Summary
여기, 우리는 공 촛점 현미경을 사용하여 마우스 보조 입천장 융합의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 형광 기자 마우스 라인과 기계적 통찰력을위한 경로 억제제와 함께 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 발달 시스템의 라이브 이미징에 적용 할 수 있습니다.
Abstract
2 차 구개 선반이 융합되어 2 차 구개를 형성하는 것은 포유 동물의 발달 과정에서 중요한 과정이며, 그 파열로 인해 인간의 공통 선천성 기형 인 2 차 구개가 생길 수 있습니다. 이차 미각 융합은 광범위하게 연구되어이 과정을 중재 할 수있는 몇 가지 제안 된 세포 메커니즘을 유도한다. 그러나, 이러한 연구는 개발 도중 또는 고정 된 시점에서 분석 된 고정 된 체외 이식편 배양에서 진보적 인 시점에서 고정 배아 조직에서 주로 수행되었다. 정적 분석은 미각 융합과 같은 동적 인 형태 발생 과정의 분석과 어떤 유형의 동적 세포 행동이 구개 융합을 중재 하는지를 불완전하게 이해하는 데에는 한계가있다. 여기 우리는 마우스 배아에서 생체 내 2 차 구개 융합의 라이브 이미징 프로토콜을 설명합니다. 구개 융합의 세포 행동을 조사하기 위해 상피 특이 적 Keratin14 -cre를 사용하여 ROS의 구개 상피 세포를 표지 하였다A26-mTmG flox 기자 배아. 섬유질 악틴을 시각화하기 위해 Lifeact-mRFPruby 리포터 마우스를 사용했습니다. 이차 구개 융합의 라이브 영상은 배아 일 (E) 14.5 단계 배아의 최근 부착 2 차 구개 선반을 해부하고 거꾸로 공 촛점 현미경으로 이미징을 활성화하기 위해 유리 바닥 접시에 아가로 오스 함유 미디어에서 배양하여 수행되었습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 2 차 구개 융합 동안 다양한 새로운 세포 행동을 발견했습니다. 공간과 시간에 어떻게 구별되는 세포 행동이 조정되는지에 대한 감사는 이러한 동적 형태 형성 과정에 대한 우리의 이해에 크게 기여한다. 이 프로토콜은 돌연변이 마우스 라인, 또는 두 번째 구개 융합이 제어되는 방법에 대한 이해를 진전시키기 위해 약리학 적 억제제로 치료 한 배양 물에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
조직 융합은 여러 장기의 발달에 중요한 단계입니다. 갈라진 입술과 입천장, 척추이 분증과 심장 기형과 같은 주요 인간의 선천적 결손은 조직 융합의 결함으로 생길 수 있습니다 1 . 마우스 2 차 구개 융합은 개발 2 , 3 , 4 에서 조직 융합을 조절하는 세포 및 분자 메커니즘을 확인하기 위해 광범위하게 연구되었습니다. 마우스에서 2 차 구개 발달은 E11.5에서 시작하여 양측 상악골의 각 단계에서 2 차 구개 선반이 형성됩니다. 구개 선반의 초기 성장은 대략 E14.0까지 혀를 따라 수직적으로 발생하며, 이때 구개 선반은 혀 위에서 수평으로 상승합니다. medially-directed growth는 정중선 epitheli를 형성하면서, 두 개의 구개 선반의 apposing epithelia 사이의 물리적 접촉을 가져온다E14.5에서 MES (al seam). 중간 엽 합병과 E15.5에 의한 완전히 융합 된 2 차 구개의 발생을 허용하기 위해 중간 구개 선반 사이에서 중간 MES를 제거해야합니다 3 .
공유 상피 MES 세포층이 2 개의 분리 된 구개 선반 사이에 형성되고,이어서 중간 엽의 confluency를 달성하기 위해 제거되는 방법은 구개 발달에서 중심적인 문제였다. 마우스 histological 및 전자 현미경 (EM) 연구, explant 문화 연구 및 기능 마우스 유전학 실험을 바탕으로, 몇 가지 기본적인 세포 행동이 과정에 연루되었습니다. 각 선반 구개의 내측 가장자리 상피에서 MEE Filopodia 형 돌기는 공유 단일 MES 6,7 이러한 상피 세포의 인터이어서 초기 접촉 (5, 6)을 용이하게한다. 결과 공유 MES 제거세 가지 비 독점적 인 메커니즘으로 진행하도록 제안되었습니다. 조직 학적 관찰과 중요한 염료로 추적 체외 계보를 사용하는 초기 연구는 MES는 MES 세포의 중간 엽 전환 (EMT)로 상피에 의해 제거 될 수 있습니다 8, 9,하지만 최근, 상피 세포의 유전 적 혈통 추적이에 대한 불확실성을 제기했다고 표시 palatal shelf mesenchyme 10 , 11 , 12 에 대한 상피 세포의 장기적인 기여. 현저한 수의 세포 사멸 세포와 적절한 미각 융합을 거치지 못하는 일부 돌연변이 체에서의 세포 수 감소는 세포 사멸이 MES 용해 2 , 3 의 주요 동인이 될 수 있다는 생각으로 이어진다. 마지막으로, 점진적 시점에서 상피 표지 및 정적 관찰을 포함하는 연구에 기초하여, MES 세포구강 및 전후 치수 11 , 13 에서 이동하는 것이 제안되었지만, 이러한 동적 세포 행동은 초기에 생 구개 조직에서 관찰 할 수 없기 때문에 미확인이었다. 최근 우리는 구강 구강 선별의 공 촛점 라이브 영상과 형광 라벨링의 마우스 유전자 방법을 결합한 새로운 라이브 이미징 방법론을 개발함으로써 이러한 행동을 직접 관찰 할 수있었습니다.
첫째, 구개 융합 동안 구개 상피 세포의 동적 세포 행동을 시각화하기 위해, 우리는 Keratin14-CRE 마우스 14, 15 ROSA26 - mTmG flox 마우스를 교차하여 상피 별 기자 마우스를 생성합니다. 결과 배아의 구개 explant 문화의 공 촛점 라이브 이미징 일부 이전에 제안 된 세포 행동을 확인하고 융합 과정 6 에서 새로운 이벤트를 확인 (6), (16)를 운전하는 주요 메커니즘이었다. 이 이미징 방법은 다른 기자 회선과 함께 사용할 수 있습니다. 우리는 융합 과정에서 액틴 세포 골격 역학을 검사하기 위해 Lifeact-mRFPruby 형질 전환 마우스 17 , 18 을 사용했습니다. 다른 기자는 또한 구개 융합의 다른 특정 측면을 관찰하는 데 사용할 수 있으며이 방법은 이미징 요구 및 현미경 가용성에 따라 공 촛점 현미경 검사 또는 회전 디스크 공 촛점 현미경 검사에 맞게 조정할 수 있습니다. 생체 영상은 발달 생물학에서 핵심적인 접근 방법이되고 있습니다. 이상적 상대cularly, craniofacial morphogenesis는 복잡하고 얼굴에 영향을 미치는 인간의 선천적 결함은 일반적입니다. 이 공 촛점 라이브 이미징 방법은 인간의 craniofacial 이상의 기원뿐만 아니라 근본적인 기본 발달 메커니즘의 향상된 이해를 활성화하는 데 도움이됩니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee의 University of California의 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 라이브 영상 미디어 준비
- 액체 배양 배지의 제조
- 20 % FBS (fetal bovine serum), 2 mM L- 글루타민, 100 U / mL 페니실린, 100 μg / mL 스트렙토 마이신, 200 μg / mL L- 아스 코르 빈산, 15 mM HEPES를 더베 페코 수정 이글 배지 (DMEM) / F12 미디어.
참고 : 라이브 이미징 미디어는 이미지 작성 직전에 새로 제작되었습니다. 이 매체에는 페놀 레드가 포함되어있어 오랜 시간 동안 라이브 이미지를 촬영할 때 광독성을 유발할 수 있습니다. 페놀 레드가없는 용지를 대체하면 장기 이미징을 향상시킬 수 있습니다.
- 20 % FBS (fetal bovine serum), 2 mM L- 글루타민, 100 U / mL 페니실린, 100 μg / mL 스트렙토 마이신, 200 μg / mL L- 아스 코르 빈산, 15 mM HEPES를 더베 페코 수정 이글 배지 (DMEM) / F12 미디어.
- 저 융점 아가 로스 용액의 제조
- 저 융점 아가 로스 350 mg을 오토 클레이 빙 된 증류수 10 mL에 녹여 3.5 % 저장 용액으로 만든다.
- 아가로 오스 용액을 잘 섞고 70 ° C에서 항온 배양 한 후 아가로 오스를 완전히 녹입니다.
- 라이브 이미징 미디어에 추가하기 전에 37 ° C 수조에서 아가로 오스 솔루션을 식히십시오.
- 최종 농도 (0.6 %)를 만들기 위해 액체 라이브 이미지 미디어 5 ML에 아가로 오스 주식 솔루션 1 ML을 추가합니다.
- 조기 응고를 방지하기 위해 37 ° C 수조에서 아가로 오스로 미디어를 보관하십시오.
2. 라이브 영상을위한 Palate Explant 문화의 준비
- 최근 부착 된 E14.5 보조 구개 선반의 해부
참고 : 우리의 경험에서 이미징 융합은 약간 접착 된 구개 선반으로 시작해야합니다. 이 순응은 영상화 중에 융합이 일어나지 못하게하는 체외 이식 운동을 방지합니다.- 1x 인산 버퍼 식염수 (PBS)에 E14.5 무대 배아를 해부하고 녹색 형광 단백질 (GFP) - 표현을 선택 (에서K14-cre; ROSA26-mTmG flox ) 또는 (적색 형광 단백질) 형광 램프가 장착 된 해부 현미경을 사용하여 ( Lifeact-mRFPruby ) 양성 배아를 발현하는 RFP. 아가로 오스가없는 예열 된 라이브 이미징 배양 배지로 조직을 옮깁니다.
- 배아 머리를 잘라 두 괜찮아요 5 번 집게 ( 그림 1A - C )를 사용하여 상단 뇌 영역을 제거합니다. 5 번 집게를 사용하여 배아를 잡고 다른 5 번 집게는 구개 선반 밖에서 여분의 조직을 잘라냅니다.
참고 : 미세 가위는 하나의 5 번 집게 대신에 배아 머리 (첫 번째 단계)를자를 수 있습니다. 그러나 2 번 5 번 미세 포셉은 정밀 절단을보다 잘 제어 할 수 있습니다. - 그림 1D 와 1E 와 같이 구개 선반에 손상을주지 않고 신중하게 하악을 제거하십시오. 구개를 손상시킬 가능성을 줄이려면 하악의 절개를 통해 혀를 지키십시오. f혀를 조심스럽게 제거한 후.
- 하악과 혀를 제거한 후, 2 차 구개의 구강 쪽을 형광 현미경으로 검사하여 MES에서 강력한 리포터 신호를 확인합니다 ( 그림 1 M ).
- 하악과 혀를 제거한 후 후뇌와 뇌간을 포함한 후부를 해부합니다 ( 그림 1F ).
- 부착 된 구개 선반이있는 상악을 모두 제거하십시오 ( 그림 1 G ).
- 1 차 및 2 차 구개를 손상시키지 않고 앞쪽에 윗턱 조직을 자릅니다 ( 그림 1 H 및 I ).
- MES를 노출 explant의 비강 측면에 비강 격막을 제거합니다.
참고 : 이러한 해부 단계는 두 개의 2 차 구개 선반 사이의 접촉을 방해하지 않도록 세심한주의가 필요합니다. 비강 중격의 제거는다른 영역에서 백그라운드 신호를 줄이고 수직 조직 운동을 감소시켜 안정적인 이미징을 가능하게합니다 ( 그림 1 J-L ). - 구개 선반을 절개 후, 중간 선 리포터 신호를 다시 조사하여 조직 사이의 상피 층에 손상이 없는지 확인하십시오.
- 라이브 이미지 미디어로 문화 요리에서 입천장 explants 설정
- 라이브 이미지 미디어를 35mm 유리 바닥 접시에 넣으십시오.
- 거꾸로 공 촛점 현미경 ( 그림 1 N )과 이미징을 위해 가능한 유리 바닥에 가까운 해부 구개 선반 구강 측면을 내려 놓으십시오.
- 빠른 속도로 온도를 낮추어 아가로 오스 응고를 촉진 시키거나 4 ° C에서 배양 접시를 넣으려면 배양 접시 근처의 전도성 표면에 드라이 아이스 펠렛을 놓습니다. 파라핀 삽입에 사용되는 것과 같은 차가운 판도이 단계에서 사용할 수 있습니다.tage.
참고 : 드라이 아이스를 사용할 경우 아가로 오스 배지를주의 깊게 모니터링하여 얼지 않는 매체를 방지해야합니다.
3. 구개 제거술의 공 촛점 저속 영상
- 이미징 및 데이터 수집
- 아가로 오스가 반고체화된 후 37 ° C 배양 챔버가 장착 된 거꾸로 공 초점 현미경에 문화 요리를 탑재. 백색광 공 촛점 현미경과 셀 관찰자 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하십시오.
NOTE : 우리는 CO 2 가스가없는 15 mM HEPES를 함유하는 수정 된 배지를 사용했다. - 문화 접시와 코팅 사이에 석유 젤리를 넣어 주사기를 사용하여 미디어 ( 그림 1 N )의 증발을 방지합니다.
참고 : 밤 (O / N) 배양 후 배양 접시 덮개 상단에 약간의 응축이 생기지 만 배지의 양은 바뀌지 않으므로 석유 젤리가 배지가 증발하는 것을 방지합니다. - 저배율 대물 렌즈 (10 배)로 관심 부위를 찾고 저속 라이브 영상을 위해 고배율 대물 렌즈 (3 배 디지털 줌 또는 40 배 대물 렌즈)를 사용하십시오.
참고 : 해부 된 2 차 구개 선반은 평평하지 않습니다. 2 차 미각은 구부러진 구조이기 때문에 동일한 평면에서 전체 MES를 이미지화하는 것을 어렵게 만듭니다. 저배율 (10x) 영상은 전체 구개 영상을 허용 할 수 있지만 40x 대물 렌즈는 더 깊은 영상 자세를 제공하여 더 깊은 Z 위치의 상세한 세포 움직임을 검사합니다. 가운데 구개 영역에서 곡률이 높습니다. 앞뒤 구개는 중간 구개에 비해 상대적으로 평평합니다. 가장 큰 곡률의 영역을 피하기 위해 종종 2 차 구개의 중간 전방을 향해 이미지를 만듭니다. - 적절한 레이저 여기 (GFP의 경우 488 nm 및 RFP의 경우 532/561 nm)를 사용하여 16-24 h 동안 5 μm의 각 단계로 여러 Z 스택을 스캔합니다 ( 그림 2 ).
참고 : 잠재적 인 광독성을 줄이려면 최소한의 레이저 출력과 노출 시간을 사용하십시오. 이것은 특히 멀티 컬러 이미징의 경우에 중요합니다. membraneTomato (mT)에는 552 nm 레이저 파워의 22 %, membraneGFP (mG)에는 495 nm 레이저 파워의 30 %, membraneRFP는 561 nm 레이저 파워의 25 %를 사용하십시오. 평균 노출 시간은 550ms입니다. - 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 세포 추적 및 정량 분석을 수행하십시오.
- 아가로 오스가 반고체화된 후 37 ° C 배양 챔버가 장착 된 거꾸로 공 초점 현미경에 문화 요리를 탑재. 백색광 공 촛점 현미경과 셀 관찰자 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하십시오.
4. 데이터 이미지 분석
참고 : 여기, Imaris가 사용되었습니다. ImageJ 또는 Volocity 소프트웨어 패키지를 사용하여 유사한 데이터 분석을 수행 할 수도 있습니다.
- 이미지 시퀀스에서 3 차원 (3D) 서페이스를 렌더링합니다.
참고 :이 섹션에서는 멤브레인 GFP 신호로 생성 된 동영상에서 서페이스를 생성 할 수 있습니다.- 편집 | 디스플레이 조정을 표시 하고 히스토그램 슬라이더를 사용하여 멤브레인 신호가 투명하게되도록 신호 강도를 조정합니다영화의 길이를 밖으로 (그림 3 A).
- 이미지를 사용하여 표백 한 신호를 수정하십시오. 가공 | 감쇠 보정 . Intensity Front 및 Intensity Back 값을 조정하여 멤브레인 신호가 영화 전체 길이에 걸쳐 선명하게 표시되도록합니다. 이 값을 설정할 때 약간의 시행 착오가 필요할 수 있습니다.
참고 : Intensity Back (Deeper Z 위치) 값은 제한된 레이저 침투로 인해 Intensity Front (표면 Z 위치) 값보다 작습니다. 따라서이 값을 변경하여 Z 시리즈에서 신호 강도를 표준화 할 수도 있습니다. 표백 보정을 달성하기 위해 두 값을 모두 조정할 수 있습니다. 감쇠 보정도 발광 감쇄 보정 (19)라고한다. - 멤브레인 신호에서 서페이스를 생성하려면 Surpass | 표면 , 소스 채널 및 임계 값 유형 (절대 강도)을 선택하고 알고리즘 설정에서강의하다 관심 영역 만 분할 마지막으로 전체 이미지를 처리 한 다음 앞으로 화살표를 클릭합니다. 생성 된 표면이 형광 신호를 반영하는지 확인하면서 앞으로 화살표를 계속 누르고 (기본 설정을 사용하거나 표면적 세부 수준 및 임계 값 방법을 시행 착오로 지정). 관심 영역을 지정하려면 X, Y, Z 위치를 자르기하여 렌더링 할 영역과 시간을 선택하십시오.
참고 : 선택 최종적으로 전체 이미지 를 조정하여 조정 및 임계 값이 전체 영화에 적용됩니다. - 앞으로 화살표 버튼을 다시 클릭하여 서페이스를 생성합니다. 멤브레인 신호에 해당하는 Filters 의 히스토그램을 변경하여 임계 값을 조정하십시오.
- 서페이스가 생성 된 후 서페이스 / 설정에서 서페이스를 선택하여 서페이스 신호를 시각화하고 double forw를 밀고 서페이스 생성 프로세스를 마칩니다.ARD 화살표 버튼 (도 3 B).
- 표면으로 이동 | 편집 을 클릭하고 마스크 속성 에서 모두 마스크를 클릭하여 마스크 된 채널 이미지를 생성합니다.
- 확인을 클릭하면 마스크 채널 창이 자동으로 열립니다. GFP 채널을 선택하고 서페이스 외부의 보셀을 최대 신호 강도 값 ( 편집 | 디스플레이 조정에 있음 )으로 설정하고 표면 안의 보셀을 최소 GFP 강도 값 ( 편집 | 디스플레이 조정 ) 마스크 설정 에서 멤브레인 신호의 마스크를 생성합니다.
- 멤브레인 신호의 마스크가 볼륨 보기에 표시되므로 이미지 처리 | 대비 변경 | 반전 ( 그림 3 C ).
- 거꾸로 된 표면 이미지에서 스폿 감지.
참고 :이 섹션에서는 각 셀의 가운데가고유 한 지점으로 표시되고 시공간을 추적합니다.- 능가 장면 선택 | 명소 | 만들기 ; 알고리즘 설정 에서 관심 영역 만 세그먼트로 구분하고 전체 이미지 처리를 마침내 하고 시간 경과에 따라 추적 점을 선택하십시오 .
- 앞으로 화살표를 클릭하고 관심 지역을 지정하십시오; 지역 및 시간을 선택하여 관광 명소를 추적하십시오. 앞으로 화살표를 계속 누르고 소스 채널로 마스킹 된 채널을 선택하고 스폿의 추정 된 XY 지름을 결정합니다.
- 앞으로 화살표 버튼을 클릭하면 필터 창이 자동으로 열립니다. 히스토그램의 값을 변경하여 각 셀의 중앙에 단일 스폿을 생성함으로써 스폿 감지 임계 값을 조정하십시오 ( 그림 3 D ).
- 앞으로 화살표 버튼을 다시 클릭하면 알고리즘 창이 열리 며, 자동 회귀 모션 추적 모델 20을 선택하고 최대 추적 di를 지정하십시오.자세 및 짧은 간격으로 불연속이되는 트랙을 연결하는 데 필요한 최대 간격 크기입니다.
- 앞으로 화살표 버튼을 다시 클릭하면 필터 창이 열리므로 모든 셀이 추적되도록 히스토그램을 조정하여 트랙 지속 시간 임계 값을 설정하십시오. 이중 앞으로 화살표 버튼을 클릭하면 스폿 감지가 완료됩니다.
- 조직 표류를 수정하려면 Spot | Track Editor 를 선택하고 Correct Drift를 선택 하십시오 . 알고리즘 창이 자동으로 열립니다. Translational drift, 전체 결과 포함 및 오브젝트 위치 정정을 선택하십시오 .
- 정량 분석을위한 유리한 플롯 생성.
참고 :이 프로그램의 분산 형 (Scatterplot)은 여러 객체로 구성된 다차원 (X, Y, Z, 색상 및 크기) 그래프를 생성하는 도구입니다. 이 플롯은 시간이 지남에 따라 많은 셀 이동의 경향을 보는 데 유용합니다.- 셀 추적 데이터의 2D 또는 3D 플롯 만들기Vantage-New Vantage 플롯 메뉴를 추가 합니다 ( 그림 3 E 및 3F ).
- 볼륨 또는 스폿 선택 및 생성 / 카테고리 및 플롯 유형 선택
- 다른 Vantage 그래프를 생성하려면 Plot Values 를 조정하십시오.
- 스냅 샷 기능을 사용하여 그래프를 내 보냅니다 .
참고 : 통계 데이터는 Plot Numbers Area |를 클릭하여 추가 정량 분석을위한 스프레드 시트로 내보낼 수도 있습니다. 저장하십시오 .
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Representative Results
구개 제거 (explant) 배양의 라이브 영상으로 미각 융합을 매개하는 여러 세포 과정이 밝혀졌습니다 6 . 두 개의 상피 세포 사이의 초기 접촉은 막 돌출부에 의해 이루어진다 ( 그림 2 B-2E ). 두 개의 상피 세포가 만났을 때 상피 수렴을 통해 통합 된 단일 세포층 MES를 만들기 위해 인터 셀 레이션 (intercalation)을 거친 다중 세포층 MES를 형성한다 ( 그림 2A-2E 및 그림 2K-2O ). 더 깊은 Z 수준의 상피 세포는 점진적으로 상피 수렴 과정에 기여하는 MES의 구강 측으로 옮겨진다 ( 그림 2 K ). 후 향적 세포 이동은 중간 구개 MES에서 관찰되었다 ( 그림 2 F-2J ). 또한, 우리는 상피 세포 extMES의 상피 세포가이 활성 과정 ( 그림 2 Q, 2T )에 의해 제거 될 수 있다는 것을 의미하는 구개 융합 동안 rusion 이벤트. 통합 상피 이음새는 궁극적으로 중간 엽의 confluency를 달성하기 위해 분해 될 것이다 ( 그림 2S, 2T ).
Lifeact-mRFPruby 구개는 구개 융합 6 중에 동적 액틴 세포 골격 재 배열을 보여 주었다. Filamentous actin은 전후 축을 따라 케이블과 같은 구조를 형성하는 상피와 중간 엽 사이의 경계에서 풍부하게되었다 ( 그림 2 K-2T) . 액토 마이 오신 수축력 드라이브 상피 수렴 및 MES 파손은 미오신 활동 또는 액틴 중합 중 화학 억제 이러한 동적 공정 6을 차단하기 때문이다.
hin-page = "1"> 소프트웨어는 구개 융합 동안 세포 행동을 추적하는 데 사용되었습니다. 세포 추적을위한 가장 좋은 방법은 리포터 신호에 달려 있습니다. 핵 리포터 마우스가 사용된다면, 프로그램은 형광 신호의 중심을 세포 중심 21 로 추적 할 수 있습니다. 따라서 ROSA26 GFP-NLS-lacZ ( GNZ) 22 와 같은 핵 GFP 리포터 마우스를 사용하여 조직 특이 적 Cre 라인을 사용하여 상피 세포를 표지 할 수 있습니다. 우리의 손에는이 특정 핵 리포터가 실시간 이미징에서 사용 된 긴 시간 코스보다 더 빠른 표백을 보였다. 따라서, 우리는 막 GFP 리포터 ( ROSA26-mTmG flox )를 이용하여 우리 연구의 상피 세포 이동을 추적했다. 이것은 막 신호에 의해 개별 세포를 확인하고 추적하는 방법을 필요로했다. 이 문제를 해결하기 위해 수정 된 셀 추적 방법을 사용했습니다 ( 그림 3 및 프로토콜 섹션 4 ).
content "fo : keep-together.within-page ="1 ">
그림 1 : 마우스 보조 구개 해부의 도식보기. ( A ) E14.5 마우스 배아의 측면도. 구개 선반을 해부하기 위해, 머리는 첫 번째 흰 점선 # 1을 따라 자른다. ( B, C ) 두뇌 선 (두 번째 흰 선 위로 # 2)이 제거되었습니다. ( D, E ) 해부 된 머리의 경구. 하부 하악골 (# 3)을 해부하고 혀 (# 4)를 제거했습니다. ( F ) 라인 # 5를 따르는 머리의 후방 부분이 절단되었다. ( GI ) 상악골 (# 6, # 7)과 상턱의 앞부분 (# 8) 모두 제거 하였다. ( JL ) 비강 중격 (# 9) 제거 ( M ) K14 - cre 에서 해부 구개의 MES에 GFP 신호 ; ROSA26 mTmG 마우스 배아. ( N ) 라이브 이미징 설정. 그 친구의 구강 쪽먹은 explant 다운 거꾸로 공 촛점 현미경으로 몇 군데에 직면했다. MES는 흰색 화살촉 ( FI )으로 표시됩니다. 촬영 영역은 L 및 M의 흰색 점선으로 표시됩니다. 눈금 막대 = A가 2 cm, BI가 1 cm, JM이 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 구개 explant 문화의 라이브 이미징. ( AE ) K14-cre 로부터의 전방 2 차 구개의 라이브 영상 ; ROSA26 mTmG 체외 이식편 (5 μm 깊이). 흰색 화살표는 상피 세포 ( FJ )에서 막 돌출을 보여줍니다 K14-cre 에서 중간 구개의 라이브 영상 ; ROSA26 mTmG 체외 이식편 (5 μm d깊이). 흰색 화살표는 전치부에서 후부 입천장으로 이동하는 세포의 방향을 나타냅니다. ( KO ) Lifeact-mRFPruby 체외 이식편 (5 μm 깊이)에서 전 구개를 라이브 영상. 상피 세포의 구강 표면으로의 변위 (노란색 화살표) 및 정중선에서 케이블과 같은 액틴 구조를 갖는 통합 된 MES를 형성하는 수렴. ( PT ) Lifeact-mRFPruby 체외 이식편 (25 μm 깊이)에서 전 구개의 라이브 영상. 빨간색 화살표는 셀 압출 이벤트 ( Q, T )를 나타냅니다. 이음새의 미래 파손 지점은 S 및 T에서 두 개의 수직 흰색 화살표로 표시됩니다. 스케일 막대 = 20 μm. 이 그림의 모든 라이브 이미징 데이터는 이전에 6 에서 게시 된 실험에서 파생되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
-page = "1"> 
그림 3 : 데이터 분석. ( AD ) K14-cre 에서 막 GFP 신호로 상피 세포를 추적하려면 ; ROSA26 mTmG 구개 제거 ( A ), 멤브레인 GFP 신호 ( B )의 볼륨 렌더링에 의해 표면이 생성되었습니다. 생성 된 표면을 마스킹 한 후 반전 된 이미지가 생성되었습니다 ( C ). Imaris ( D )에서 반점 검출 기능을 사용하여 거꾸로 된 이미지로부터 세포 중심을 확인 하였다. ( E ) 3 차원 재구성을 통해 여러 방향으로 세포 이동을 추적 할 수 있습니다. A : 전방, P : 후부는, N은 : 비강, O : 경구 (F) 2 차원 분석은 중간 구개 MES의 방향 전치부에서 이전 셀을 나타내는 유리한 플롯을 생성한다. 스케일 바 = AD 20 μm, EF 10 μm.s / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 그림 1 : K14-cre 의 라이브 이미징 ; ROSA26-mTmG flox 전치 구개 (5 μm 깊이). 10 분 (10 분 / 프레임)마다 16 시간 20 분 동안 이미지를 캡처하고, 스케일 막대 = 25 μm. 이 비디오는 이전에 참고 문헌 6 에 게시 된 영화의 Z 위치가 다릅니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 다운로드하십시오.)
비디오 그림 2 : K14-cre 의 라이브 이미징 ; ROSA26-mTmG flox 중간 미각 (5 μm 깊이). 13 시간 30 분 동안 Scale bar = 25 μm에서 15 분 간격으로 이미지를 촬영했습니다 (15 분 / 프레임). 이 비디오는 참조 자료 6 에서 이미 출판되었습니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 다운로드하십시오.)
비디오 그림 3 : Lifeact-mRFPruby 전 구개 (5μm 깊이)의 라이브 이미징.
이미지를 10 분마다 (10 분 / 프레임) 7 시간 50 분 동안 촬영했습니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 비디오는 참조 자료 6 에서 이미 출판되었습니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 다운로드하십시오.)
비디오 그림 4 : Lifeact-mRFPruby 전 구개 ( 25μm 깊이)의 라이브 이미징.
이미지를 10 분마다 (10 분 / 프레임) 7 시간 50 분 동안 촬영했습니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 비디오는 이전에 참고 문헌 6 에 게시 된 영화의 Z 위치가 다릅니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 다운로드하십시오.)
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Discussion
3D 장기 explant 문화와 조직 morphogenesis의 라이브 이미징 고정 조직 섹션의 기존 얼룩 분석에 표시 할 수없는 세포 프로세스에 관한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다. 생쥐의 배아 이차 배뇨의 생체 외편 배양 배지를 사용하여 우리는 상피 융합과 세포 압출을 포함하는 구개 융합의 새로운 메커니즘을 제안하기 위해 몇 가지 흥미로운 세포 행동을 관찰했다.
이러한 유형의 연구에서 공통적으로 직면하는 문제 중 하나는 오랜 시간 동안 지속적으로 레이저를 여기시켜 광 표백을하는 것입니다. 우리의 연구에서 백색광 공 촛점 및 회전 디스크 공 촛점 현미경이 사용되었습니다. 시간 경과에 따른 신호 강도의 감소는 이미징 소프트웨어 (LAS-AF)에서 표백 보정을 통해 교정 할 수 있습니다 (프로토콜 4.1). 표백 보정은 제한적이므로 각 이미징 시스템에서 레이저 출력과 노출 시간을 신중하게 최적화하는 것이 중요합니다. 우리는 또한 확인했다.그 구개 융합 3 일 문화 (6) 후 라이브 영상 매체에서 일반적으로 발생합니다.
생체 영상의 두 번째 공통적 인 문제는 조직 표류입니다. 초점 평면의 변화는 시간이 지남에 따라 형태 발생 변화의 이해를 혼란스럽게 할 수 있기 때문에 라이브 이미징 중에 일관된 이미지를 얻기 위해 드리프트를 최소화하는 것이 중요합니다. 열 드리프트를 제어하는 것이 많은 공 초점 현미경 (현미경의 명확한 초점)에서 달성 될 수있는 반면, 유리 바닥에 대한 조직의 표류는 이러한 방법으로 교정 될 수 없다. 아가로 오스의 활용과 유리 바닥에 대한 체외 이식편의 배치는이 현상을 최소화하는 데 도움이되지만 상대적으로 일정한 위치를 유지하는 영화를 분석하는 데에만주의를 기울여야합니다. 이는 시간 경과에 따라 이미징 필드의 여러 제어점을 따라 가면서 일정한 상태로 유지되는지, 유사한 경향으로 이동할지 또는 다르게 이동 할지를 결정함으로써 결정할 수 있습니다. 어느 정도까지는 후 처리 fu를 사용합니다.조절은 라이브 영상 (Protocol 4.2)에서 약간의 조직 표류를 수정할 수있게합니다.
explant 조직을 고정하기 위해 라이브 이미징 미디어에서 저 융점 아가로 오스를 최종 농도 0.6 %로 사용했습니다. 우리가 더 높은 농도의 아가로 오스를 시험 할 때, 기계적 제약으로 인해 조직 형태 형성을 손상시키는 것으로 보였다. 그러므로 형태 형성을 방해하지 않으면 서 조직 표류를 최소화하기 위해 정확한 아가로 오스 농도를 사용하는 것이 중요합니다.
공 초점 이미징 깊이로 인해,이 방법은 구개 융합의 매우 깊은 Z 평면을 검사하는 데 한계가 있습니다. WHITE LIGHT와 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여 100μm 깊이의 신호를 성공적으로 이미지화 할 수 있었지만 이미지가이 한계를 넘어 흐릿하고 희미 해지기 시작했습니다. 구개 융합은 구강 및 전후 축에서 점차적 인 과정이기 때문에 다중 위치를 영상화하면 효과적으로 다른 부서의 영상을 얻을 수 있다고 제안한다hs의 입천장 융합이 있지만, 2 광자 또는 가벼운 시판 공 촛점 현미경 검사법을 사용하여 영상의 깊이를 향상시킬 수 있습니다. 우리의 실험의 대부분에서, 구개 외식의 구강 측면이 이미징되었다. 비강 중격이 융합되었거나 2 차 구개 선반에 매우 가깝기 때문에 구개 제거술의 비강면을 영상화하는 것은 어렵습니다. 코 측면에서 융합을 이미지화하려는 우리의 시도에서 구강 상피로부터의 신호를 방해하지 않도록 여분의 비강 조직을 제거하는 것이 또한 필요했습니다. 가능할지라도, 비강 격막의 해부가 종종 구개 변형에 손상을 입히기 때문에 구개 외식 편의 비강면을 영상화하는 것이 어려웠습니다.
기자 마우스 조직 explants의 라이브 이미징은 배아 개발하는 동안 조직 morphogenesis의 세포 메커니즘을 연구하는 강력한 방법입니다. 공 초점 현미경 기법과 정량적 이미징 분석을 사용하여 2 차 구개 융합과 같은 기본적인 발달 과정을세포 수준에서 조사.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
2 차 구개 영상에 관한 초기 대화에 M. Douglas Benson에게 감사드립니다. 공 촛점 현미경 검사에서 이미징 조건을 조정하는 데 도움을 준 David Castaneda-Castellanos (Leica)와 Chris Rieken (Zeiss)도 인정합니다. 우리는 Lynsey Hamilton (Bitplane)에게 Imaris 소프트웨어를 사용하여 정량적 이미지 분석을위한 유용한 제안을 해주었습니다. 이 작품은 NIH / NIDCR R01 DE025887에 의해 재정 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
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