Summary
Her præsenterer vi en protokol til levende billeddannelse af musekonfliktfusion med konfokal mikroskopi. Denne protokol kan anvendes i kombination med en række fluorescerende reportermuslinjer, og med pathway-hæmmere til mekanistisk indsigt. Denne protokol kan tilpasses til levende billeddannelse i andre udviklingssystemer.
Abstract
Sammensmeltningen af de sekundære palatalhylder til dannelse af den intakte sekundære gane er en nøgleproces i udvikling af pattedyr, og dets forstyrrelse kan føre til spaltet sekundær gane, en fælles medfødt anomali hos mennesker. Sekundær ganefusion er blevet grundigt undersøgt, hvilket fører til flere foreslåede cellulære mekanismer, som kan mediere denne proces. Disse undersøgelser er dog hovedsageligt udført på faste embryonale væv ved progressive tidspunkter under udvikling eller i faste eksplanterede kulturer analyseret ved statiske tidspunkter. Statisk analyse er begrænset til analyse af dynamiske morfogenetiske processer, sådan en ganefusion, og hvilke typer af dynamiske cellulære adfærd medier palatal fusion er ufuldstændigt forstået. Her beskriver vi en protokol til levende billeddannelse af ex vivo sekundær ganefusion i musembryoer. For at undersøge cellulære opførsel af ganefusion blev epithel-specifik Keratin14- cre brugt til at mærke ganeepitelceller i ROSA26-mTmG flox reporter embryoner. For at visualisere filamentøs actin blev Lifeact-mRFPruby- reportermus anvendt. Levende billeddannelse af sekundær ganefusion blev udført ved dissekering af nyligt adhærerede sekundære palatalhyller af embryonale (E) 14.5-fosters embryoner og dyrkning i agaroseholdige medier på en glasbunds skål for at muliggøre billeddannelse med et inverteret konfokalmikroskop. Ved hjælp af denne metode har vi opdaget en række nye cellulære adfærd under sekundær ganefusion. En forståelse for, hvor adskillige celleadfærd er koordineret i rum og tid, bidrager meget til vores forståelse af denne dynamiske morfogenetiske proces. Denne protokol kan anvendes på mutante muselinier eller kulturer behandlet med farmakologiske inhibitorer for yderligere at fremme forståelse for, hvordan sekundær ganefusion styres.
Introduction
Vævsfusion er et vigtigt skridt i udviklingen af flere organer. Større menneskelige fødselsdefekter som spaltet læbe og gane, spina bifida og misdannelser i hjertet kan skyldes defekter i vævsfusion 1 . Mus sekundær gane fusion er blevet grundigt studeret for at identificere de cellulære og molekylære mekanismer, der styrer vævsfusion i udvikling 2 , 3 , 4 . I musen begynder sekundær ganeudvikling på omkring E11.5 med udvidelsen af en sekundær palatalhylde fra hver af de bilaterale maksillære processer. Den oprindelige vækst af palatalhyllerne foregår lodret langs tungen, indtil ca. E14.0, hvorefter palatalhyllerne bliver hævet vandret over tungen. Medialt rettet vækst resulterer i fysisk kontakt mellem de to palatale hylder, der tilslutter sig epithelia, der danner midterlinjen epitheliAl søm (MES) ved E14.5. Den mellemliggende MES skal fjernes fra mellem de sekundære palatalhyller for at muliggøre mesenkymkonfluens og udvikling af en intakt, fuldstændigt smeltet sekundær gane ved E15.5 3 .
Hvordan er et fælles epithelial MES-cellelag dannet mellem to separate palatale hylder og derefter fjernet for at opnå mesenkym konfluens, har været et centralt spørgsmål i ganeudvikling. Baseret på histologiske og elektronmikroskopi (EM) undersøgelser, eksplanterende kulturstudier og funktionelle musegenetikforsøg har flere grundlæggende celleadfærd været impliceret i denne proces. Filopodi-lignende fremskrivninger fra medialkantepitelet MEE af hver palatalhylde letter initial kontakt 5 , 6 efterfulgt af interkalering af disse epithelceller til en fælles enkelt MES 6 , 7 . Fjernelse af den resulterende delte MESEr blevet foreslået at gå videre med tre ikke-eksklusive mekanismer. Tidlige undersøgelser, der anvendte histologisk observation og ex vivo linjesporing med vitale farvestoffer, viste, at MES kunne fjernes ved epithelial til mesenchymal overgang (EMT) af MES-celler 8 , 9 , men for nylig har genetisk afstamning af epithelceller skabt usikkerhed omkring Det langsigtede bidrag fra epithelceller til palatal hylde mesenchymme 10 , 11 , 12 . Signifikant antal apoptotiske celler og en reduktion i deres antal i nogle mutanter, der ikke gennemgår ordentlig palatfusion, har ført til ideen om, at apoptose kan være en vigtig drivkraft for MES opløsning 2 , 3 . Endelig baseret på undersøgelser, der involverer epitelmærkning og statisk observation ved progressive tidspunkter, MES-cellerBlev foreslået at migrere i oronasale og anteroposterior dimensioner 11 , 13 , men sådanne dynamiske celleadfærd var oprindeligt ubekræftet på grund af manglende evne til at observere dem i levende palatalvæv. For nylig var vi i stand til direkte at observere disse adfærd ved at udvikle en ny levende billeddannelsesmetode, der kombinerer musegenetiske metoder til fluorescerende mærkning med konfokal levende billeddannelse af eksplanterede palatalhyller.
For at visualisere dynamisk cellulær adfærd i palatepitelceller under ganefusion genererede vi en epithelspecifik reportermus ved at krydse ROSA26-mTmG floxmus med Keratin14-cre mus 14 , 15 . Konfokal levende billeddannelse af ganen eksplanterende kultur af de resulterende embryoner bekræftede nogle tidligere foreslåede cellulære adfærd og identificerede nye begivenheder i fusionsprocessen 6 6 , 16 . Denne billeddannelsesmetode kan bruges sammen med andre reporterlinjer; Vi benyttede Lifeact-mRFPruby- transgene mus 17 , 18 til at undersøge actin cytoskeletaldynamik under fusionsprocessen. Andre journalister kan også bruges til at observere andre specifikke aspekter af ganefusion, og denne metode kan tilpasses enten til laserskanning af konfokal mikroskopi eller spin-disk-konfokalmikroskopi afhængigt af billedbehov og tilgængelighed af mikroskop. Levende billeddannelse bliver i stigende grad en keystone-tilgang i udviklingsbiologi. PartiCularly, kraniofacial morfogenese er kompleks og menneskelige fødselsdefekter, der påvirker ansigtet er almindelige. Denne konfokale levende billeddannelsesmetode vil bidrage til at muliggøre en bedre forståelse af underliggende grundlæggende udviklingsmekanismer såvel som oprindelse af humane kraniofaciale abnormiteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med protokollerne fra University of California i San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse af Live Imaging Media
- Fremstilling af flydende dyrkningsmedier
- Tilsæt 20% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 200 μg / ml L-ascorbinsyre, 15 mM HEPES til Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 medier.
BEMÆRK: Levende billeddannelsesmedier blev frisk fremstillet lige før billeddannelsen. Dette medium indeholder phenol-rødt, hvilket kan medføre fototoksicitet over længere tid kurser med levende billeddannelse. At erstatte medier uden fenol-rødt kan forbedre langsigtet billeddannelse.
- Tilsæt 20% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 200 μg / ml L-ascorbinsyre, 15 mM HEPES til Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 medier.
- Fremstilling af lavsmeltende agaroseopløsning
- Opløs 350 mg lavmeltende agarose i 10 ml autoklaveret destilleret vand for at gøre en 3,5% stamopløsning.
- Bland agaroseopløsningen godt og inkuber ved 70 ° C i et vandbad for at opløse agarosen fuldstændigt.
- Afkøl agaroseopløsningen i et 37 ° C vandbad, før det tilsættes til levende billeddannelsesmedier.
- Tilsæt 1 ml agarose stamopløsningen til 5 ml væsken levende billeddannelsesmedier for at opnå en endelig koncentration (0,6%).
- Hold medierne med agarose i et 37 ° C vandbad for at forhindre for tidlig størkning.
2. Fremstilling af Palate Explant Culture for Live Imaging
- Dissektion af nyligt adhærerede E14.5 sekundære palatalhylder
BEMÆRK: I vores erfaring kræver billeddannelse fusion med en lidt adhered par palatal hylder; Denne adherence forhindrer eksplanterende bevægelser, der forhindrer fusion fra at forekomme under billeddannelse.- Dissekter E14.5-stadium embryoner i 1x phosphatbufret saltvand (PBS) og vælg grøn fluorescerende protein (GFP) -udtryk (fraK14-cre; ROSA26-mTmG flox ) eller (Rødt fluorescerende protein) RFP-ekspression (fra Lifeact-mRFPruby ) positive embryoner ved anvendelse af et dissekeringsmikroskop udstyret med fluorescerende lamper. Overfør væv til forvarmet levende billeddannelseskulturmedier uden agarose.
- Skær embryohovedet og fjern det øverste hjerneområde ved at bruge to fine nr. 5 tang ( figur 1 A-C ). Brug en nr. 5 tang til at holde embryoet, mens den anden nr. 5 tinger for at skære væk ekstra væv uden for palatalhyllerne.
BEMÆRK: Fin saks kan bruges til at skære embryo hoved (det første trin) i stedet for en nr. 5 tang. Dog vil to nr. 5 fine tænger give bedre kontrol for at foretage præcise nedskæringer. - Fjern mandiblen omhyggeligt uden at skade palatalhyller som vist i Figur 1 D og 1E . For at reducere chancen for at beskadige ganer, hold tungen gennem dissektion af mandiblen, fForårsaget af omhyggelig fjernelse af tungen.
- Efter fjernelse af mandibel og tunge undersøge den orale side af den sekundære gane med et stereomikroskop med fluorescens for at bekræfte stærkt reporter signal i MES ( Figur 1 M ).
- Dissect out posterior dele herunder baghjerne og hjernestammen efter fjernelse af mandibel og tunge ( Figur 1 F ).
- Fjern begge maxillae med klæbende palatalhyller ( figur 1 G ).
- Skær det fremre øvre kæbekæv, der holder både primær og sekundær gane intakt ( figur 1 H og I ).
- Fjern nasal septum på nasal side af eksplantat eksponere MES.
BEMÆRK: Disse senere trin i dissektioner skal udvises omhyggeligt og ikke forstyrre kontakterne mellem to sekundære palatalhyller. Fjernelse af næseseptum hjælper tilReducere baggrundssignalet fra andre områder og reducere også vertikal vævsbevægelse, hvilket muliggør stabil billeddannelse ( Figur 1 J-L ). - Efter dissekering af palatalhyllerne skal du undersøge midline reporter signal igen for at sikre, at epitheliallaget ikke er beskadiget mellem vævene.
- Opstilling af ganeeksplanter i kulturskål med levende billeddannelsesmedier
- Sæt levende billeddannelsesmedier i 35 mm glasbundet skål.
- Sæt dissekerede palatale hylder mundtlig side nedad så tæt på glasbunden som muligt til billeddannelse med et inverteret konfokalmikroskop ( Figur 1 N ).
- Placer tøris pellets på en ledende overflade i nærheden af dyrkningsskålen for at fremskynde agarose størkning ved at reducere temperaturen hurtigt eller sætte kulturskålen ved 4 ° C. En kold plade, som den, der anvendes til paraffinindlejring, kunne også anvendes ved denne sTage.
BEMÆRK: Når tøris anvendes, skal agarose medieændring overvåges omhyggeligt for at forhindre frostmedier.
3. Confocal Time-lapse Imaging of Palate Explant
- Billeddannelse og dataindsamling
- Efter agarose blev halvstivet, montere kulturskålen i et inverteret konfokalt mikroskop udstyret med 37 ° C inkubationskammer. Brug et hvidt lys konfokalmikroskop og celleobservatør spin-disk konfokalmikroskop.
BEMÆRK: Vi brugte et modificeret medium indeholdende 15 mM HEPES uden CO 2 gas. - Sæt vaselin mellem kulturskålen og dækslet ved hjælp af en sprøjte for at forhindre fordampning af medier ( Figur 1 N ).
BEMÆRK: En del kondensering oven på kulturskåldækslet efter natten over (O / N) -kultur forekommer, men mængden af medier ændrer sig ikke, hvilket tyder på, at petroleumsgeleen forhindrer medierne i at fordampe. - Find området med interesse med lave forstørrelsesmål (10x) og brug højere forstørrelsesmål (20x objektiv med 3x digital zoom eller 40x objektiv med Immersol W) til time-lapse live-billeddannelse.
BEMÆRK: Dissected sekundære palatal hylder er ikke flade. Den sekundære gane er en buet struktur, og det gør det svært at se hele MES i samme plan. Lav forstørrelse (10x) billeddannelse kan tillade fuld ganebilleddannelse, men 40x mål vil give bedre billedopløsning til at undersøge detaljerede mobilbevægelser i dybere Z-positioner. Krumningen er høj i den midterste gane region. Forreste og bageste gane er forholdsvis flade i forhold til den midterste gane. Vi billedet ofte imod midten af den sekundære gane for at undgå områder med størst krumning. - Scan flere Z-stabler med 5 μm hvert trin i 16-24 timer ved brug af korrekt laser excitation (488 nm for GFP og 532/561 nm for RFP) ( Figur 2 ).
BEMÆRK: Brug minimal laserkraft og eksponeringstid for at reducere potentiel fototoksicitet. Dette er vigtigt især i tilfælde af multi-farve billeddannelse. Brug 22% af 552 nm laserkraft til membranTomato (mT), 30% af 495 nm laserkraft til membranGFP (mG) og 25% af 561 nm laserkraft til membranRFP. Den gennemsnitlige eksponeringstid var 550 ms. - Brug billedanalysesoftware til at udføre cellesporing og kvantitativ analyse.
- Efter agarose blev halvstivet, montere kulturskålen i et inverteret konfokalt mikroskop udstyret med 37 ° C inkubationskammer. Brug et hvidt lys konfokalmikroskop og celleobservatør spin-disk konfokalmikroskop.
4. Data Image Analysis
BEMÆRK: Her blev Imaris brugt. Lignende data analyser kan også udføres med ImageJ eller Volocity softwarepakker.
- Giver 3-dimensionelle (3D) overflader fra billedsekvenser.
BEMÆRK: Dette afsnit muliggør generering af en overflade fra en film, der er genereret med et membran-GFP-signal.- Klik på Rediger | Vis skærmjustering og brug skærmbilledet til histogrammet til at justere signalintensiteten, så membransignalet er klart igennemUd længden af filmen ( figur 3 a ).
- Korrekt bleget signal ved hjælp af Image Forarbejdning | Dæmpningskorrektion . Juster Intensity Front og Intensity Back værdierne, så membransignalet er klart i hele filmens længde. Nogle forsøg og fejl kan være nødvendige for at indstille disse værdier.
BEMÆRK: Intensity Back (Dyp Z position) værdi vil være mindre end intensiteten foran (overflade Z position) værdi på grund af begrænset laser penetration. Disse værdier kan derfor også ændres for at normalisere signalintensiteten i Z-serien. Begge værdier kan justeres for at opnå blegningskorrektion. Dæmpningskorrektion kaldes også emissionsdæmpningskorrektion 19 . - For at generere en overflade fra membransignalet, vælg Surpass | Overflader , vælg en kildekanal og Tærskeltype (Absolut Intensitet) og under Algoritmeindstillinger seLect Segment kun en region af interesse Og processen af hele billedet endelig , efterfulgt af at klikke på fremadspilen; Fortsæt med at skubbe fremadpilen (brug standardindstillinger, eller angiv Surface Area Detail Level og Thresholding metode ved forsøg og fejl), og kontroller, om den genererede overflade afspejler fluorescenssignalet. For at angive en region af interesse, vælg region og tid (er), der skal gengives ved at beskære X, Y, Z positioner.
BEMÆRK: Vælg Processen af hele billedet til sidst, så justeringer og tærskler vil blive anvendt over hele filmen. - Generer en overflade ved igen at klikke på pilen fremad. Juster derefter tærsklen ved at ændre histogrammet i filtre for at svare til membransignalet.
- Når overfladen er genereret, skal du vælge overflade i Overflader / Indstillinger for at visualisere overfladesignalet og afslutte overfladegenereringsprocessen ved at skubbe dobbeltforwinderenArd pil-knap ( figur 3 B ).
- Gå til Overflade | Rediger og klik på Mask alle i Maskegenskaberne for at generere et maskeret kanalbillede.
- Når du har klikket ok, åbnes vinduet Maskekanal automatisk; Vælg GFP-kanalen, indstil voxels uden for overfladen til den maksimale signalintensitetsværdi (fundet i Rediger | Displayjustering ) og voxels inde i overfladen til den mindste GFP intensitetsværdi (findes også i Rediger | Displayjustering ) i Maskindstillinger for at generere en maske af membransignalet.
- Da masken af membransignalet vil blive vist i volumenvisning , genererer du inverterede billeder ved hjælp af billedbehandling | Kontrastændring | Omvendt ( figur 3 C ).
- Påvisning af pletter fra inverterede overfladebilleder.
BEMÆRK: Dette afsnit gør det muligt at være midt i hver celleMarkeret med et unikt sted og sporet over plads og tid.- Vælg Surpass Scene | Spots | Opret ; I algoritmen indstillinger vælger segmentet kun en region af interesse , processen med hele billedet endelig og sporspots (over tid) .
- Klik på fremadpilen og specificer en region af interesse; Vælg region og tid (er) for at spore pletter; Fortsæt med at skubbe fremadspilen, vælg den maskerede kanal som en kildekanal og bestemm den estimerede XY-diameter af pletter.
- Når du klikker på pilen fremad, åbnes automatisk et filtervindue. Juster spotdetektionstærsklen ved at ændre værdierne i histogrammet for at generere enkelte punkter i midten af hver celle ( figur 3 D ).
- Når du klikker på pilknappen fremad, åbnes algoritmen vinduet. Vælg Autoregressiv bevægelsessporingsmodel 20, og angiv den maksimale sporingsdiHoldning og maksimal mellemrumstørrelse for at forbinde spor, der bliver diskontinuerlige i en kort periode.
- Når du klikker på pilknappen forover igen, åbnes vinduet Filtre, indstiller tærskelværdietærsklen ved at justere histogrammet, så hver celle spores. Ved at klikke på knappen for dobbeltpil fremover, afsluttes punktdetektering.
- For at korrigere vævsdrift skal du klikke på Spots | Track Editor og vælg Correct Drift . Et algoritmvindue åbnes automatisk; Vælg vælg Translational drift, Include hele resultatet og Rett objekter positioner .
- Generering af udsigtsområder for kvantitativ analyse.
BEMÆRK: Programmets Scatterplot er et værktøj til generering af flerdimensionale (X, Y, Z, Farve og Skala) grafer med flere objekter. Disse plot er nyttige til at se trends i mange cellebevægelser over tid.- Lav 2D eller 3D plot af celleopsparingsdata ved hjælp afVantage-Add New Vantage plot menu ( Figur 3 E og 3F ).
- Vælg Volumen eller Spots, og vælg Opret / Kategori og Plot Type
- Juster plotværdier for at generere forskellige Vantage-grafer.
- Eksporter grafer ved hjælp af snapshot- funktionen.
BEMÆRK: Statistiske data kan også eksporteres som et regneark for yderligere kvantitativ analyse ved at klikke på Plot Numbers Area | Gem .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Levende billeddannelse af ganeeksplanterende kultur afslørede flere cellulære processer medierende ganefusion 6 . Indledende kontakter mellem to epithelceller fremstilles af membranfremspring ( Figur 2 B-2E ). Når to epithelag mødes, danner de en multicellelagret MES efterfulgt af interkalering for at gøre et integreret enkeltcellelag MES gennem epithelkonvergens ( Figur 2 A-2E og Figur 2 K-2O ). Epitelceller i dybere Z-niveauer forskydes også progressivt til den mundtlige side af MES, der bidrager til epithelkonvergensprocessen ( Figur 2 K ). Posterior-rettet cellemigration blev observeret i mellemg palat MES ( Figur 2 F-2J ). Derudover fandt vi epithelial celle extUdbrudshændelser under ganefusion, hvilket tyder på, at epitelceller i MES'en kan fjernes ved denne aktive proces ( Figur 2 Q, 2T ). Den integrerede epithelial søm vil i sidste ende bryde ned for at opnå mesenkym konfluens ( Figur 2 S, 2T ).
Lifeact-mRFPruby- ganen viste dynamiske actin-cytoskeletale omlejringer under ganefusion 6 . Filamentous actin blev beriget ved grænsen mellem epitheliale og mesenkymale områder, der danner en kabellignende struktur langs den forreste og bageste akse ( Figur 2 K-2T) . Actomyosin-kontraktilitet dirigerer epitelkonvergens og MES-brud, fordi kemisk inhibering af enten myosinaktivitet eller actinpolymerisering blokerede disse dynamiske processer 6 .
Hin-page = "1"> Software blev brugt til at spore cellulær adfærd under ganefusion. Den bedste metode til cellesporing afhænger af reporterens signal. Hvis der anvendes en nukleær reporter-mus, kan programmet spore midten af fluorescerende signaler som cellulære centre 21 . Nukleær GFP- reportermus såsom ROSA26 GFP-NLS-lacZ ( GNZ) 22 kan derfor anvendes til at mærke epithelceller under anvendelse af vævsspecifikke Cre-linier; I vores hænder udstillede denne specifikke nukleare reporter hurtigere blegning over den lange tidskursus, der blev brugt i levende billeddannelse. Derfor anvendte vi membran-GFP reporteren ( ROSA26-mTmG flox ) for at følge epithelcellebevægelser i vores studier. Dette krævede en metode til at identificere og spore individuelle celler med et membran signal. For at løse dette problem anvendte vi en ændret celleopsparingsmetode ( figur 3 og protokolafsnit 4 ).
Indhold "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1 : Skematisk visning af mus sekundær ganen dissektion. ( A ) Set fra siden af E14.5 musembryo. For at dissekere palatalhyller blev hovedet skåret langs den første hvide prikkede linje, # 1. ( B, C ) Den øverste hjerne (over den anden hvide linje, # 2) blev fjernet. ( D, E ) Oral visning af dissekeret hoved. Nedre mandel (# 3) blev dissekeret og tungen (# 4) blev fjernet. ( F ) Posterior del af hovedet langs linjen # 5 blev skåret ud. ( GI ) Både maxillae (# 6, # 7) og forreste del af overkæben (# 8) blev fjernet. ( JL ) Nasal septum (# 9) blev fjernet ( M ) GFP signaler i MES af dissekeret gane fra en K14-cre; ROSA26 mTmG museembryo. ( N ) Live billeddannelsesopsætning. Den mundtlige side af kammeratSpiste eksplanterede blev vendt ned for at blive afbildet med inverteret konfokalmikroskop. MES er angivet med hvide pilehoveder ( FI ). Det afbildede område er angivet med hvide stiplede kasser i L og M. Skalestænger = 2 cm i A, 1 cm i BI, 500 μm i JM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 : Levende billeddannelse af ganeeksplante kulturer. ( AE ) Live billeddannelse af den fremre sekundære gane fra en K14-cre; ROSA26 mTmG eksplantat (5 μm dybde). Den hvide pilehoved viser et membranfremspring fra en epitelcelle ( FJ ) Live billeddannelse af den midterste gane fra K14-cre; ROSA26 mTmG eksplantat (5 μm depth). Hvide pile angiver retningen af cellemigrationer fra den forreste til den bageste gane. ( KO ) Live billeddannelse af den forreste gane fra Lifeact-mRFPruby explant (5 μm dybde). Epithelial celleforskydning (gul pil) til den orale overflade og konvergens til dannelse af en integreret MES med kabellignende actinstrukturer i midterlinien. ( PT ) Levende billeddannelse af den forreste gane fra Lifeact-mRFPruby explant (25 μm dybde). Den røde pil angiver en celleekstruderingshændelse ( Q, T ). Fremtidige brudpunkter af sømmen er angivet med to lodrette hvide pile i S og T. Skalestænger = 20 μm. Alle levende billeddannelsesdata i denne figur er afledt af eksperimenter, der tidligere blev offentliggjort i 6 . Klik her for at se en større version af denne figur.
-side = "1"> 
Figur 3 : Data analyse. ( AD ) At spore epithelceller med membran-GFP signaler fra K14-cre; ROSA26 mTmG ganen eksplanterende ( A ), En overflade blev genereret ved volumengengivelse af membran GFP signalet ( B ). Inverterede billeder blev genereret efter maskering af den skabte overflade ( C ). Cellulære centre blev identificeret ud fra de inverterede billeder ved hjælp af en spots-detekteringsfunktion i Imaris ( D ). ( E ) 3D-rekonstruktioner tillader sporing af cellebevægelser i flere retninger. A: anterior, P: posterior, N: nasal, O: oral ( F ) 2D-analyse genererer et udsigtsdiagram, der viser celler, der migrerer fra forreste til bageste retning i midterpalats MES. Skalestænger = 20 μm i AD, 10 μm i EF.S / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Video Figur 1: Live billeddannelse af K14-cre; ROSA26-mTmG flox anterior gane (5 μm dybde). Billeder blev fanget hvert 10. minut (10 min / frame) i 16 h 20 min. Skalbjælke = 25 μm. Denne video er en anden Z-position for en film, der tidligere blev offentliggjort i reference 6 . Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video Figur 2: Live billeddannelse af K14-cre; ROSA26-mTmG flox Midt gane (5 μm dybde). Billeder blev fanget hvert 15. minut (15 min / frame) i 13 h 30 min. Skalbjælke = 25 μm. Denne video er tidligere blevet offentliggjort i reference 6 . Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video Figur 3: Live billeddannelse af Lifeact-mRFPruby anterior gane (5 μm dybde).
Billeder blev taget hver 10 min (10 min / frame) i 7 timer 50 min. Skalbjælke = 20 μm. Denne video er tidligere blevet offentliggjort i reference 6 . Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video Figur 4: Levende billeddannelse af Lifeact-mRFPruby- forreste gane (25 μm dybde).
Billeder blev taget hver 10 min (10 min / frame) i 7 timer 50 min. Skalbjælke = 20 μm. Denne video er en anden Z-position for en film, der tidligere blev offentliggjort i reference 6 . Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levende billeddannelse af vævsmorfogenese med 3D-organteksplanteringskultur kan give detaljeret information om cellulære processer, der ikke kan vises i konventionel farvningsanalyse af faste vævssektioner. Ved at bruge in vitro eksplantatkultur af musembryonisk sekundær gane observerede vi adskillige interessante cellulære adfærd, der førte os til at foreslå en ny mekanisme af ganefusion, der involverer epithelkonvergens og celleekstrudering.
En fælles udfordring i undersøgelser af denne type er fotoblegning ved kontinuerlige laser excitationer over en lang tidskursus. I vores studier blev der anvendt et hvidt konfokal og et spin-disk-konfokalmikroskop. Nogle fald i signalintensitet over tid kan korrigeres ved blegningsrettelser i billedprogrammet (LAS-AF) (protokol 4.1). Da blegningskorrektion er begrænset, er det vigtigt at optimere laserstrøm og eksponeringstid i hvert billedbehandlingssystem. Vi kontrollerede ogsåAt ganen fusion forekommer normalt i live imaging medier efter 3 dag kultur 6 .
Et andet almindeligt problem i levende billeddannelse er vævsdrift. Det er kritisk at minimere drift for at få konsekvente billeder under levende billeddannelse, fordi ændringer i brændpunktet kan forveksle forståelse for morfogenetiske ændringer over tid. Mens styring af termisk drift kan opnås i mange konfokale mikroskoper (bestemt fokus i mikroskopet), kan vævets drift i forhold til glasbunden ikke korrigeres ved disse metoder. Udnyttelse af agarose, såvel som at placere eksplanteret mod glasbunden hjælper med at minimere dette, men det skal kun tages hensyn til at analysere de film, der opretholder en forholdsvis konstant position. Dette kan bestemmes ved at følge flere kontrolpunkter i billedfeltet i tide for at bestemme, om de forbliver konstante, bevæger sig med en lignende tendens eller bevæger sig anderledes. I et omfang, ved brug af post-processing fuNctions tillader en korrektion af noget vævsdrift i levende billeddannelse (protokol 4.2).
Lavmeltende agarose blev anvendt ved en slutkoncentration på 0,6% i levende billeddannelsesmedier for at immobilisere eksplantatvævene. Da vi testede højere koncentrationer af agarose, syntes de at svække vævsmorfogenese, muligvis på grund af mekanisk begrænsning. Det er derfor vigtigt at anvende den korrekte agarosekoncentration for at minimere vævsdrift, uden at forstyrre morfogenese.
På grund af konfokal billeddybde udgør denne metode grænser ved at undersøge meget dybe Z-planer af ganefusion. Ved hjælp af både WHITE LIGHT og spin-disk-konfokale mikroskoper kan signal fra 100 μm dybder blive afbildet med succes, selvom billedet begyndte at blive kedeligt og svagt ud over denne grænse. Fordi ganefusion er en progressiv proces i oronasale og anteroposterior-akserne, foreslår vi, at billeddannelse giver flere stillinger effektivt billeddannelse af forskellige deptHs af ganefusion, men to-foton eller letark konfokal mikroskopi kan i fremtiden anvendes til at forbedre dybden af billeddannelse. I de fleste af vores eksperimenter blev den mundtlige side af ganeeksplantere afbildet. Imaging af næseplanen på ganen explant er vanskelig, fordi næseseptum er fusioneret eller meget tæt på de sekundære palatalhylder. I vores forsøg på billedfusion fra næsens side var det også nødvendigt at fjerne det ekstra nasale væv, så det ikke blandede signalet fra ganeepitelet. Imidlertid var det muligt at afbilde næsepartiet i ganen eksplanteret, fordi dissektion af næsepeptum ofte forårsagede skade på ganeeksplanterne.
Levende billeddannelse af reportermusevævseksplanter er en kraftfuld metode til at studere cellulære mekanismer for vævsmorfogenese under embryonisk udvikling. Ved hjælp af konfokal mikroskopi teknikker og kvantitativ billedanalyse kan grundlæggende udviklingsprocesser som sekundær ganefusion væreUndersøgt på mobilniveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker M. Douglas Benson for indledende samtaler vedrørende sekundær ganebilleddannelse. Vi anerkender også David Castaneda-Castellanos (Leica) og Chris Rieken (Zeiss) for deres hjælp til at justere billeddannelsesforhold i konfokal mikroskopi. Vi sætter pris på Lynsey Hamilton (Bitplane) for nyttige forslag til kvantitativ billedanalyse ved hjælp af Imaris software. Dette arbejde blev finansieret af NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
