Summary
Ici, nous présentons un protocole pour l'imagerie en direct de la fusion palatine secondaire de souris à l'aide d'une microscopie confocale. Ce protocole peut être utilisé en combinaison avec une variété de lignes de souris rapporteurs fluorescentes et avec des inhibiteurs de voie pour une vision mécaniste. Ce protocole peut être adapté pour l'imagerie en direct dans d'autres systèmes de développement.
Abstract
La fusion des étagères palatines secondaires pour former le palais secondaire intact est un processus clé dans le développement de mammifères et sa perturbation peut conduire à une fente de palais secondaire, une anomalie congénitale commune chez l'homme. La fusion du palais secondaire a été largement étudiée, ce qui a mené à plusieurs mécanismes cellulaires proposés qui peuvent servir de médiation à ce processus. Cependant, ces études ont été principalement réalisées sur des tissus embryonnaires fixes à des points de temps progressifs pendant le développement ou dans des cultures d'explants fixes analysées à des points de temps statiques. L'analyse statique est limitée pour l'analyse des processus morphogénétiques dynamiques, telle que la fusion palatine et les types de comportements cellulaires dynamiques médiates de la fusion palatine est incomplètement comprise. Nous décrivons ici un protocole pour l'imagerie en direct de la fusion de palais secondaire ex vivo dans des embryons de souris. Pour examiner les comportements cellulaires de la fusion palatine, la Kératin14 -cre spécifique à l' épithélium a été utilisée pour étiqueter les cellules épithéliales du palais dans ROSA26-mTmG flox reporter des embryons. Pour visualiser l'actine filamenteuse, des souris journalistes Lifeact-mRFPruby ont été utilisées. L'imagerie en direct de la fusion palatine secondaire a été réalisée en disséquant des étagères palatins secondaires récemment adhérentes d'embryons de stade embryonnaire (E) 14,5 et de culture dans des milieux contenant de l'agarose sur un plat de verre pour permettre l'imagerie avec un microscope confocal inversé. En utilisant cette méthode, nous avons détecté une variété de nouveaux comportements cellulaires lors de la fusion palatine secondaire. Une appréciation de la façon dont les comportements cellulaires distincts sont coordonnés dans l'espace et le temps contribue grandement à notre compréhension de ce processus morphogénétique dynamique. Ce protocole peut être appliqué à des lignées de souris mutantes ou à des cultures traitées avec des inhibiteurs pharmacologiques afin de mieux comprendre la façon dont la fusion palatine secondaire est contrôlée.
Introduction
La fusion tissulaire est une étape importante dans le développement d'organes multiples. Les principaux défauts de naissance humains tels que la fente de la lèvre et du palais, la spina bifida et les malformations du cœur peuvent résulter de défauts de fusion tissulaire 1 . La fusion secondaire du palais de la souris a été largement étudiée pour identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la fusion tissulaire dans le développement 2 , 3 , 4 . À la souris, le développement secondaire du palais commence à environ E11.5 avec la décroissance d'une étagère palatine secondaire de chacun des processus maxillaires bilatéraux. La croissance initiale des étagères palatines se produit verticalement le long de la langue, jusqu'à environ E14.0, date à laquelle les étagères palatines sont élevées horizontalement au-dessus de la langue. La croissance axée sur la médiation entraîne un contact physique entre l'épithélium des deux étagères palatines, formant l'épithélium de la ligne médianeAl seam (MES) à E14.5. Les MES intermédiaires doivent être éliminés entre les étagères palatines secondaires pour permettre la confluence mésenchymateuse et le développement d'un palais secondaire intact, complètement fusionné par E15.5 3 .
La façon dont une couche cellulaire MES épithéliale partagée est formée entre deux étagères palatines distinctes, puis retirée pour atteindre la confluence mésenchymateuse, a été une question centrale dans le développement du palais. Sur la base d'études de microscopie histologique et électronique à la souris (EM), d'études de culture d'explants et d'expériences génétiques de génétique de souris, plusieurs comportements cellulaires fondamentaux ont été impliqués dans ce processus. Les projections semblables à celles de Filopodia provenant de l'épithélium de bord médian MEE de chaque étagère palatine facilitent le contact initial 5 , 6 , suivie de l'intercalation de ces cellules épithéliales à un MES 6 , 7 partagé. Suppression du MES partagé résultantA été proposé de procéder par trois mécanismes non exclusifs. Les premières études utilisant l'observation histologique et le traçage de lignage ex vivo avec des colorants vitaux ont indiqué que le MES pourrait être éliminé par la transition épithéliale à la mésenchyme (EMT) des cellules MES 8 , 9 , bien que plus récemment, le traçage génétique des cellules épithéliales avait soulevé une incertitude quant à La contribution à long terme des cellules épithéliales au mésenchyme palatins 10 , 11 , 12 . Un nombre important de cellules apoptotiques et une réduction de leur nombre dans certains mutants qui ne subissent pas une fusion appropriée du palais ont conduit à l'idée que l'apoptose peut être un facteur majeur de dissolution MES 2 , 3 . Enfin, basé initialement sur des études portant sur l'étiquetage épithélial et l'observation statique à des points de temps progressifs, les cellules MESOnt été proposés pour migrer dans les dimensions oronasales et antéro-postérieures 11 , 13 , mais ces comportements cellulaires dynamiques étaient initialement non confirmés en raison d'une incapacité à les observer dans le tissu palatal vivant. Récemment, nous avons pu observer directement ces comportements en développant une nouvelle méthodologie d'imagerie en direct qui combine les méthodes génétiques de souris du marquage fluorescent avec l'imagerie radiale confocale des étagères palatines explantées.
Tout d'abord, pour visualiser les comportements cellulaires dynamiques dans les cellules épithéliales du palais lors de la fusion palatine, nous avons généré une souris journalière épithéliale spécifique en traversant des souris ROSA26-mTmG flox avec des souris Keratin14-cre 14 , 15 . L'imagerie confocale en direct de la culture d'explants de palais des embryons résultants a confirmé certains comportements cellulaires précédemment proposés et identifié des événements nouveaux dans le processus de fusion 6 6 , 16 . Cette méthode d'imagerie peut être utilisée avec d'autres lignes de journalistes; Nous avons utilisé des souris transgéniques Lifeact-mRFPruby 17 , 18 pour examiner la dynamique du cytosquelette de l'actine pendant le processus de fusion. D'autres reporters peuvent également être utilisés pour observer d'autres aspects spécifiques de la fusion du palais, et cette méthode peut être adaptée soit à la microscopie confocale à balayage laser, soit à la microscopie confocale, selon les besoins d'imagerie et la disponibilité du microscope. L'imagerie en direct devient de plus en plus une approche clé dans la biologie du développement. PartiEn particulier, la morphogenèse craniofaciale est complexe et les anomalies congénitales humaines qui affectent le visage sont fréquentes. Cette méthode d'imagerie en direct confocal aidera à mieux comprendre les mécanismes fondamentaux de développement de base ainsi que les origines des anomalies craniofaciales humaines.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles de l'Université de Californie au Comité de soins et d'utilisation des animaux institutionnels de San Francisco.
1. Préparation des supports d'imagerie en direct
- Préparation de milieux de culture liquide
- Ajouter 20% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 U / mL de pénicilline, 100 μg / mL de streptomycine, 200 μg / mL d'acide L-ascorbique, 15 mM HEPES à Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 médias.
REMARQUE: le média d'imagerie en direct a été fraîchement préparé avant l'imagerie. Ce média contient du phénol-rouge qui peut conduire à une phototoxicité sur de longues périodes d'imagerie en direct. La substitution des médias sans phénol-rouge peut améliorer l'imagerie à long terme.
- Ajouter 20% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 U / mL de pénicilline, 100 μg / mL de streptomycine, 200 μg / mL d'acide L-ascorbique, 15 mM HEPES à Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 médias.
- Préparation d'une solution d'agarose à bas point de fusion
- Dissoudre 350 mg d'agarose à bas point de fusion dans 10 ml d'eau distillée autoclavée pour obtenir une solution stock de 3,5%.
- Mélanger bien la solution d'agarose et incuber à 70 ° C dans un bain d'eau pour dissoudre complètement l'agarose.
- Refroidir la solution d'agarose dans un bain d'eau à 37 ° C avant de l'ajouter aux milieux d'imagerie en direct.
- Ajouter 1 ml de la solution mère d'agarose à 5 ml du milieu liquide d'imagerie en direct pour obtenir une concentration finale (0,6%).
- Gardez les médias avec de l'agarose dans un bain d'eau à 37 ° C pour éviter une solidification prématurée.
2. Préparation du palais Culture explicative pour l'imagerie en direct
- Dissection des étagères palatines secondaires E14.5 récemment collées
NOTE: Dans notre expérience, la fusion d'imagerie nécessite de commencer par une paire d'étagères palatines légèrement adhérentes; Cette adhérence empêche les mouvements d'explants qui empêchent la fusion de se produire pendant l'imagerie.- Dissectez des embryons de stade E14.5 dans 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS) et choisissez la protéine fluorescente verte (GFP) - exprimant (à partir deK14-cre; ROSA26-mTmG flox ) ou (Red fluorescent protein) RFP-expressing (from Lifeact-mRFPruby ) embryons positifs utilisant un microscope à dissection équipé de lampes fluorescentes. Transférer du tissu sur des milieux de culture d'imagerie en direct préchauffés sans agarose.
- Couper la tête embryonnaire et enlever la partie supérieure du cerveau en utilisant deux pinces fines n ° 5 ( Figure 1 A-C ). Utilisez une pince n ° 5 pour maintenir l'embryon tandis que l'autre pince n ° 5 coupe des tissus supplémentaires à l'extérieur des étagères palatines.
REMARQUE: Des ciseaux fins peuvent être utilisés pour couper la tête d'embryon (la première étape) au lieu d'une pincée n ° 5. Cependant, deux pinces fines n ° 5 donneront un meilleur contrôle pour effectuer des coupes précises. - Retirez la mandibule avec précaution sans endommager les étagères palatines comme indiqué sur la figure 1 D et 1E . Pour réduire les risques de palais endommagants, garder la langue à travers la dissection de la mandibule, fPar un retrait prudent de la langue.
- Après avoir retiré la mandibule et la langue, examinez le côté oral du palais secondaire avec un stéréomicroscope avec fluorescence pour confirmer le signal du journaliste fort dans le MES ( Figure 1 M ).
- Dissection des parties postérieures, y compris le cerveau postérieur et le tronc cérébral après élimination de la mandibule et de la langue ( Figure 1 F ).
- Enlevez les deux maxillaires avec des étagères palatines adhérentes ( Figure 1 G ).
- Couper le tissu de la mâchoire antérieure en gardant le palais primaire et secondaire intact ( Figure 1 H et I ).
- Retirer le septum nasal sur le côté nasal de l'explant exposant le MES.
REMARQUE: Ces étapes ultérieures des dissections nécessitent une attention particulière pour ne pas perturber les contacts entre deux étagères palatines secondaires. L'élimination de la cloison nasale aide àRéduire le signal de fond d'autres zones et réduire également le mouvement vertical des tissus, ce qui permet une image stable ( Figure 1 J-L ). - Après avoir disséqué les étagères palatines, examinez à nouveau le signal du rapporteur de la ligne médiane afin de s'assurer qu'il n'y ait aucun dommage à la couche épithéliale entre les tissus.
- Mise en place d'explants de palais dans un plat de culture avec des supports d'imagerie en direct
- Mettez les supports d'image en live dans un plat inférieur de verre de 35 mm.
- Mettez les tablettes palatines disséquées côté oral vers le bas aussi près du fond de verre que possible pour l'imagerie avec un microscope confocal inversé ( Figure 1 N ).
- Placez des pastilles de glace sèche sur une surface conductrice à proximité du plat de culture pour accélérer la solidification de l'agarose en diminuant rapidement la température ou mettre le plat de culture à 4 ° C. Une plaque froide, comme celle utilisée pour l'incorporation de paraffine, pourrait également être utilisée à cet égardTage.
REMARQUE: Lorsque de la glace carbonique est utilisée, le changement de support d'agarose doit être soigneusement surveillé afin d'éviter tout gel.
3. Confocal Time-lapse Imaging of Palate Explicit
- Imagerie et acquisition de données
- Une fois que l'agarose a été semi-solidifié, montez le plat de culture dans un microscope confocal inversé équipé d'une chambre d'incubation à 37 ° C. Utilisez un microscope confocal à lumière blanche et un microscope confocal à disque tournant d'observateur de cellule.
NOTE: Nous avons utilisé un support modifié contenant HEPES 15 mM sans gaz de CO 2 . - Mettez la vaseline entre le plat de culture et couvrez à l'aide d'une seringue pour éviter l'évaporation des milieux ( Figure 1 N ).
REMARQUE: Une certaine condensation sur le dessus du couvercle du plat de culture après la culture de nuit (O / N) se produit, mais le volume des milieux ne change pas, ce qui suggère que la vaseline absorbe l'évaporation des milieux. - Localisez la région d'intérêt avec des objectifs de faible grossissement (10x) et utilisez des objectifs de grossissement plus élevés (objectif 20x avec zoom numérique 3x ou objectif 40x avec Immersol W) pour l'imagerie en temps réel.
REMARQUE: Les étagères palatines secondaires dissoutes ne sont pas plates. Le palais secondaire est une structure incurvée, ce qui rend difficile l'image de l'ensemble du MES dans le même plan. L'imagerie de faible grossissement (10x) peut permettre l'imagerie du palais entier, mais les objectifs de 40x fourniront une meilleure résolution d'image pour examiner les mouvements cellulaires détaillés dans les positions Z plus profondes. La courbure est élevée dans la région du palais moyen. Le palais antérieur et postérieur est relativement plat par rapport au palais moyen. Nous nous voyons souvent vers le milieu antérieur du palais secondaire pour éviter les régions de plus grande courbure. - Numériser de multiples piles Z avec 5 μm chaque étape pendant 16-24 h en utilisant une excitation laser appropriée (488 nm pour GFP et 532/561 nm pour RFP) ( Figure 2 ).
REMARQUE: Pour réduire la phototoxicité potentielle, utilisez une puissance laser minimale et un temps d'exposition. Ceci est important surtout en cas d'imagerie multicolore. Utilisez 22% de puissance laser de 552 nm pour membraneTomato (mT), 30% de puissance laser 495 nm pour membraneGFP (mG) et 25% de puissance laser de 561 nm pour membraneRFP. Le temps d'exposition moyen était de 550 ms. - Utilisez un logiciel d'analyse d'image pour effectuer un suivi cellulaire et une analyse quantitative.
- Une fois que l'agarose a été semi-solidifié, montez le plat de culture dans un microscope confocal inversé équipé d'une chambre d'incubation à 37 ° C. Utilisez un microscope confocal à lumière blanche et un microscope confocal à disque tournant d'observateur de cellule.
4. Analyse d'image de données
REMARQUE: Ici, Imaris a été utilisé. Des analyses de données similaires peuvent également être effectuées avec les progiciels ImageJ ou Volocity.
- Rendre les surfaces tridimensionnelles (3D) à partir des séquences d'image.
REMARQUE: Cette section permet de générer une surface à partir d'un film généré avec un signal GFP de membrane.- Cliquez sur Modifier | Afficher le réglage de l'affichage et utiliser le curseur d'histogramme pour régler l'intensité du signal afin que le signal de la membrane soit clair à traversSur la durée du film ( Figure 3 A ).
- Corriger le signal blanchi en utilisant Image Traitement | Correction d'atténuation . Réglez les valeurs Intensity Front and Intensity Back pour que le signal de la membrane soit clair pendant toute la durée du film. Un certain essai et une erreur peuvent être nécessaires pour définir ces valeurs.
REMARQUE: la valeur Intensity Back (position Z plus profonde) sera inférieure à la valeur Intensity Front (Surface Z position) en raison de la pénétration laser limitée. Ces valeurs peuvent donc également être modifiées pour normaliser l'intensité du signal dans la série Z. Les deux valeurs peuvent être ajustées pour obtenir une correction de blanchiment. La correction d'atténuation est également appelée correction d'atténuation d'émission 19 . - Pour générer une surface à partir du signal de la membrane, sélectionnez Surpass | Surfaces , choisissez un canal source et un type de seuil (Absolute Intensity) et sous Paramètres Algorithmes seLect Segment uniquement une région d'intérêt Et le processus de l'image entière enfin , puis on clique sur la flèche avant; Continuez à pousser la flèche vers l'avant (utilisez les paramètres par défaut, ou spécifiez les niveaux de détail de surface et la méthode de seuil par essai et erreur), en vérifiant si la surface générée reflète le signal de fluorescence. Pour spécifier une région d'intérêt, sélectionnez région et heure (s) à rendre en recadrage des positions X, Y, Z.
REMARQUE: Sélectionnez Processus de l'image entière enfin afin que les réglages et les seuils soient appliqués sur l'ensemble du film. - Générer une surface en cliquant de nouveau sur le bouton fléché vers l'avant. Ensuite, ajustez le seuil en modifiant l'histogramme dans les Filtres pour correspondre au signal de la membrane.
- Une fois la surface générée, choisissez la surface dans Surfaces / Paramètres pour visualiser le signal de surface et finir le processus de génération de surface en poussant le double forwArd arrow button ( Figure 3 B ).
- Aller à la surface | Modifiez et cliquez sur Masquer tout dans les Propriétés Masque pour générer une image de canal masquée.
- Après avoir cliqué sur OK, la fenêtre Mask Channel s'ouvrira automatiquement; Sélectionnez le canal GFP, définissez les voxels à l'extérieur de la surface jusqu'à la valeur maximale de l'intensité du signal (trouvée dans l' édition | Réglage de l'affichage ) et les voxels à l'intérieur de la surface à la valeur d'intensité GFP minimale (également trouvée dans Modifier | Réglage de l'affichage ), dans Mask Settings pour générer un masque du signal de membrane.
- Comme le masque du signal de membrane sera affiché dans la vue Volume , générez des images inversées en utilisant Image Processing | Changement de contraste | Inverser ( Figure 3 C ).
- Détection de spots à partir d'images de surface inversée.
REMARQUE: cette section permet au centre de chaque cellule d'êtreMarqué d'un point unique et suivi sur l'espace et le temps.- Sélectionnez Surpass Scene | Spots | Créer ; Dans les paramètres d'algorithme, choisissez Segment uniquement une région d'intérêt , Traitement de l'image entière enfin et Points de suivi (au fil du temps) .
- Cliquez sur la flèche vers l'avant et spécifiez une région d'intérêt; Sélectionnez la région et l'heure (s) pour suivre les points; Continuez à pousser la flèche vers l'avant, choisissez le canal masqué comme canal source et déterminez le diamètre XY estimé des points.
- Lorsque vous cliquez sur le bouton fléché vers l'avant, vous ouvrez automatiquement une fenêtre de filtre; Ajustez le seuil de détection de spot en changeant les valeurs dans l'histogramme pour générer des points individuels au centre de chaque cellule ( Figure 3 D ).
- Lorsque vous cliquez à nouveau sur le bouton de la flèche vers l'avant, vous ouvrez la fenêtre Algorithme . Sélectionnez Modèle de suivi de mouvement automatique 20 et spécifiez le suivi maximalLa position et la taille de l'espace maximal pour relier les pistes qui deviennent discontinues pendant une courte période de temps.
- Lorsque vous cliquez de nouveau sur le bouton fléché vers l'avant, vous ouvrez la fenêtre Filtres, définissez le seuil de durée de la piste en ajustant l'histogramme afin que chaque cellule soit renseignée. En cliquant sur le bouton de la double flèche vers l'avant, finaliseront la détection des points.
- Afin de corriger la dérive des tissus, cliquez sur Spots | Track Editor et sélectionnez Correct Drift . Une fenêtre Algorithme s'ouvrira automatiquement; Sélectionnez la dérive translationnelle sélectionnée , incluez le résultat entier et corrigez les positions des objets .
- Générer des diagrammes avantageux pour l'analyse quantitative.
REMARQUE: Le Scatterplot du programme est un outil pour générer des graphiques multidimensionnels (X, Y, Z, Couleur et Échelle) avec plusieurs objets. Ces parcelles sont utiles pour visualiser les tendances de nombreux mouvements cellulaires au fil du temps.- Créez des parcelles 2D ou 3D de données de suivi des cellules en utilisant leVantage-Ajouter un nouveau menu de parcours Vantage ( Figure 3 E et 3F ).
- Sélectionnez le volume ou les points et choisissez Créer / Catégorie et Type de tracé
- Ajustez les valeurs de tracé pour générer différents graphiques de Vantage.
- Exportez des graphiques à l'aide de la fonction Snapshot .
REMARQUE: Les données statistiques peuvent également être exportées en tant que feuille de calcul pour une analyse quantitative supplémentaire en cliquant sur Zone de traçage | Enregistrer .
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Representative Results
L'imagerie vivante de la culture d'explants de palais a révélé de multiples processus cellulaires médiant la fusion du palais 6 . Les contacts initiaux entre deux cellules épithéliales sont réalisés par protrusion membranaire ( figure 2 B-2E ). Lorsque deux couches épithéliales se rencontrent, elles forment une MES multicouches multicouches suivie d'une intercalation pour réaliser une MES intégrée de couche cellulaire unique par convergence épithéliale ( Figure 2 A-2E et Figure 2 K-2O ). Les cellules épithéliales dans les niveaux Z plus profonds sont également progressivement déplacées vers le côté oral du MES contribuant au processus de convergence épithéliale ( figure 2 K ). La migration cellulaire dirigée vers la postérieure a été observée chez le MES du palais moyen ( figure 2 F-2J ). En outre, nous avons trouvé l'ext de cellules épithélialesLes événements de la ruse pendant la fusion du palais suggèrent que les cellules épithéliales dans le MES peuvent être éliminées par ce processus actif ( Figure 2 Q, 2T ). La couture épithéliale intégrée se décompose finalement pour atteindre la confluence mésenchymateuse ( Figure 2 S, 2T ).
Le palais Lifeact-mRFPruby a montré des réarrangements cytosquelettiques dynamiques de l'actine lors de la fusion palatine 6 . L'actine filamenteuse s'est enrichie à la frontière entre les zones épithéliales et mésenchymateuses, formant une structure en forme de câble le long de l'axe antérieur-postérieur ( Figure 2 K-2T) . La contractilité de l'actomyosine entraîne la convergence épithéliale et la rupture du MES car l'inhibition chimique de l'activité myosine ou de la polymérisation de l'actine bloque ces processus dynamiques 6 .
Hin-page = "1"> Le logiciel a été utilisé pour tracer les comportements cellulaires pendant la fusion du palais. La meilleure méthode pour le suivi des cellules dépend du signal du journaliste. Si une souris journaliste nucléaire est utilisée, le programme peut tracer le centre des signaux fluorescents en tant que centres cellulaires 21 . La souris journaliste GFP nucléaire telle que ROSA26 GFP-NLS-lacZ ( GNZ) 22 peut donc être utilisée pour étiqueter des cellules épithéliales en utilisant des lignes creuses spécifiques de tissu; Entre nos mains, ce journaliste nucléaire spécifique a affiché un blanchiment plus rapide sur le long cours utilisé dans l'imagerie en direct. Par conséquent, nous avons utilisé le journaliste membrane-GFP ( ROSA26-mTmG flox ) pour suivre les mouvements des cellules épithéliales dans nos études. Cela nécessitait une méthode pour identifier et tracer des cellules individuelles par un signal de membrane. Pour résoudre ce problème, nous avons utilisé une méthode de suivi de cellules modifiée ( Figure 3 et Protocole section 4 ).
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Figure 1 : Vue schématique de la dissection du palais secondaire par souris. ( A ) Vue latérale de l'embryon de souris E14.5. Pour disséquer les étagères palatines, la tête a été coupée le long de la première ligne pointillée blanche, n ° 1. ( B, C ) Le cerveau supérieur (au-dessus de la deuxième ligne blanche, n ° 2) a été supprimé. ( D, E ) Vue orale de la tête disséquée. La mandibule inférieure (# 3) a été disséquée et la langue (# 4) a été enlevée. ( F ) La partie postérieure de la tête le long de la ligne n ° 5 a été découpée. ( GI ) Les maxillaires (# 6, # 7) et la partie antérieure de la mâchoire supérieure (# 8) ont été enlevés. ( JL ) Le septum nasal (n ° 9) a été supprimé ( M ) GFP signaux dans le MES du palais disséqué à partir d'un K14-cre; ROSA26 mTmG embryon de souris. ( N ) Configuration de l'image en direct. Le côté oral du copainL'explant était confronté à l'imagerie avec un microscope confocal inversé. Le MES est indiqué avec des pointes de flèches blanches ( FI ). La zone imagée est indiquée par des boîtes pointillées en L et M. Barres d'échelle = 2 cm en A, 1 cm en BI, 500 μm en JM. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : imagerie en direct des cultures d'explants de palais. ( AE ) Imagerie en direct du palais secondaire antérieur à partir d'un K14-cre; ROSA26 mTmG explant (5 μm de profondeur). La pointe de flèche blanche montre une protrusion de membrane d'une cellule épithéliale ( FJ ) Imagerie en direct du palais moyen de K14-cre; ROSA26 mTmG explant (5 μm dEpth). Les flèches blanches indiquent la direction des migrations cellulaires du palais antérieur à postérieur. ( KO ) Imagerie en direct du palais antérieur à partir de l'explant Lifeact-mRFPruby (5 μm de profondeur). Déplacement des cellules épithéliales (flèche jaune) sur la surface buccale et la convergence pour former un MES intégré avec des structures d'actine en forme de câble dans la ligne médiane. ( PT ) Imagerie en direct du palais antérieur à partir de l'explant Lifeact-mRFPruby (25 μm de profondeur). La flèche rouge indique un événement d'extrusion de cellule ( Q, T ). Les points de rupture futurs de la couture sont indiqués par deux flèches verticales blanches dans les barres d'échelle S et T. = 20 μm. Toutes les données d'imagerie en direct dans cette figure sont dérivées d'expériences précédemment publiées dans 6 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 3 : Analyse des données. ( AD ) Pour tracer les cellules épithéliales avec des signaux GFP membranaires de K14-cre; ROSA26 mTmG palate explant ( A ), une surface a été générée par le rendu du volume du signal GFP membrane ( B ). Les images inversées ont été générées après avoir masqué la surface créée ( C ). Les centres cellulaires ont été identifiés à partir des images inversées à l'aide d'une fonction de détection de points dans Imaris ( D ). ( E ) Les reconstructions 3D permettent de suivre les mouvements cellulaires dans plusieurs directions. A: antérieure, P: postérieure, N: nasale, O: l'analyse orale ( F ) 2D génère un graphique avantageux montrant les cellules migrant de la direction antérieure à la direction postérieure dans le MES du palais moyen. Barres d'échelle = 20 μm en AD, 10 μm dans EF.S / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Vidéo Figure 1: imagerie en direct de K14-cre; ROSA26-mTmG flox previous palate (5 μm de profondeur). Les images ont été capturées toutes les 10 min (10 min / cadre) pendant 16 h 20 min, Barre d'échelle = 25 μm. Cette vidéo est une position Z différente d'un film précédemment publié dans la référence 6 . Cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)
Vidéo Figure 2: imagerie en direct de K14-cre; ROSA26-mTmG flox Palais moyen (5 μm de profondeur). Les images ont été capturées toutes les 15 min (15 min / cadre) pendant 13 h 30 min, Barre d'échelle = 25 μm. Cette vidéo a déjà été publiée dans la référence 6 . Cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)
Figure 3: imagerie en direct du palais antérieur Lifeact-mRFPruby (5 μm de profondeur).
Les images ont été prises toutes les 10 minutes (10 min / cadre) pendant 7 h 50 min. Barre d'échelle = 20 μm. Cette vidéo a déjà été publiée dans la référence 6 . Cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)
Vidéo Figure 4: imagerie en direct du palais antérieur Lifeact-mRFPruby (25 μm de profondeur).
Les images ont été prises toutes les 10 minutes (10 min / cadre) pendant 7 h 50 min. Barre d'échelle = 20 μm. Cette vidéo est une position Z différente d'un film précédemment publié dans la référence 6 . Cliquez ici pour voir cette vidéo. (Cliquez avec le bouton droit de la souris pour télécharger.)
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Discussion
L'imagerie en direct de la morphogenèse des tissus avec la culture d'explants organiques en 3D peut fournir des informations détaillées concernant les processus cellulaires qui ne peuvent pas être démontrés dans l'analyse de coloration conventionnelle des coupes de tissus fixes. En utilisant la culture d'explants in vitro du palais secondaire embryonnaire de souris, nous avons observé plusieurs comportements cellulaires intéressants qui nous conduisent à proposer un nouveau mécanisme de fusion palatine qui implique la convergence épithéliale et l'extrusion cellulaire.
Un défi commun dans les études de ce type est le décapage photo par des excitations laser continues sur un long cours. Dans nos études, on utilisait un microscope confocal à lumière blanche et un microscope confocal à disque tournant. Une certaine diminution de l'intensité du signal au cours du temps pourrait être corrigée par des corrections de blanchiment dans le logiciel d'imagerie (LAS-AF) (Protocole 4.1). Étant donné que la correction de blanchiment est limitée, il est important d'optimiser soigneusement l'alimentation du laser et le temps d'exposition dans chaque système d'imagerie. Nous avons également vérifiéQue la fusion du palais se produit normalement dans les milieux d'imagerie en direct après une culture de 3 jours 6 .
Un deuxième problème commun dans l'imagerie en direct est la dérive des tissus. Il est essentiel de minimiser la dérive pour obtenir des images cohérentes pendant l'imagerie en direct, car les changements dans le plan focal peuvent confondre une compréhension des changements morphogénétiques au fil du temps. Alors que le contrôle de la dérive thermique peut être réalisé dans de nombreux microscopes confocaux (focalisation définitive au microscope), la dérive du tissu par rapport au fond de verre ne peut être corrigée par ces méthodes. L'utilisation de l'agarose, tout en plaçant l'explant contre le fond de verre, aide à minimiser cela, mais il faut néanmoins s'occuper uniquement pour analyser les films qui maintiennent une position relativement constante. Cela peut être déterminé en suivant plusieurs points de contrôle dans le champ d'imagerie dans le temps pour déterminer s'ils restent constants, se déplacer avec une tendance similaire ou se déplacer différemment. Dans une certaine mesure, l'utilisation de l'utilité post-traitementLes effets permettent une correction d'une dérive tissulaire dans l'imagerie en direct (Protocole 4.2).
L'agarose à bas point de fusion a été utilisé à une concentration finale de 0,6% dans les milieux d'imagerie en direct pour immobiliser les tissus d'explants. Lorsque nous avons testé des concentrations plus élevées d'agarose, elles semblaient affecter la morphogenèse tissulaire en raison de contraintes mécaniques. Il est donc important d'utiliser la concentration d'agarose correcte pour minimiser la dérive des tissus tout en ne perturbant pas la morphogenèse.
En raison de la profondeur d'imagerie confocale, cette méthode pose des limites dans l'examen des plans Z très profonds de la fusion du palais. En utilisant à la fois des microscopes confocaux WHITE LIGHT et des disques de filage, un signal de 100 μm de profondeur pourrait être imaginé avec succès, bien que l'image ait commencé à devenir terne et s'éloigne au-delà de cette limite. Parce que la fusion du palais est un processus progressif dans les axes oronasal et antéro-postérieur, nous proposons que l'imagerie de multiples positions permet effectivement l'imagerie de différents servicesHs de fusion palais, mais une microscopie confocal à deux photons ou à la lumière peut être employée à l'avenir pour améliorer la profondeur de l'imagerie. Dans la plupart de nos expériences, on a imaginé le côté oral des explants du palais. L'imagerie du côté nasal de l'explant de palais est difficile car la cloison nasale est fusionnée ou très proche des étagères palatines secondaires. Dans nos tentatives de fusion de l'image du côté nasal, il était également nécessaire d'enlever le tissu nasal supplémentaire afin qu'il n'interfère pas avec le signal de l'épithélium palaté. Bien que possible, l'imagerie du côté nasal de l'explant du palais était difficile parce que la dissection du septum nasal causait souvent des dommages aux explants du palais.
L'imagerie en direct des explants de tissus de souris rapporteurs est une méthode puissante pour étudier les mécanismes cellulaires de la morphogenèse tissulaire pendant le développement embryonnaire. En utilisant des techniques de microscopie confocale et une analyse quantitative de l'imagerie, des processus de développement basiques tels que la fusion palatine secondaire peuvent êtreA étudié au niveau cellulaire.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions M. Douglas Benson pour des conversations initiales concernant l'imagerie palatine secondaire. Nous reconnaissons également David Castaneda-Castellanos (Leica) et Chris Rieken (Zeiss) pour leur aide pour ajuster les conditions d'imagerie en microscopie confocale. Nous apprécions Lynsey Hamilton (Bitplane) pour des suggestions utiles pour l'analyse d'image quantitative utilisant le logiciel Imaris. Ce travail a été financé par NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
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