genera una gráfica ventajosa que muestra las células que migran de la dirección anterior a la posterior en el MES del paladar medio. Barras de escala = 20 μm en AD, 10 μm en EF.S / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video Figura 1: Imágenes en vivo de K14-cre; ROSA26-mTmG flox paladar anterior (5 μm de profundidad). Las imágenes se capturaron cada 10 min (10 min / marco) durante 16 h 20 min, Barra de escala = 25 μm. Este video es una posición Z diferente de una película publicada previamente en la referencia 6 . Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic derecho para descargar.)
Vídeo Figura 2: Imágenes en vivo de K14-cre; ROSA26-mTmG flox Paladar medio (5 μm de profundidad). Las imágenes se capturaron cada 15 min (15 min / marco) durante 13 h 30 min, Barra de escala = 25 μm. Este video ha sido publicado previamente en la referencia 6 . Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic derecho para descargar.)
Video Figura 3: Imágenes en vivo de Lifeact-mRFPruby anterior paladar (5 μ m de profundidad).
Las imágenes se tomaron cada 10 min (10 min / marco) durante 7 h 50 min. Barra de escala = 20 μm. Este video ha sido publicado previamente en la referencia 6 . Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic derecho para descargar.)
Video Figura 4: Imágenes en vivo de Lifeact-mRFPruby paladar anterior (25 μ m de profundidad).
Las imágenes se tomaron cada 10 min (10 min / marco) durante 7 h 50 min. Barra de escala = 20 μm. Este video es una posición Z diferente de una película publicada previamente en la referencia 6 . Haga clic aquí para ver este video. (Haga clic derecho para descargar.)
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Discussion
Imágenes en vivo de la morfogénesis del tejido con el cultivo de explante de órganos 3D puede proporcionar información detallada sobre los procesos celulares que no se puede mostrar en el análisis de tinción convencional de secciones de tejido fijo. Utilizando cultivo de explantes in vitro de paladar secundario embrionario de ratón, se observaron varios comportamientos celulares interesantes que nos llevaron a proponer un nuevo mecanismo de fusión del paladar que implica la convergencia epitelial y la extrusión celular.
Un desafío común en estudios de este tipo es el fotoblanqueo mediante excitaciones láser continuas durante un largo periodo de tiempo. En nuestros estudios, se utilizó un microscopio confocal confocal de luz blanca y un microscopio confocal de disco giratorio. Algún descenso en la intensidad de la señal con el tiempo podría ser corregido por correcciones de blanqueo en el software de imágenes (LAS-AF) (Protocolo 4.1). Debido a que la corrección del blanqueo es limitada, es importante optimizar cuidadosamente la potencia del láser y el tiempo de exposición en cada sistema de imágenes. También comprobamosQue la fusión del paladar se produce normalmente en el medio de imagen en vivo después de 3 días de cultivo [ 6] .
Un segundo problema común en la imagen en vivo es la deriva de tejidos. Es crítico minimizar la deriva para obtener imágenes consistentes durante la imagen en vivo, porque los cambios en el plano focal pueden confundir una comprensión de los cambios morfogenéticos con el tiempo. Mientras que el control de la deriva térmica se puede lograr en muchos microscopios confocales (foco definido en el microscopio), la deriva del tejido en relación con el fondo de vidrio no puede ser corregido por estos métodos. La utilización de agarosa, así como la colocación del explante contra el fondo de vidrio ayuda a minimizar esto, pero todavía hay que tener cuidado de analizar aquellas películas que mantienen una posición relativamente constante. Esto puede determinarse siguiendo varios puntos de control en el campo de imagen a través del tiempo para determinar si permanecen constantes, se mueven con una tendencia similar o se mueven de manera diferente. Hasta cierto punto, el uso dePermiten una corrección de la deriva de algunos tejidos en la imagen en vivo (Protocolo 4.2).
Se utilizó agarosa de bajo punto de fusión a una concentración final de 0,6% en los medios de formación de imágenes en vivo para inmovilizar los tejidos de explante. Cuando probamos concentraciones más altas de agarosa, parecían alterar la morfogénesis del tejido, posiblemente debido a la restricción mecánica. Por lo tanto, es importante utilizar la concentración de agarosa correcta para minimizar la desviación del tejido sin alterar la morfogénesis.
Debido a la profundidad de imagen confocal, este método plantea límites en el examen de los planos Z más profundos de la fusión del paladar. Utilizando los microscopios confocales de WHITE LIGHT y de disco giratorio, la señal a partir de profundidades de 100 μm podría ser visualizada con éxito aunque la imagen comenzó a volverse aburrida y débil más allá de este límite. Debido a que la fusión palatina es un proceso progresivo en los ejes oronasal y anteroposterior, se propone que la obtención de imágenes de múltiples posiciones permite de manera efectiva la obtención de imágenes de diferentes áreasHs de fusión del paladar, pero en el futuro se pueden emplear microscopía confocal de dos fotones o de hoja ligera para mejorar la profundidad de la imagen. En la mayoría de nuestros experimentos, el lado oral de los explantes del paladar fue visualizada. La imagen del lado nasal del explante del paladar es difícil debido a que el tabique nasal está fusionado o muy cerca de los estantes palatales secundarios. En nuestros intentos de fusionar la imagen desde el lado nasal, también fue necesario eliminar el tejido nasal adicional para que no interfiera con la señal del epitelio del paladar. Aunque era posible, la visualización del lado nasal del explante del paladar era difícil porque la disección del tabique nasal a menudo causaba daño a los explantes del paladar.
La visualización en vivo de los explantes de tejido de ratón reportero es un método poderoso para estudiar los mecanismos celulares de la morfogénesis del tejido durante el desarrollo embrionario. Mediante técnicas de microscopía confocal y análisis cuantitativo de imágenes, los procesos básicos de desarrollo como la fusión secundaria del paladar pueden serInvestigado a nivel celular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias al Sr. Douglas Benson para las conversaciones iniciales con respecto a la imagen secundaria del paladar. También reconocemos a David Castaneda-Castellanos (Leica) y Chris Rieken (Zeiss) por su ayuda para ajustar las condiciones de imagen en microscopía confocal. Agradecemos a Lynsey Hamilton (Bitplane) por sugerencias útiles para el análisis cuantitativo de imágenes usando el software Imaris. Este trabajo fue financiado por NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
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