Summary
Здесь мы представляем протокол для визуализации живого изображения вторичного слияния мыши с использованием конфокальной микроскопии. Этот протокол можно использовать в сочетании с различными линиями флуоресцентных репортерных мышей, а также с ингибиторами пути для механистической проницательности. Этот протокол может быть адаптирован для живых изображений в других системах развития.
Abstract
Слияние вторичных небных стеллажей с образованием неповрежденного вторичного неба является ключевым процессом развития млекопитающих, и его разрушение может привести к расселению вторичного неба, общей врожденной аномалией у людей. Вторичный синтез неба широко изучен, что приводит к нескольким предложенным клеточным механизмам, которые могут опосредовать этот процесс. Однако эти исследования в основном проводились на фиксированных эмбриональных тканях в прогрессивные моменты времени во время развития или в фиксированных культурах эксплантатов, проанализированных в статические моменты времени. Статический анализ ограничен для анализа динамических морфогенетических процессов, таких как слияние неба, и какие типы динамического клеточного поведения опосредуют небное слияние, не полностью поняты. Здесь мы опишем протокол для реального изображения ex vivo вторичного слияния неба в эмбрионах мыши. Чтобы исследовать клеточное поведение слияния неба, эпителиальноспецифический кератин- 14 был использован для маркировки эпителиальных клеток неба в ROSА26-mTmG FLOX репортер эмбрионов. Для визуализации нитчатого актина использовались репортерные мыши Lifeact-mRFPruby . Живую визуализацию вторичного слияния неба проводили, рассекая недавно прикрепленные вторичные небные полки эмбриональных эмбрионов зародышевого дня (E) 14,5 и культивируя в агарозосодержащих средах на стеклянной донной тарелке, чтобы обеспечить визуализацию с помощью инвертированного конфокального микроскопа. Используя этот метод, мы обнаружили множество новых сотовых форм при вторичном слиянии неба. Понимание того, как четкое поведение клеток координируется в пространстве и времени, значительно способствует пониманию этого динамического морфогенетического процесса. Этот протокол может быть применен к мутантным линиям мыши или культурам, обработанным фармакологическими ингибиторами, для дальнейшего понимания того, как контролируется вторичное слияние неба.
Introduction
Слияние тканей является важным шагом в развитии нескольких органов. Основные дефекты врожденного порока человека, такие как расщелина губы и неба, расщепление позвоночника и мальформации сердца, могут быть результатом дефектов в тканевом слиянии 1 . Мышцы вторичного слияния неба широко изучались для идентификации клеточных и молекулярных механизмов, контролирующих слияние тканей в развитии 2 , 3 , 4 . У мышей развитие вторичного неба начинается примерно в районе E11.5 с выростом вторичного небного шельфа от каждого из двусторонних верхнечелюстных процессов. Первоначальный рост небных полков происходит вертикально вдоль языка, до приблизительно E14.0, и в это время небные полки поднимаются горизонтально над языком. Медиально-направленный рост приводит к физическому контакту между прилегающим эпителием двух небных полочек, образуя эпителий средней линииАль-шва (МЧС) в Е14.5. Промежуточный МЭС должен быть удален из вторичных небных стеллажей, чтобы обеспечить мезенхимальное слияние и развитие неповрежденного, полностью слитого вторичного неба по E15.5 3 .
Как общий слой эпителиальных клеток MES образуется между двумя отдельными небными полками, а затем удаляется для достижения мезенхимальной слияния, был основным вопросом развития неба. Основываясь на исследованиях гистологической и электронной микроскопии мыши (ЭМ), исследованиях культивирования эксплантатов и экспериментов по генетической генетике мыши, в этом процессе участвовали несколько фундаментальных типов клеток. Филоподийные проекции из медиального краевого эпителия MEE каждого небного шельфа облегчают начальный контакт 5 , 6 , а затем интеркаляцию этих эпителиальных клеток в общую единицу MES 6 , 7 . Удаление итоговой общей MESБыло предложено использовать три неэксклюзивных механизма. Ранние исследования с использованием гистологического наблюдения и трассировки линии ex vivo с использованием жизненно важных красителей показали, что МЭС может быть удалена эпителиальным путем к мезенхимному переходу (ЕМТ) клеток MES 8 , 9 , хотя в последнее время генетическое отслеживание линий эпителиальных клеток вызывает неопределенность в отношении Долгосрочный вклад эпителиальных клеток в меланиму небной полки 10 , 11 , 12 . Значительное количество апоптотических клеток и уменьшение их числа у некоторых мутантов, которые не проходят надлежащего слияния неба, привели к мысли, что апоптоз может быть основным фактором растворения МЭС 2 , 3 . Наконец, основываясь первоначально на исследованиях, связанных с эпителиальной маркировкой и статическим наблюдением в прогрессивные моменты времени, клетки MESБыли предложены мигрировать в орональном и переднезаднем размерах 11 , 13 , но такое динамическое поведение клеток первоначально было неподтвержденным из-за невозможности наблюдать их в живой небной ткани. Недавно мы смогли непосредственно наблюдать это поведение, разработав новую технологию визуализации изображений, которая сочетает в себе генетические методы мыши с флуоресцентной маркировкой с конфокальной жировой визуализацией эксплантированных небных стеллажей.
Во-первых, для визуализации динамического клеточного поведения в эпителиальных клетках неба во время слияния неба мы создали эпителиальную репортерную мышь, пересекая мышей ROSA26-mTmG flox с мышами 14 , 15 Keratin14-cre . Конфокальные живые изображения культивирования неба в результате образования эмбрионов подтвердили некоторые ранее предложенные клеточные поведения и выявили новые события в процессе слияния 6 6 , 16 . Этот метод визуализации можно использовать с другими линиями репортера; Мы использовали трансгенные мыши Lifeact-mRFPruby 17 , 18 для изучения динамики цитоскелета актина во время процесса слияния. Другие репортеры могут также использоваться для наблюдения за другими конкретными аспектами слияния неба, и этот метод может быть адаптирован как к лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, так и к конфокальной микроскопии спиннингового диска в зависимости от потребностей в изображении и доступности микроскопа. Живое изображение все чаще становится краеугольным подходом в биологии развития. ПартиCularly, черепно-лицевой морфогенез является сложным, и человеческие врожденные дефекты, которые влияют на лицо, являются общими. Этот конфокальный живой метод визуализации поможет улучшить понимание основных основных механизмов развития, а также истоков черепно-лицевых аномалий человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами Калифорнийского университета в Институте по уходу за животными и использованию в Сан-Франциско.
1. Подготовка живых изображений
- Получение жидкой культуральной среды
- Добавить 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 мкг / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 200 мкг / мл L-аскорбиновой кислоты, 15 мМ HEPES до модифицированной по Дульбекко среды орла (DMEM) / F12 СМИ.
ПРИМЕЧАНИЕ. Живые видеоизображения были свежеприготовлены непосредственно перед визуализацией. Эта среда содержит фенол-красный цвет, который может привести к фототоксичности в течение длительных курсов живой визуализации. Подмена для среды без фенол-красного может улучшить долговременную визуализацию.
- Добавить 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 мкг / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 200 мкг / мл L-аскорбиновой кислоты, 15 мМ HEPES до модифицированной по Дульбекко среды орла (DMEM) / F12 СМИ.
- Получение низкоплавкого раствора агарозы
- Растворить 350 мг легкоплавкой агарозы в 10 мл автоклавированной дистиллированной воды с получением 3,5% исходного раствора.
- Хорошо перемешать раствор агарозы и инкубировать при 70 ° С на водяной бане для полного растворения агарозы.
- Охладите раствор агарозы на водяной бане на 37 ° C, прежде чем добавлять его в живую среду для визуализации.
- Добавьте 1 мл исходного раствора агарозы в 5 мл жидкой живой среды для получения конечной концентрации (0,6%).
- Держите носитель с агарозой в водяной бане на 37 ° C, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание.
2. Подготовка культивирования беспозвоночных для живых изображений
- Рассечение недавно прилегающих E14.5 вторичных небных полочек
ПРИМЕЧАНИЕ. В нашем опыте слияния изображений необходимо начинать с слегка прилипшей пары небных полочек; Эта приверженность предотвращает движения эксплантатов, которые предотвращают возникновение слияния во время визуализации.- Рассеивайте эмбрионы стадии E14.5 в 1x забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) и выберете зеленый флуоресцентный белок (GFP) -выражение (изК14-CRE; ROSA26-mTmG flox ) или (красный флуоресцентный белок) RFP-экспрессирующие (от Lifeact-mRFPruby ) положительные эмбрионы с использованием рассекающего микроскопа, снабженного люминесцентными лампами. Перенесите ткань в предварительно нагретую живую культуру для визуализации без агарозы.
- Вырежьте головку эмбриона и удалите верхнюю область головного мозга, используя два штрафных пинцета № 5 ( рисунок 1 A-C ). Используйте один пинцет № 5, чтобы удерживать эмбрион, в то время как другие щипцы № 5 вырезали лишнюю ткань за пределами небных полков.
ПРИМЕЧАНИЕ. Тонкие ножницы можно использовать для резки головки эмбриона (первый шаг) вместо одного щипца № 5. Тем не менее, два штрафных щипца № 5 будут лучше контролировать точные сокращения. - Удалите мандибулу осторожно, не повреждая небные полки, как показано на рисунке 1 D и 1E . Чтобы уменьшить вероятность повреждения неба, держите язык через рассечение нижней челюсти, fОслепленный тщательным удалением языка.
- После удаления нижней челюсти и языка исследуйте оральную сторону вторичного неба стереомикроскопом с флуоресценцией для подтверждения сильного репортерного сигнала в MES ( рисунок 1 M ).
- Вырезать задние части, включая задний мозг и мозговой шток, после удаления нижней челюсти и языка ( рисунок 1 F ).
- Удалите обе шеи с прикрепленными небными полками ( рис. 1 G ).
- Отрежьте переднюю верхнюю ткань челюсти, сохраняя как первичное, так и вторичное нёбо неповрежденное ( рис. 1 H и I ).
- Удалите носовую перегородку на носовой стороне эксплантов, подвергая воздействию МЧС.
ПРИМЕЧАНИЕ. Эти последующие шаги вскрытия требуют пристального внимания, чтобы не нарушать контакты между двумя вторичными небными полками. Удаление носовой перегородки помогаетУменьшить фоновый сигнал из других областей, а также уменьшить вертикальное перемещение ткани, что обеспечивает стабильную визуализацию ( рисунок 1 J-L ). - После рассечения небных стеллажей снова исследуйте сигнал репортера средней линии, чтобы убедиться, что между тканями нет повреждений эпителиального слоя.
- Создание эксплантатов неба в культуральной посуде с живыми изображениями
- Поместите живые изображающие среды в 35-миллиметровое стекло.
- Положите расчлененные небные стеллажи оральной стороной вниз, как можно ближе к стеклянному дну, чтобы визуализировать с помощью перевернутого конфокального микроскопа ( рисунок 1 N ).
- Поместите гранулы сухого льда на проводящую поверхность рядом с культуральной чашкой, чтобы ускорить затвердевание агарозы, быстро уменьшив температуру или положив культуральную чашку при 4 ° C. Для этого также можно использовать холодную пластину, например, используемую для вставки парафиновТаге.
ПРИМЕЧАНИЕ. Когда используется сухой лед, необходимо тщательно контролировать изменение агарозной среды, чтобы предотвратить замораживание среды.
3. Конфокальное визуальное изображение неба
- Сбор изображений и данных
- После того, как агароза была полутвердой, установите культуральную чашку в перевернутом конфокальном микроскопе, оснащенном камерой инкубации 37 ° C. Используйте конфокальный микроскоп с белым светом и конфокальный микроскоп сотового диска.
ПРИМЕЧАНИЕ. Мы использовали модифицированную среду, содержащую 15 мМ HEPES без газа CO 2 . - Поместите вазелин между блюдом культуры и крышкой с помощью шприца, чтобы предотвратить испарение среды ( рисунок 1 N ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Некоторая конденсация поверх крышки культуральной посуды после ночной (O / N) культуры происходит, но объем среды не изменяется, указывая на то, что вазелин предотвращает испарение среды. - Найдите интересующую область с небольшими объектами увеличения (10x) и используйте более высокие цели увеличения (20-кратная цель с 3-кратным цифровым зумом или 40-кратная цель с Immersol W) для визуализации в реальном времени.
ПРИМЕЧАНИЕ. Вырезанные вторичные небные полки не плоские. Второе небо - изогнутая структура, и это затрудняет изображение всего МЧС в одной плоскости. Изображения с малым увеличением (10x) могут обеспечить полное изображение неба, но 40-процентная задача обеспечит лучшее разрешение изображения для изучения подробных клеточных движений в более глубоких положениях Z. Кривизна высока в области среднего неба. Переднее и заднее неба относительно плоские по сравнению со средним небом. Мы часто обращаем внимание на середину впереди вторичного неба, чтобы избежать областей наибольшей кривизны. - Сканирование нескольких Z-стеков с шагом 5 мкм на каждый шаг в течение 16-24 часов с использованием надлежащего лазерного возбуждения (488 нм для GFP и 532/561 нм для RFP) ( рисунок 2 ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы уменьшить потенциальную фототоксичность, используйте минимальную мощность лазера и время экспозиции. Это особенно важно в случае многоцветной визуализации. Используйте 22% мощности лазера на 552 нм для мембраны Tomato (мТ), 30% энергии лазерного излучения 495 нм для мембранного GFP (mG) и 25% мощности лазера на 561 нм для мембраны RFP. Среднее время экспозиции составляло 550 мс. - Используйте программное обеспечение для анализа изображений для отслеживания клеток и количественного анализа.
- После того, как агароза была полутвердой, установите культуральную чашку в перевернутом конфокальном микроскопе, оснащенном камерой инкубации 37 ° C. Используйте конфокальный микроскоп с белым светом и конфокальный микроскоп сотового диска.
4. Анализ изображения данных
ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь использовался Имарис. Подобный анализ данных также может быть выполнен с помощью программных пакетов ImageJ или Volocity.
- Рендеринг трехмерных (3D) поверхностей из последовательностей изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот раздел позволяет генерировать поверхность из фильма, генерируемого с помощью мембранного сигнала GFP.- Нажмите « Изменить» | Покажите настройку дисплея и используйте ползунок гистограммы, чтобы настроить интенсивность сигнала, чтобы сигнал мембраны был прозрачным( См. Рисунок 3 A ).
- Исправить отбеленный сигнал, используя изображение Обработка | Коррекция затухания . Отрегулируйте значения интенсивности спереди и интенсивности, чтобы сигнал мембраны был прозрачным по всей длине фильма. Для установки этих значений может потребоваться некоторая пробная версия и ошибка.
ПРИМЕЧАНИЕ. Значение параметра «Интенсивность назад» (более глубокое Z) будет меньше значения «Интенсивность фронта» («Поверхность Z») из-за ограниченного проникновения лазера. Эти значения также могут быть изменены для нормализации интенсивности сигнала в серии Z. Оба значения могут быть скорректированы для достижения коррекции отбеливания. Коррекция затухания также называется коррекцией ослабления излучения 19 . - Чтобы сформировать поверхность из мембранного сигнала, выберите Surpass | Поверхности , выберите канал источника и тип порога (абсолютная интенсивность) и в соответствии с настройками алгоритма seLect Сегмент только интересующий регион И Процесс полного изображения , затем, щелкнув стрелку вперед; Продолжайте нажимать стрелку вперед (используйте настройки по умолчанию или задайте уровень детализации поверхности и метод порогового значения методом проб и ошибок), проверяя, отражает ли сгенерированная поверхность сигнал флуоресценции. Чтобы указать регион интереса, выберите регион и время (ы), которое будет отображаться путем обрезки позиций X, Y, Z.
ПРИМЕЧАНИЕ. Выберите Наконец, процесс полного изображения, чтобы корректировки и пороговые значения были применены во всем фильме. - Сгенерируйте поверхность, снова нажав кнопку стрелки вперед. Затем отрегулируйте порог, изменив гистограмму в фильтрах, чтобы соответствовать мембранному сигналу.
- После того, как поверхность будет сгенерирована, выберите поверхность в Surfaces / Settings, чтобы визуализировать поверхностный сигнал и завершить процесс генерации поверхности, нажав двойную кнопку forwArd стрелка ( рисунок 3 B ).
- Перейти к поверхности | Отредактируйте и нажмите « Маска» в « Свойства маски», чтобы создать образ маскированного канала.
- После нажатия кнопки ok автоматически откроется окно Mask Channel; Выберите канал GFP, установите вокселы вне поверхности на максимальное значение интенсивности сигнала (в настройке Edit | Display ) и вокселы внутри поверхности до минимального значения интенсивности GFP (также найдено в Редактировать | Настройка дисплея ), в настройках маски для создания маски сигнала мембраны.
- Поскольку маска мембранного сигнала будет показана в виде тома , сгенерируйте инвертированные изображения с помощью Image Processing | Изменение контраста | Инвертировать ( рисунок 3 C ).
- Обнаружение пятен от обращенных изображений поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот раздел позволяет центру каждой ячейки бытьОтмечены уникальным местом и отслеживаются по пространству и времени.- Выберите Surpass Scene | Пятна | Создать ; В настройках алгоритма выберите Сегмент только Область интереса , Процесс полного изображения, наконец, и Трековые точки (со временем) .
- Нажмите стрелку вперед и укажите регион интереса; Выберите регион и время (ы) для отслеживания мест; Продолжайте нажимать стрелку вперед, выберите маскированный канал в качестве исходного канала и определите предполагаемый диаметр пятен XY.
- При нажатии кнопки прямой стрелки автоматически открывается окно фильтра; Отрегулируйте порог обнаружения пятна, изменив значения в гистограмме, чтобы генерировать одиночные пятна в центре каждой ячейки ( рисунок 3 D ).
- При повторном нажатии кнопки «Стрелка вперед» откроется окно « Алгоритм» . Выберите « Авторегрессионная модель отслеживания движения» 20 и укажите максимальное отслеживание diСтойкость и максимальный размер зазора для подключения дорожек, которые прерываются в течение короткого периода времени.
- При повторном нажатии кнопки «Стрелка вперед» откроется окно «Фильтры», установите порог продолжительности дорожки, отрегулировав гистограмму, чтобы отслеживать каждую ячейку. Щелчок по кнопке со стрелкой двойного стрелка завершает определение местоположения пятна.
- Чтобы исправить дрейф ткани, нажмите « Пятна» | Редактор дорожек и выберите « Правильный дрейф» . Окно Алгоритм откроется автоматически; Выберите « Переводный дрейф», «Включить весь результат» и « Исправить позиции объектов» .
- Формирование выгодных участков для количественного анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ. Scatterplot программы является инструментом для генерации многомерных (X, Y, Z, цветных и масштабных) графиков с несколькими объектами. Эти графики полезны для просмотра тенденций многих движений клеток с течением времени.- Сделайте 2D или 3D графики данных отслеживания ячейки, используяМеню Vantage-Add New Vantage ( Рисунок 3 E и 3F ).
- Выберите « Громкость» или « Точки» и выберите « Создать / Категорию» и « Тип графика»
- Отрегулируйте значения сюжетов для создания разных графиков Vantage.
- Экспорт графиков с использованием функции моментального снимка .
ПРИМЕЧАНИЕ. Статистические данные также можно экспортировать в виде таблицы для дальнейшего количественного анализа, щелкнув « Область номеров» | Сохранить .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Живая визуализация культуры эксплантации неба выявила многочисленные клеточные процессы, опосредующие слияние неба 6 . Начальные контакты между двумя эпителиальными клетками выполняются мембранными выпячиваниями ( рис. 2 B-2E ). Когда встречаются два эпителиальных слоя, они образуют многоклеточный многослойный MES, за которым следует интеркаляция, чтобы сделать интегрированный однослойный MES посредством эпителиальной конвергенции ( рис. 2 A-2E и рис. 2 K-2O ). Эпителиальные клетки в более глубоких Z-уровнях также постепенно смещаются на оральную сторону MES, способствуя процессу конвергенции эпителия ( рисунок 2 K ). Последующая миграция клеток наблюдалась в срединном MES ( рис. 2 F-2J ). Кроме того, мы обнаружили, что эпителиальная клетка extRusion события во время слияния неба, предполагая, что эпителиальные клетки в MES могут быть удалены этим активным процессом ( рис. 2 Q, 2T ). Интегрированный эпителиальный шов в конечном счете разрушается для достижения мезенхимной слияния ( рис. 2 S, 2T ).
В образцах Lifeact-mRFPruby palate наблюдались динамические цитоскелетные перестройки актина во время слияния неба 6 . Нитевидный актин обогащался границей между эпителиальными и мезенхимными областями, образующими кабельно-подобную структуру вдоль передней-задней оси ( рис. 2 К-2Т) . Сократимость актомиозина приводит к сближению эпителия и к потере МЭС, поскольку химическое ингибирование активности миозина или полимеризации актина блокирует эти динамические процессы. 6 .
Hin-page = "1"> Программное обеспечение использовалось для отслеживания поведения сотов во время слияния неба. Лучший метод отслеживания клеток зависит от репортерного сигнала. Если используется ядерная репортерная мышь, программа может отслеживать центр флуоресцентных сигналов в качестве клеточных центров 21 . Таким образом, ядерную репортерную мышь GFP, такую как ROSA26 GFP-NLS-lacZ ( GNZ) 22, можно использовать для маркировки эпителиальных клеток с использованием тканеспецифических линий Cre; В наших руках этот конкретный ядерный репортер демонстрировал более быстрое отбеливание в течение длительного времени, используемого в реальном изображении. Поэтому мы использовали репортер мембраны-GFP ( ROSA26-mTmG flox ), чтобы следить за движениями эпителиальных клеток в наших исследованиях. Это потребовало метода идентификации и отслеживания отдельных клеток мембранным сигналом. Чтобы решить эту проблему, мы использовали модифицированный метод отслеживания клеток ( рис. 3 и раздел 4 протокола ).
Content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Рисунок 1 : Схематический вид вторичного рассечения неба. ( A ) Вид сбоку эмбриона мыши E14.5. Чтобы рассекать небные полки, голова была разрезана по первой белой пунктирной линии №1. ( B, C ) Верхний мозг (над второй белой линией, № 2) был удален. ( D, E ) Оральный вид рассеченной головы. Нижняя мандибула (№ 3) была вскрыта, а язык (№ 4) удален. ( F ) Вырезана задняя часть головы по линии №5. ( GI ) Были удалены как верхние челюсти (# 6, # 7), так и передняя часть верхней челюсти (# 8). ( JL ) Назальная перегородка (№ 9) была удалена ( M ) GFP-сигналами в MES расчлененного неба из K14-cre; ROSA26 mTmG мышиный эмбрион. ( N ) Настройка изображения в реальном времени. Устная сторона приятеляЕл эксплантат был направлен вниз, чтобы визуализироваться с помощью инвертированного конфокального микроскопа. MES обозначается белыми наконечниками стрелок ( FI ). Отображаемая область обозначена белыми пунктирными ящиками в L и M. Шкала шкалы = 2 см в A, 1 см в BI, 500 мкм в JM. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Живая визуализация культур эксплантатов неба. ( AE ) Живое изображение переднего вторичного неба из K14-cre; Эксплантат ROSA26 mTmG (глубина 5 мкм). Белая стрелка показывает мембранный выступ из эпителиальной клетки ( FJ ). Живое изображение среднего неба от K14-cre; Эксплантат ROSA26 mTmG (5 мкм depth). Белые стрелки указывают направление миграции клеток от переднего неба. ( KO ) Живое изображение переднего неба из эксплантата Lifeact-mRFPruby (глубина 5 мкм). Вытеснение эпителиальных клеток (желтая стрелка) на поверхность полости рта и сходимость для образования интегрированной МЭС с кабельноподобными актинными структурами в средней линии. ( PT ). Живое изображение переднего неба из эксплантата Lifeact-mRFPruby (глубина 25 мкм). Красная стрелка указывает на событие экструзии ячейки ( Q, T ). Будущие точки повреждения шва обозначены двумя вертикальными белыми стрелками в S и T. Шкала шкалы = 20 мкм. Все данные, полученные в реальном времени, на этом рисунке взяты из экспериментов, ранее опубликованных в 6 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
-page = "1"> 
Рисунок 3 : Анализ данных. ( AD ) для отслеживания эпителиальных клеток с мембранными сигналами GFP от K14-cre; Эксплантом ROSA26 mTmG palate ( A ). Поверхность генерировалась путем объемной визуализации сигнала GFP мембраны ( B ). Инвертированные изображения генерировались после маскировки созданной поверхности ( C ). Сотовые центры были идентифицированы из перевернутых изображений, используя функцию обнаружения пятен в Imaris ( D ). ( E ) 3D-реконструкции позволяют отслеживать движения ячеек в нескольких направлениях. A: передний, P: задний, N: носовой, O: оральный ( F ) 2D-анализ генерирует выгодный участок, показывающий клетки, мигрирующие из переднего и заднего направлений в средние неба MES. Шкала шкалы = 20 мкм в AD, 10 мкм в EF.S / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео Рисунок 1: Живая визуализация K14-cre; ROSA26-mTmG Flox переднего неба (глубина 5 мкм). Изображения снимались каждые 10 мин (10 мин / кадр) в течение 16 ч 20 мин, шкала шкалы = 25 мкм. Это видео отличается от Z-позиции фильма, ранее опубликованного в ссылке 6 . Нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)
Видео Рисунок 2: Живая визуализация K14-cre; ROSA26-mTmG flox Среднее небо (глубина 5 мкм). Изображения регистрировались каждые 15 мин (15 мин / кадр) в течение 13 ч 30 мин, шкала шкалы = 25 мкм. Это видео ранее было опубликовано в ссылке 6 . Нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)
Видео Рисунок 3: Живая визуализация переднего неба Lifeact-mRFPruby (глубина 5 мкм).
Образцы делали каждые 10 мин (10 мин / кадр) в течение 7 ч 50 мин. Шкала шкалы = 20 мкм. Это видео ранее было опубликовано в ссылке 6 . Нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)
Видео Рисунок 4: Живая визуализация переднего неба Lifeact-mRFPruby (глубина 25 мкм).
Образцы делали каждые 10 мин (10 мин / кадр) в течение 7 ч 50 мин. Шкала шкалы = 20 мкм. Это видео отличается от Z-позиции фильма, ранее опубликованного в ссылке 6 . Нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Живое изображение морфогенеза ткани с культурой эмбрионального тела может предоставить подробную информацию о клеточных процессах, которые не могут быть показаны при обычном анализе окрашивания фиксированных участков ткани. Используя in vitro эксплантовую культуру эмбрионального вторичного неба мыши, мы наблюдали несколько интересных сотовых поведения, которые заставляют нас предложить новый механизм слияния неба, который включает эпителиальную конвергенцию и экструзию клеток.
Одной из распространенных проблем в исследованиях этого типа является фотообесцвечивание непрерывными лазерными возбуждениями в течение длительного времени. В наших исследованиях использовался конфокальный конвектор белого света и конфокальный микроскоп с вращающимся диском. Некоторое снижение интенсивности сигнала с течением времени может быть исправлено путем исправления отбеливания в программном обеспечении обработки изображений (LAS-AF) (протокол 4.1). Поскольку коррекция отбеливания ограничена, важно тщательно оптимизировать мощность лазера и время экспозиции в каждой системе обработки изображений. Мы также проверилиЧто слияние неба происходит обычно в живых изображениях после 3-дневной культуры 6 .
Второй распространенной проблемой в реальном изображении является дрейф ткани. Крайне важно минимизировать дрейф, чтобы получить согласованные изображения во время живого изображения, потому что изменения в фокальной плоскости могут смутить понимание морфогенетических изменений с течением времени. В то время как регулирование теплового дрейфа может быть достигнуто во многих конфокальных микроскопах (определенная фокусировка в микроскопе), дрейф ткани по отношению к стеклянному дну не может быть устранен этими методами. Использование агарозы, а также размещение эксплантов на стеклянном дне помогает свести к минимуму это, но следует позаботиться о том, чтобы анализировать только те фильмы, которые поддерживают относительно постоянную позицию. Это можно определить, следуя нескольким контрольным точкам в поле отображения во времени, чтобы определить, остаются ли они постоянными, перемещаться с аналогичной тенденцией или двигаться по-другому. В какой-то степени использование пост-обработки fuNctions позволяют исправить некоторый дрейф ткани в реальном изображении (протокол 4.2).
Низкоплавкую агарозу использовали при конечной концентрации 0,6% в живом изображении для иммобилизации тканей эксплантов. Когда мы тестировали более высокие концентрации агарозы, они, по-видимому, нарушали морфогенез ткани, возможно, из-за механических ограничений. Поэтому важно использовать правильную концентрацию агарозы, чтобы свести к минимуму дрейф ткани, не нарушая морфогенеза.
Из-за глубины конфокальной визуализации этот метод создает пределы для изучения очень глубоких Z-планов слияния неба. Используя конфокальные микроскопы WHITE LIGHT и спиннинг-диска, сигнал с глубины 100 мкм мог быть успешно отображен, хотя изображение стало тусклым и слабым за пределами этого предела. Поскольку слияние с неба является прогрессивным процессом в оронных и переднезадних осях, мы предлагаем, чтобы изображения нескольких позиций эффективно отображали изображения разных отделовHs сплава неба, но в будущем может быть использована двухфононная или световая конфокальная микроскопия для улучшения глубины изображения. В большинстве наших экспериментов была показана оральная сторона эксплантатов неба. Изображение назальной стороны эксплантата неба затруднено, потому что носовая перегородка слита или очень близко к вторичным палататным шельфам. В наших попытках изображения слияния с носовой стороны также необходимо было удалить лишнюю носовую ткань, чтобы она не мешала сигналу от эпителия неба. Хотя возможно, визуализация носовой части эксплантата неба была затруднена, поскольку рассечение носовой перегородки часто вызывало повреждение эксплантатов неба.
Живое изображение эксплантов ткани мыши-репортера является мощным методом изучения клеточных механизмов морфогенеза тканей во время эмбрионального развития. Используя методы конфокальной микроскопии и количественный анализ изображений, основные процессы развития, такие как вторичное слияние неба, могут бытьИсследованных на клеточном уровне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим М. Дугласа Бенсона за начальные разговоры о вторичной визуализации неба. Мы также признаем Дэвида Кастанеду-Кастелланоса (Leica) и Криса Риекена (Zeiss) за помощь в настройке условий съемки в конфокальной микроскопии. Мы ценим Lynsey Hamilton (Bitplane) за полезные предложения по количественному анализу изображений с использованием программного обеспечения Imaris. Эта работа финансировалась NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
