Summary
半聚合物显示独特的机械性能, 广泛应用于生活系统。然而, 由于聚合物刚性等性质无法进入, 对生物聚合物的系统研究是有限的。这篇手稿描述了如何利用可编程的 DNA 纳米管规避这一限制, 从而对纤维刚性的影响进行实验研究。
Abstract
复杂的, 聚合物的软物质的机械性能, 如细胞或生物网络, 可以理解在既不经典框架的柔性聚合物也不是刚性棒。由于其非的主干刚度 (通过持久长度 (lp) 进行量化), 底层细丝仍会伸展, 但它们也会受到强烈的热波动的影响。它们的有限弯曲刚度导致了独特的、非平凡的体积网络集体力学, 使得在低体积分数下形成稳定的支架, 同时提供大的网格尺寸。这一基本原理在自然界中很普遍 (例如,在细胞或组织中的), 使高分子含量最小化, 从而促进扩散或主动运输。由于其生物学意义和潜在的技术应用在生物相容的水凝胶, 半聚合物已受到相当多的研究。然而, 可理解的调查仍然具有挑战性, 因为他们依赖天然的聚合物, 如肌动蛋白丝, 这是不能自由调谐。尽管有这些限制, 由于缺乏合成, 机械可调谐, 和半聚合物, 肌动蛋白花丝被建立作为共同的模型系统。一个主要的限制是, 不能自由调整中心数量lp来研究其对宏观体积结构的影响。通过采用结构化可编程的 DNA 纳米管, 实现了对灯丝刚度的控制改变, 从而解决了这一缺陷。它们是通过型的设计形成的, 在这里, 一组离散的部分互补的链杂交在一个具有离散圆周的环形结构中。这些环的特点是粘性的两端, 使有效的聚合成丝数微米的长度, 并显示类似的聚合动力学作为天然的生物聚合物。由于他们的可编程的力学, 这些管是多才多艺的, 新颖的工具, 研究的影响, lp对分子和散装规模。与肌动蛋白丝相比, 它们在几周内保持稳定, 没有明显的变性, 它们的处理也比较简单。
Introduction
由于其独特的力学性能使复杂的行为, 半聚合物是基本的生活物质的基石。与柔性聚合物相比, 半聚合物采用了一种伸展的结构, 由于其非的骨架刚度, 同时仍受强热波动的影响1。因此, 纯粹的随机模型不能应用于他们的行为, 就像极端的完全灵活或刚性的聚合物。so-called 蠕虫样链模型2,3,4被开发为通过lp来量化此刚度, 它是沿灯丝4的切线相关的衰减常数。如果lp与灯丝的轮廓长度 (lc) 相媲美, 则该聚合物被视为半1。类似于帐篷的两极, 他们在网络或捆绑的安排稳定整个集体系统在低体积分数, 导致异常粘弹性属性5,6,7, 8,9。这些结构在大型网格大小10中提供了高弹性, 保持了机械完整性, 同时还促进了扩散和活动的传输过程。该特性特别适用于生物系统, 如骨架或胞外基质, 但它也广泛应用于食品工程1,11,12。
为了能有发展仿生材料或新型水凝胶的工具, 对这些结构的物理性质进行全面的检验, 对其意义深远。在半聚合物方面, 这意味着系统地确定由 single-filament 属性 (如lp和描述性理论框架的开发) 产生的网络的集体属性。在开创性研究中, 细胞生物肌动蛋白被建立为半聚合物的模型系统, 并仍被广泛认为是金标准5,13,14,15,16,17. 然而, 这一系统的详尽研究是有限的, 因为它们与这种蛋白质的固有特性息息相关。各种理论方法的目的是建立一个描述的非平凡的机械行为在 single-filament 水平, 并导致明显不同的比例预测的依赖线性弹性高原剪切模量, G 0 (即网络的 "弹性"), 就集中度 (c) 和lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23。虽然在 actin-based 或其他模型系统的实验中可以方便地进行浓度缩放, 而理论预测已得到严格验证13,16,24,25, 相对于lp的缩放在实验上仍然不可访问。但是, 这是一个主要的限制, 因为lp也是一个独立变量, 它是半聚合物的定义数量。
这种中央, 自然的限制强加由固定的lp的肌动蛋白或其他生物衍生聚合物, 如胶原蛋白, 最近已经解决了使用型 DNA 管, 这是可调谐的机械性能9,26,27,28. 管结构的细微变化 (例如,在单位环内的不同数量的组成 DNA 链) 产生独特的值为lp, 可以通过荧光显微镜进行评估,通过分析一个波动管或评估几个粘附管的弯曲配置, 如前面所描述的9,28。这些分析显示, 不同管种群的lp值在多个数量级上变化, 并且不同的评估技术产生一致的结果9,28。
令人惊讶的是, 线性弹性高原切变模量的整体比例G0关于浓度和lp已报告与所有以前的理论方法不一致9, 特别是在lp上演示了比预测依赖强得多的依赖性。这些发现强调了一个新的模型系统的价值, 研究半聚合物的中心性质。使用n-螺旋 DNA 管极大地拓宽了这些调查的范围。lp不仅可以在不改变基本材料的情况下自由变化, 而且 DNA 的固有可编程性可以使系统地检查其他元素, 如通道或动态切换过程。此外, 这些管子可溶于水, 与大多数蛋白质相比, 在适当的 pH 值和离子条件下稳定数周, 没有可检测的降解9。
为了组装这些管子, 我们使用了一组离散的 DNA 寡核苷酸, 每个都包含两个域, 共享互补的碱基序列到两个相邻的链 (由于特定的序列, 单链不能形成结构, 如发夹)。互补序列杂交的循环方式, 形成封闭的, half-overlapping 环的n互联的双段 (图 1A和 B)。这些环形成在一个离散的直径 (图 1C), 其 half-overlapping 配置暴露了轴向粘性两端互补的另一环的粘性两端。这种选择性添加匹配的寡核苷酸触发了环的堆叠, 导致有效聚合的丝状 DNA 螺旋管的大小n (nHT)。他们的外形长度通常测量几微米长度, 并且他们的长度分布是可比较的肌动蛋白花丝9,26,27,28。它已经证明了类似的 DNA 纳米管, 他们确实展示聚合动力学类似的肌动蛋白丝和微管内
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Protocol
1. 准备 n 高温超导
注: 在这里, n 表示在某一大小的螺旋管的形成中所涉及的不同单 DNA 链的数量。对于 n = 8, 八不同的单个 DNA 链组成一个单位环.
- 从合适的 dna 合成服务中购买 dna 序列 (HPLC 纯度级或更高), 或执行高质量的合成和纯化 (在 表 1 中给出的模范序列).
- 在纯化水中重冻干寡核苷酸, 并按照该公司相应手册中的进一步悬浮步骤进行操作。调整水量以获得200和 #181 的最终浓度; m.
- 确定单个 DNA 链的浓度以验证分销商给出的值 (例如, 通过 260 nm 的紫外-可见光谱), 因为精确的化学计量对装配过程至关重要。计算的浓度的寡核苷酸, 考虑到特定的摩尔重量和消光系数的每单 DNA 寡核苷酸.
注意: 消光系数值在不同的序列中固有的变化, 并在商业购买的 DNA 文档中注明。它们也可以根据最近的邻居模型, 使用一些免费的在线工具来计算。为了符合光谱仪的线性范围, 考虑稀释用于浓度测定的样品. - 使用微, 混合 DNA 链-每个在同一 concentration-in 一个容器适合 thermocycler ( 例如, 200 和 #181; L PCR 管) 形成所需的 n 高温超导 (最后的缓冲条件: 1xTE (10 毫米三和1毫米 EDTA, pH 8) 和12.5 mM 氯化镁 2 ).
注: 最终的 DNA n HT 样本包括 n -1 股, u 1 和 #8722; u n 和 #8722; 1 和一个 T n 链。每股的浓度可以从 sub-micromolar 到超过10和 #181; m, 根据用户的需要 ( 例如, 和 #60; 1 和 #181; m 每绞线为以后稀释观察单丝或更高的集中为考试密集的网络力学). - 杂交 n thermocycler 中的高温超导 (在90和 #176 中变性为10分钟; c, 随后快速下降到65和 #176; c; 缓慢的温度从65和 #176 下降; c 到55和 #176; c, 在20温度步长为-0.5 K 的互补基配对每个;从55和 #176 的快速下降; c 到20和 #176; c);请参见 图 2A .
注: 缓慢下降步骤从65和 #176; C 可以延长, 以增加平均管长;然而, 随后的快速下降到20和 #176; C 是至关重要的, 以避免聚合的聚合管. - 存储杂交 n 高温超导3周, 在4和 #176; C 无可检测的降解.
注: 对于荧光显微镜, 标记的 n 高温超导是由 (部分) 取代 U1 与修改后的 U1-Cy3 ( 表 1 ) 杂交的。对于较长的观察时间, 建议添加已建立的 anti-bleaching 剂. - 仔细地将样本稀释到所需的最终浓度 ( 例如, 4 和 #181; M 用于网络或 20 nM 的 single-filament 观测) (如有必要) 使用示例缓冲区。为了尽量减少可能的误差源, 在所需的最终浓度下装配样品.
2。剪切流变学
- 为动态剪切流变仪选择合适的几何 (板-板或锥板)。对于小容量 ( 即, 低于200和 #181; L), 使用锥板几何.
- 在动态剪切流变仪上加载示例.
- 使用以下步骤钝化采样和环境的气水界面, 以防止潜在的蒸发效果.
- 将样品与2.5 毫升的样品缓冲浴包围.
- 添加表面活性剂略低于胶束浓度.
- 使用哈密尔顿注射器将样品与油脂包围, 以避免样品与空气直接接触.
- 用带有湿海绵的帽盖密封样品室, 如果可能的话, 用一个额外的水浴 (不与样品接触) 来进一步抑制蒸发.
- 在室温下使用流变仪特定的软件开始测量; 或者, 在不同温度下执行测量, 如37和 #176; C (如果需要生理条件).
注: 冷却试样通常伴随着水蒸气从周围空气中凝结而来, 而加热则会导致蒸发的增强。这两种效应都可能无法改变样品的浓度, 所以系列中的所有测量都应在恒定温度下进行. - 允许样品在室温下平衡2小时。时间的演变可以监测时间扫描 (每分钟一个数据点; 应变 和 #947; = 5%; 频率 f = 1 Hz).
- 使用所需的测试协议测量机械属性。从一系列频率扫描 ( f 扫描) 开始, 因为它们保持原样, 并允许更多的测量.
注意: 此外, 短的 f -扫描应在较长的测量之前和之后进行 (如长的 f --用更高的分辨率进行扫描), 以验证整个测量协议中的样本保持不变。- 执行短 f 扫描 ( 如 和 #947; = 5%; f = 0.01 赫兹到30赫兹;每十年5数据点).
- 执行 long f 扫描 (, 如 和 #947; = 5%; f = 0.001 赫兹到30赫兹;每十年21数据点);低频的制度可以省略, 如果没有必要减少测量时间.
- 执行短 f 扫描.
- 执行和 #947;-扫描 ( 例如, f = 1 Hz; 和 #947; = 0.0125% 到 100%;每十年20数据点).
注意: 首先使用短 f 扫描, 因为它通常与以前的 f 不一致-扫, 因为网络通常在 #947 时破裂;-清除或从板上分离。或者, 使用和 #947;-斜坡 ( 例如, = 0.025 s -1 , t = 六十年代);然而, 坡道通常需要改变电机模式, 所以随后的短 f 扫将是伪造的.
- Bin 和/或使用高斯内核平滑原始数据.
3. 荧光辅助分析 DNA 退火
- 准备8等分12和 #181; L 为每个样本使用1-4 和 #181; 每个链的 M DNA, 12.5 mM 氯化镁 2 在 1x TE 缓冲区, 和1x 核酸凝胶染色从10,000x 亚砜股票.做一个没有 DNA 的负控制, 但包括核酸凝胶染色.
- 将等分转移到 real-time PCR 板上, 并用粘合剂膜密封 ( 例如, 96-井反应板).
注: 热退火协议中使用的高温将蒸发样品。因此, 确保水井是紧密密封的胶膜, 以防止水的蒸发和浓度增加, 特别是在长期的实验. - 在室温下离心 100 x g 1 分钟以除去气泡; 如果气泡膨胀, 则无法分析油井.
- 将密封板装入 real-time 定量 PCR 系统.
- 运行退火程序。变性90和 #176 的 DNA; c 为10分钟, 将温度快速降到72和 #176; c。然后, 缓慢地将温度降低0.5 和 #176; C 每30分钟。信号衰减后, 加速温度斜坡.
注:72 和 #176; C 是足够以上的实际杂交温度;因此, 信号是记录在一个广泛的温度范围, 适合确定必要的温度范围. - 确保循环的盖子加热到至少100和 #176; C 防止在粘合剂膜上蒸发样品的凝结.
- 在组装过程中, 用氩离子激光在 488 nm 激发样品, 在使用核酸凝胶染色 (或光谱类似) 时检测 550 nm 的荧光。对于其他染料, 选择合适的励磁/排放组合。使用内置摄像头, 尽可能多地测量荧光信号以提高整体信号质量.
注: 在这里, 测量每9秒采取. - 如果应用预设的熔化和退火程序, 请使用所提供的软件对数据进行分析。如果不是, 则从每个温度步长的平均值中减去先前的平均值, 以获得荧光信号的相对变化.
4。AFM 成像
- 劈云母 (, 如, 云母和 #34; V1 和 #34;) 通过附加商业可用的胶带和翻录它; 云母的最高层应该被去除。
- 使用微, 存入预先 n HT 在 Mg 2 + 包含在新劈开的云母的折叠缓冲区, 让它解决10分钟
- 将样品以短3秒的间隔在 2000 x g 的小表离心机上旋转以除去剩余的液体。几个 n 高温超导仍应连接到云母表面.
- 使用具有高刚度的悬臂尖端 ( 例如, 54 Nm -1 ), 并用内部 AFM 软件确定其谐振频率.
- 在低扫描速率 ( 例如, 1 线/秒) 的情况下, 用 AFM 在空气中记录高度剖面以避免损坏或取代 n 高温超导.
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Representative Results
通过温度斜坡 (图 2) 进行 DNA 纳米管的组装是形成这些人造半聚合物的一种非常可靠的方法。这些聚合物与自然发生的对应物有相似的特征, 例如肌动蛋白丝, 但提供一个更加宽广的实验框架, 因为他们的机械物产可以被控改变9,27.与生物聚合物一样, 它们可以在网络中进行排列 (图 3), 并特别允许一个测试纤维刚度对体积结构和性能的影响。如图 4所示, 这些网络显示了10% 的菌株的线性应变机制, 这与肌动蛋白丝的网络特征非常相似。在这一制度下, 线性剪切流变学可以很容易地应用, 例如, 以确定的弹性和粘性反应的 DNA 纳米管网络探测不同频率9。这些测试表明这些网络主要表现为弹性 (图 5)。与蛋白质的测量相反, 这些管子在样品的气水界面不变性, 因此需要复杂的钝化策略 (图 6)。因此, 对样品的处理是相当直接的, 证明是非常稳健的, 产生一致的结果与低 sample-to-sample 的变化。
然而, 在每个管两端的未配对单 DNA 的自由 "粘性末端" 是否能诱发不受欢迎的随机杂交事件的问题仍然存在。为了解决这一问题, 在杂交过程完成后, 在样品中添加了覆盖管子两端的互补 "端盖" 序列。但是,图 7说明, 对灯丝两端的封盖没有可检测的影响, 并且管端不会在网络9中引起任何瞬态交联效应。当样品处理得太粗略, 而管子因严酷的移而破裂时, 粘接事件只会起到重要作用。这些破损点确实会引起交联效应, 导致系统的非线性反应, 如应变硬化 (图 8)。
如果样品经过精心准备, 它们可以用来测试灯丝浓度 (图 9A) 或灯丝刚度 (图 9B)9对网络的机械性能的影响, 包括半聚合物。首次对纤维刚度与网络弹性之间的定量联系进行了实验和系统的研究, 产生了线性幂律行为, 这与主要的理论预测相矛盾。这些结果表明, DNA 纳米管是一个新的, 通用的工具来研究半聚合物的影响, 这是以前的实验无法访问9,27。现在, 可以对各种理论进行实验测试, 涉及对长丝的持久长度lp 的依赖关系的语句。此外, 非常基本的影响, 如蠕动 (图 10), 可以从不同的角度来调查, 通过使用不同的刚性管。
| 名称 | 序列 | ||
| U1: a1*-b1*-a2-b2 | GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U1-Cy3: a1*-b1*-a2-b2 | Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U2: a2*-b2*-a3-b3 | GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT | ||
| U3: a3*-b3*-a4-b4 | GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT | ||
| U4: a4*-b4*-a5-b5 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT | ||
| U5: a5*-b5*-a6-b6 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT | ||
| U6: a6*-b6*-a7-b7 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG | ||
| U7: a7*-b7*-a8-b8 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA | ||
| U8: a8*-b8*-a9-b9 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA | ||
| U9: a9*-b9*-a10-b10 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC | ||
| U10: a10*-b10*-a11-b11 | TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT | ||
| U11: a11*-b11*-a12-b12 | AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA | ||
| U12: a12*-b12*-a13-b13 | ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA | ||
| U13: a13*-b13*-a14-b14 | GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC | ||
| T4: a4*-b4*-a1-b1 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T5: a5*-b5*-a1-b1 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T6: a6*-b6*-a1-b1 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T7: a7*-b7*-a1-b1 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T8: a8*-b8*-a1-b1 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T9: a8*-b8*-a1-b1 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T10: a10*-b10*-a1-b1 | GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T14: a14*-b14*-a1-b1 | TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| 端盖 A1 | CCTAATCGCC | ||
| 端盖 A2 | CCTTTAGATCC | ||
| 端盖 A3 | CCACTCTTCC | ||
| 端盖 A4 | CCGTGAGAACC | ||
| 端盖 A5 | CCGCACGACC | ||
| 端盖 A6 | CCAACGATGCC | ||
| 端盖 A7 | ATGCACCTCC | ||
| 端盖 A8 | AACGGTAACTA | ||
| 端盖 B1 * | ACGCTAAGCCA | ||
| 端盖 B2 * | ACCAGATACA | ||
| 端盖 B3 * | ACAAGATGTCA | ||
| 端盖 B4 * | ACGCATTGCA | ||
| 端盖 B5 * | ACTGTCGAACA | ||
| 端盖 B6 * | ACTTCTATCA | ||
| 端盖 B7 * | CATTCAAAGCT | ||
| 端盖 B8 * | TCCCAAGTCA | ||
表 1: 在图1C 中显示的n高温超导杂交的 DNA 序列示例, 在以前的研究中也使用过n高温超导9, 类 = "xref" > 26,27,28.给定的序列集允许七不同的管结构 (例如, a1 hybridizes 与互补序列 a1 *) 的组装。在这里没有给出的其他管结构也可以由链的加法或减法组成, 并伴随着n与 U1的链环环化。
图 1: 管总成和结构。(a)由四种不同的 42-市面组成的4HT 的装配示意图。相邻的单 DNA 链杂交通过连续交替域10-11 基地, 由长的黑蜱指示 (短的黑蜱表明 unhybridized 基地)。这 half-staggered 主题的特点是粘性两端沿轴, 使轴向增长, 由箭头指示。边界链 U1 和 T4 也具有互补域, 从而形成一个闭合环, 如右箭头所示。请注意, 这个草图是一个2D 表示;在杂交态中, 链形成双螺旋和所有碱基配对。(B) Quasi-3D 4HT 聚丙烯的示意图, 两个双螺旋覆盖在阴影的远层。双螺旋形式的互补域, 并链接到两个相邻的双螺旋的管每单位长度的元素。一个 U2 的股被拉长, 以清晰。(C)给出了七种不同管结构的示例, 其子线数从 4 ht 到 14 ht, lp范围从1.2 到26µm. (D和E) Cy3-labeled 的 Epi 荧光图像, 吸附 5 HT10 HT 通过不同的弯曲轮廓说明不同的刚度。红色叠加是通过图像分析找到的长丝轮廓, 具有端对距离 R 和等高线长度 lC。图改编自 Schuldt et al9。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 温度斜坡和相应的 DNA 纳米管组装.(A) DNA 纳米管在 thermocycler 中通过包含多个不同温度步骤的协议在一个 real-time 定量 PCR 系统中进行组装, 而染色链的荧光信号的相对变化是一种测量新形成的双 DNA, 同时通过温度斜坡。根据 DNA 纳米管的类型, 组装速率可能不同。更复杂的形成结构, 更广泛的装配, 想必是因为更多的股 (因此更多的片段与不同的序列和局部退火温度) 需要杂交在适当的位置, 一个过程, 这是驱动随机热涨落。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 有代表性的 AFM 图像的纠缠网络8HTs 在4µM.利用空气中的攻丝模式, 记录了8HTs 在云母表面吸收的预制网络的高度剖面。AFM 图像可视化网络的2D 投影, 但不允许对3D 情况的数据 (例如,网格大小) 进行可靠的提取, 因为在2D 配置中压缩了管道和网络。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 线性范围.应变测量 (G= 1 Hz) 揭示了一个宽广的线性弹性高原, 没有交联效应的迹象, 如表现为应变硬化的非线性行为。在特征应变之上 (每个nHT 不同), 弹性高原模数不可逆转地断开。每个误差线表示所有已执行测量的平均值的标准偏差。图改编自 Schuldt et al9。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 纠缠6HT 网络的典型频率依赖性DNA 管网显示了一个广阔的弹性高原超过四数量级, 根据应用的频率。如预期的聚合物网络, 弹性部分 (g) 的复杂剪切模量明显高于粘性部分 (g)。图改编自 Schuldt et al9。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6:无气接口效果频率扫描 (f-扫描; γ = 5%) 的8HT 样品在8µM 表明, 蒸发和凝胶作用的影响在水下界面是微不足道的。不同的平衡时间, 以及两种方法, 以大幅减少蛋白质聚类在界面 (表面活性剂和血脂), 使用。与该方法无关, 没有记录蒸发或表面弹性的剧烈影响的迹象。在这里, g 代表弹性模量和 g "表示粘性模数 (虚线)。图改编自 Schuldt et al9。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: 没有最终修改的影响.弹性高原模量保持恒定时, 上限的粘性自由两端的 8HTs, 其各自的互补序列。图改编自 Schuldt et al9。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: 预制 DNA 网络的处理过程对测量的影响.根据在杂交后预制网络是如何处理的, 测量可能会有所不同。在这个例子中, DNA 纳米管移期间的剪切流发生了剧烈变化, 如果处理得太粗略, 管破裂。破损导致暴露的、互补的 single-strands 与破裂或破裂段之间的不必要的相互作用, 从而导致弹性的增加并诱发非线性效应, s作为应变硬化 (大应变, 绿色曲线的增加弹性)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 9: DNA 纳米管允许研究lp依赖项。(A)研究半聚合物的网络与n高温超导使研究系统的机械响应随着浓度的增加 (浓度扫描), 类似于基于生物大分子的研究, 如肌动蛋白。(B)此外, 管壁的不同结构有助于确定基础丝的变化的lp的机械响应, 这是不可行的自然发生半聚合物。为此, A中的数据是 replotted 的, 以解决与lp有关的弹性平台模数的缩放问题。每个误差线表示所有已执行测量的平均值的标准偏差。图改编自 Schuldt et al9。请单击此处查看此图的较大版本.
图 10: 蠕动和网格大小.记录 reptating 丝 (single-labeled DNA 8HT 嵌入在未标记网络中的荧光图像;c = 14 µM) 可用于验证网络中灯丝的纠缠性质。任何交联效应都会阻碍这种 one-dimensional 扩散。插图: 蠕动分析可用于确定网格尺寸的浓度, 这与肌动蛋白测量很好的比较, 并同意理论预测30。每个误差线表示所有已执行测量的平均值的标准偏差。图改编自 Schuldt et al9。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
要获得适当形成的网络, 组装 DNA 纳米管是一个关键的步骤。合成过程中的误差对管质量产生负面影响;因此, 建议采用 HPLC 法或更严格的工艺来纯化寡核苷酸。由于离散而非聚合的 DNA 纳米管的形成, 以及它们的长度分布, 取决于集合中的n组成的寡核苷酸的摩尔化学计量, 因此必须测量浓度被购买的子线, 因为被给的价值可能从实际集中极大地变化。例如, 可以通过紫外可见光谱在 260 nm 的吸收波长上进行。我们想指出的是, 分子量和消光系数在不同的序列之间有差异;因此, 对于每个 DNA 寡核苷酸, 都应确定将吸收度转化为浓度的值。当使用针对小样本卷 (如 NanoDrop) 进行优化的设备时, 每个测量点都应采取多次和平均值。符合光谱仪的线性检测范围。如有必要, 稀释用于浓度测定的分数。轻微的不精确性会对正确的化学计量和管组质量产生较大的影响;因此, 单股的移必须尽可能精确。随后, 最后的样品解决方案应彻底混合, 慢慢移样品, 然后放入 thermocycler。如果用荧光染料对绞线进行了可视化处理, 则所有步骤都应在保护不受直射光的环境中执行, 并在以后添加已建立的 anti-bleaching 代理 (即氧清除系统, 如葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶) 建议。在正确的缓冲条件中混合了单股后, 应用温度斜坡杂交结构 (图 2A)。这种温度模式遵循先前确定的临界杂交温度, 其中 DNA 双螺旋的形式。已经开发了几种方法来分析 dna 杂交动力学 (即,本机 dna UV 吸光度31, 量热仪32, 或荧光染料33)。在后一种方法中, 染料1583年成 DNA 双螺旋, 形成比未粘合的染料更亮的高荧光络合物。它们部分地绑定到双, 但不能单 DNA34。因此, 这种染料已被应用于监测 DNA 纳米结构自组装在系统的35 , 并可用于确定理想的装配条件。
最初, 在样品中的任何双 DNA, 如预定义的和预测的复式, 在高温 (90 ° c) 下变性, 以避免意外的碱基配对。随后的温度逐渐下降 (类似于图 2A) 可以减少 DNA 链的热运动, 从而使基本的剥离事件发生。由于自由能的极小化, 脱氧核糖核酸股优先杂交在他们的互补序列。当采用 dsDNA 特异性插染料时, 亮度随着高荧光配合物的形成而增加, 这反过来又为新形成的双 DNA34的定量测量。在图 2B中绘制了4HTs 和8HTs 形成的荧光信号的相对变化。这种相对变化是通过平均每种温度的荧光强度来计算的, 然后减去先前温度的平均值。随着温度的降低, 可以检测到高荧光 (图 2B), 这一曲线的峰值突出了大规模杂交事件发生的温度。曲线的下降是指强度值达到一个高原。根据 dna 结构及其复杂性 (例如,一组小或大的 dna 链), 峰值可以是尖锐的 (图 2B, 蓝色曲线) 或宽 (图 2B, 绿色曲线)。在可能的情况下, 应该对每一个新设计的结构进行测试, 以确保温度斜坡逐渐减少的部分包含通过形成杂交 dsDNA 段产生的管子的范围。在确定合适的温度后, 纳米结构可以在非常窄的温度范围 (图 2B、蓝色曲线) 中成功组装, 甚至等温35。注意, 周期晶格中的多个 dna 链杂交诱导了协同退火效应35,36, 它支持进一步的 dna 退火。应该认为, 插染料做拉伸 DNA 螺旋超出其标准的10.5 基对每个螺旋转向配置, 从而改变了整体几何的管。因此, 在每 900 DNA 碱基对35上提高一个分子的染料浓度是不可取的。此外, 峰值装配温度可能偏离实际最佳退火温度。为了达到较高的精度和确定最佳的管组条件, 应研究 DNA 杂交在许多缓慢变化的温度步骤, 这应该是双重检查琼脂糖凝胶电泳。对于 DNA 纳米管的情况, 我们建立了一个三步的协议。首先, 将样品加热到90° c, 将 DNA 变性成单链。随后, 宽广的温度范围 (在荧光信号的装配峰顶附近) 被盖。在我们的情况下, 范围10° c 被盖, 从65° c 到55° c, 与步-0.5 ° c 每 30 min。在最后一步中, 温度应该迅速降到室温--或者在我们的情况下, 20 ° c--以防止中间温度的任何不利的交互 (图 2A)。通常, thermocyclers 将样品从较冷的温度中加热。因此, 在装配过程中, 调整盖子的温度以限制样品中液体的蒸发是很重要的, 这会增加最终样品的浓度。
如果n高温超导是适当形成的, 它们就会排列成纯粹的纠缠网络 (图 3), 而不会导致不同管之间的交联效应。通道可能是由不配对的 DNA 片段延伸, 从缺陷沿管或在粘性两端, 这将是免费的配对与互补的单段在相邻的管。这些效应会引起非线性特性, 如应变硬化 (增大G), 但它们在纠缠网络中是不存在的 (图 4)。所显示的γ扫描还揭示了一般的流变测量的适当线性应变机制。在一定的阈值以上时, 网络与流变仪的板破裂或失去接触, 从而对系统造成不可逆转的损害。因此, 应用菌株应在线性机制中获得可靠的数据。通常情况下, 5% 的应变足以使数据远远高于噪音机制。可应用较高菌株;但是, 它们容易接近破裂阈值, 结果可以 falsifi由于测量在非线性的制度。
流变测量需要仔细、一致地准备样品, 并仔细考虑测量协议, 以获得可重复和解释的结果。中心点是建立一个完全随机, 各向同性的网络之间的流变仪板块, 因为这些网络大多是唯一的可再生结构。因此, 需要较长的平衡时间 (通常约2小时, 有时甚至更多), 以分散任何排序的影响, 由于剪切诱导对齐在移的样品。为了确定必要的时间框架, 建议在平衡过程中记录系统的时间演化 (时间扫描) 的预测试实验。一旦信号到达高原没有进一步的变化, 系统是平衡的。一旦确定了平衡条件, 就可以执行所需的测试, 如应变斜坡或 f-或γ扫描。测试广泛的菌株可以最终摧毁网络或与板块的连接。但是, 如果测试仅限于破裂阈值以下的应变, 则可以反复重复进行压力斜坡和扫描, 以调查潜在的老化或滞后效应。在f-扫描的情况下, 测量时间可能会有很大变化。由于一个振荡可能需要几分钟的时间, 因此测试低频率会大大延长实验。请注意, 在n高温超导的情况下, f-扫描显示, 弹性模量g"超过粘性模数g" 的大小约为一级, 这说明了这些系统的主要弹性响应 (图 5)。一般来说, 不同类型的实验可以伴随着短的f-在主实验前后进行扫描, 以验证系统是否仍然不受测量本身的干扰。然而, 有些机器必须改变不同类型的测量的底层马达模式, 特别是当从动态实验 (例如,振荡为f扫) 到静态应变斜坡。这种变化往往伴随着自发的大应变破坏网络和回火随后的测量。因此, 建议检查使用的流变仪的规格。
actin-based 系统的流变实验揭示了在系统的气水界面上发生蛋白质变性的戏剧性效应。变性蛋白质相互黏附空泛, 从而形成一种致密的凝胶, 可以高度控制整个系统的机械性能。为了防止样品与周围的空气直接接触, 还可以使用钝化技术来抑制样品的水分蒸发。三潜在的方法是: (i) 围绕样品室与样品相同的缓冲;(ii) 使用表面活性剂来覆盖界面, 由于其疏水性和亲水性领域 (必须小心, 因为一些表面活性剂干扰聚合物构象);或 (iii) 采用更符合生物相容性的脂质, 其作用与表面活性剂相似。应该注意的是, n高温超导没有被发现在界面上受到变性的影响, 结果与钝化方法 (图 6) 无关, 从而消除了主要的潜在错误来源。一般情况下, 样品室应始终用一顶帽密封, 可配有潮湿的海绵以增加室内的湿度, 抑制蒸发。
如前所述, dna 系统中的一个潜在的错误源是 unhybridized dna, 如缺陷的未配对单 dna 或纳米管的两端, 这可能会引起额外的交联效应。为了调查和/或消除这种可能性, 互补短链可以用来限制这些粘性的两端。然而, 我们自己的调查显示, 加盖线对引入的n高温超导没有影响, 纠缠网络的行为保持不变 (图 7)。但是, 用互补序列封盖粘性端点对于其他 dna (和更复杂的) 系统可以有效地抑制不需要的交互。此外, n高温超导体的样品应 pipetted 小心 (如:),以用于稀释步骤和样品制备), 以防止对管子的任何破坏或其他损坏。如果溶液的 pipetted 太过粗略, 管子就会失控, 在缺陷点处暴露大量的粘性末端, 导致管道中的不必要的相互作用和系统中潜在的交联。这会干扰信号并导致加劲效应, 以及非线性效应, 如应变硬化, 在γ扫描中变得可见 (图 8)。因此, 移的纠缠解决方案只应缓慢地进行, 并使用一个相当大的直径的吸管尖 (可取的吸管尖端的末端), 以减少对管的剪切力。
总之, DNA nHTs 是一个适合的和高适应性的模型系统来研究的半聚合物和体积网络形成的这些细丝, 代表了一个新的类机械可调谐水凝胶。如果管子是精心准备的, 它们可以用来测试各种情况下灯丝的lp的影响。例如, 纠缠网络的体积流变测量表明, 理论预测的弹性模量与浓度和lp的相关性与实验推导出的尺度不一致法律 (图 9)9。本研究强调, 通过增加底层聚合物的刚度, 可以提高网络的弹性。传统上, 增加水凝胶的刚度是通过增加更多的聚合物的解决方案或诱导通道 (物理或化学) 相邻的聚合物37,38。然而, 更高的分子含量也与减少的网格大小相关, 它可能限制应用例如3D 细胞文化。另一方面, 通道可以在底层网络体系结构中引起复杂的形态学变化, 从而进一步复杂化了机械性能的精确调整39。但是, 使用n高温超导网络可以完全解耦这些参数, 从而可以通过仅改变底层丝的刚度来诱发加劲效应, 同时保持网格大小不变。此外, 管结构可以特别改变, 以有选择地整合额外的影响, 如交联, 这同样在纠缠网络, 创造进一步的可能性, 实验测试的理论预测参数, 如lp或网络的交联大小和强度。通常, 可编程的体系结构拓宽了应用程序的范围, 允许对lp相关的影响的研究不仅在大容量, 而且在分子级别。在网络中可以嵌入标记的管, 例如, 对管状禁闭中灯丝的 one-dimensional 运动的lp的依赖性, 通常称为蠕动 (图 10)9。如果这种扩散运动是可见的, 它也验证了纠缠性质的网络, 因为它会被抑制的交联效应。分析底层动力学也揭示网络的网格大小。此外, 这些管可以用来调查的依赖刚度和手的基础管的形成捆绑40,41,42,43,44,45或高阶结构, 如星形紫苑46、47、48、49、50, 可通过交联效果或通过分子拥挤的环境27。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们承认 DFG (1116/17-1) 和莱比锡自然科学学校 "BuildMoNa" (GSC 185) 的资助。这项工作得到了通过弗劳恩霍夫吸引项目 601 683。骅承认欧洲社会基金 (ESF-100077106) 提供的资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM - NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore - Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
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