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Neuroscience

नर्व-मुक्त के निर्माण और दीर्घकालिक रखरखाव Published: July 7, 2017 doi: 10.3791/56115
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,2
1Division of Biological Sciences, UC San Diego, 2Physics Department, UC San Diego

Summary

कोलेचिइसन के साथ एक डबल उपचार के माध्यम से, एक प्लांट-व्युत्पन्न विष है जो कोशिकाओं को विभाजित करता है, तंत्रिका मुक्त हाइड्रा वल्गरिस उत्पन्न किया जा सकता है। ये हाइड्रा अपने दम पर फ़ीड नहीं कर सकते हैं या नहीं कर सकते हैं। यह पत्र प्रयोगशाला में तंत्रिका मुक्त हाइड्रा वल्गरिस के दीर्घकालिक रखरखाव के लिए एक बेहतर तरीके का वर्णन करता है।

Abstract

हाइड्रा की मध्यवर्ती सेल वंश में बहुसंख्यक स्टेम कोशिकाएं शामिल हैं, और उनके डेरिवेटिव: ग्रंथि कोशिकाएं, नेमाटोसाइट्स, जर्म सेल और तंत्रिका कोशिकाएं। अंतस्परिक कोशिकाओं को लगातार दो उपचार के माध्यम से समाप्त किया जा सकता है, जो एक प्लांट-व्युत्पन्न विष है जो कि कोशिकाओं को विभाजित करता है, साथ ही दो अलग-अलग उपचारों के माध्यम से समाप्त किया जा सकता है, इस प्रकार अंतरालीय स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त विभेदित कोशिकाओं के नवीकरण की संभावना नष्ट हो जाती है। यह तंत्रिका कोशिकाओं की कमी वाले हाइड्रा की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है तंत्रिका रहित पोलीप अपने मुंह को खिलाने, आसवन, दबाव या आसमाटिक दबाव को नियंत्रित नहीं कर सकता। हालांकि, ऐसे जानवरों को जीवित रहने और प्रयोगशाला में अनिश्चित काल तक सुशोभित किया जा सकता है, यदि नियमित रूप से बलपूर्वक खिलाया जाता है और फटा हुआ होता है। तंत्रिका कोशिकाओं की कमी पशु व्यवहार और पुनर्जनन को विनियमित करने में तंत्रिका तंत्र की भूमिका के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। तंत्रिका मुक्त Hydra रखरखाव के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल में जुड़ी हुई तकनीक जैसे हाथ-खींचा माइक्रोप्रोपेट टचहाइड्रा को भोजन और साफ करने के लिए ips यहां, नर्व मुक्त हाइड्रा के रखरखाव के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल पेश किया गया है। ठीक-छेड़े संदंश का उपयोग मुंह खोलने और ताजा ढंग से मार डालने वाली आर्टेमिया को सम्मिलित करने के लिए किया जाता है। बल-खिला के बाद, जानवरों के शरीर के गुहा को सिगरंज और हाइपोडर्मिक सुई का इस्तेमाल करके ताजा माध्यम से पिघल दिया जाता है, जिसे अपरिवर्तनीय सामग्री को निकालने के लिए कहा जाता है, जिसे "बर्चिंग" कहा जाता है। संदंश और सिरिंजों के इस्तेमाल से बल-खिला और नर्व-मुक्त हाइड्रा को मारने की यह नई पद्धति हाथ-खींचा माइक्रोप्रिपेट युक्तियों का उपयोग करके मुंह-पाइपेटिंग की आवश्यकता को समाप्त करती है। इस प्रकार यह प्रक्रिया को सुरक्षित और काफी अधिक समय कुशल बनाती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि हाइपोस्टोम में तंत्रिका कोशिकाओं का सफाया हो चुका है, एंटी-टायरोसिन-ट्यूबिलिन का उपयोग कर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का आयोजन किया जाता है।

Introduction

हाइड्रा की तंत्रिका तंत्र में एक तंत्रिका जाल होता है, जिसमें उपकला टिशू परत 1 के साथ जुड़े न्यूरॉन्स होते हैं। तंत्रिका जाल हाइपोस्टोम और पेडनीकल में घनी होती है और शरीर के स्तंभ 2 में घनी होती है। तंत्रिका कोशिकाएं अंतःस्राय स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न होती हैं, जो मल्टीपीटेंट स्टेम कोशिकाएं होती हैं जो कि स्रावी कोशिकाओं, नेमाटोसाइट्स, जर्म सेल और न्यूरॉन्स 1 को जन्म देते हैं। कोलेचिइन्सन 3 , 4 के साथ उपचार के माध्यम से हाइड्रा वल्गरिस के अंतरालीय कोशिकाओं को खत्म करना संभव है, एक पौधे से व्युत्पन्न विष है जो कोशिकाओं को विभाजित करता है। हालांकि कोलेचिइन्स को अन्य जीवों में माइक्रोट्यूबल पॉलिमराइजेशन को बाधित पाया गया है, पिछले अध्ययन में यह पता चला है कि पूरे उपचार में हाइड्रा में माइक्रोट्यूब्यूल मौजूद हैं, यह सुझाव देते हैं कि कोल्विकिसिन हाइड्रा 3 में इस तरह से कार्य नहीं करता है। एक और सेंटऔडी से पता चलता है कि कोलेचिइसन कुछ जीवों में ट्यूबिलिन को कुशलता से बाँध नहीं करता है, जिसमें थेट्रायमेन पिरैरिमिरीस , ज़िया मेस, क्लैमिडोमोनास और स्कीज़ोसाकार्मीयस पॉम शामिल हैं, जो इस अंतर की व्याख्या कर सकते हैं 5 । कोलेक्विइन उपचार में अंतःस्रावी उपकला कोशिकाओं द्वारा अंतःस्राय कोशिकाओं के phagocytosis लाया जाता है और इस प्रकार उन जानवरों के निर्माण के लिए अनुमति देता है जो तंत्रिका कोशिकाओं, ग्रंथि कोशिकाओं और निमेटोसइट्स की कमी कर रहे हैं। यह स्पष्ट नहीं है कि अंतःस्राय कोशिकाओं को कोल्विकिन उपचार के लिए अतिसंवेदनशील क्यों है। यह देखते हुए कि पोस्ट-माइटोटिक मध्यवर्ती कोशिकाएं और अंतःस्राय स्टेम सेल वंश को क्षतिग्रस्त कर दिया गया है और फागौसीटॉज किया गया है, कैंपबेल ने निष्कर्ष निकाला है कि कोलेचिइसन सीधे मैटोटिक गतिविधि को प्रभावित नहीं कर रहा था 3 । विशेषकर, कॉल्विकिन उपचार हाइड्रा वल्गरिस में अच्छी तरह से काम करता है , लेकिन अन्य प्रजातियों में भी काम नहीं करना दिखाया गया है, जैसे कि हाइड्रा ऑलिगैक्टिस 6 । Hydra viridis 7 का उत्पादन करने के लिए colchicine और hydroxyurea के साथ एक संशोधित उपचार का उपयोग किया जा सकता है। तंत्रिका मुक्त हाइड्रा (जिसे कभी-कभी "उपकला हाइड्रा " 8 कहा जाता है) इसलिए ऊतक होमोस्टेसिस में मध्यवर्ती कोशिका वंश और पुनर्जन्म में इन विशेष सेल प्रकार की भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।

हाइड्रा नर्वस सिस्टम के बिना जीवित करने में सक्षम जानवर का एकमात्र ज्ञात उदाहरण हो सकता है। तंत्रिका मुक्त हाइड्रा हाइड्रा पुनर्जनन, होमोस्टैसिस, और व्यवहार को विनियमित करने में तंत्रिका जाल की भूमिका के विदारक के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी मॉडल के रूप में काम करता है। उदाहरण के लिए, तंत्रिका मुक्त हाइड्रा में मध्यवर्ती कोशिकाओं का परिचय ग्राफ्टिंग के माध्यम से तंत्रिका सेल भेदभाव के लक्षण वर्णन के लिए अत्यधिक क्षेत्र-विशिष्ट 9 के रूप में होता है । इसके अलावा, क्योंकि तंत्रिका मुक्त हाइड्रा पुनर्जीवित कर सकते हैं, वेवैकल्पिक, तंत्रिका तंत्र-स्वतंत्र पुनर्जनन मार्गों की जांच को सक्षम करें ऐसा ही एक उदाहरण अपिशनल न्यूरोजेनेसिस और सिर का गठन है, जो कि जंगली सूक्ष्म हाइड्रा में तंत्रिका तंत्र में cnox-2 फ़ंक्शन पर निर्भर करता है, लेकिन तंत्रिका-मुक्त हाइड्रा में अव्यावहारनीय प्रतीत होता है, यह सुझाव देता है कि वैकल्पिक प्रमुख पुनर्जनन प्रक्रिया हो सकती है 10

न्यूरोजेनेसिस 11 के नुकसान के बाद उपकला सेल अभिव्यक्ति और न्यूरोजेनिक और न्यूरोट्रांसमिशन जीन का नियमन करने के लिए नर्व-फ्री हाइड्रा का भी उपयोग किया गया है। तंत्रिका मुक्त हाइड्रा सहजता संकुचन फटने 12 को प्रदर्शित नहीं करती है, यह दर्शाता है कि इन फटने को तंत्रिका तंत्र द्वारा नियंत्रित किया जाता है। तंत्रिका मुक्त हाइड्रा , हालांकि, संदंश के साथ शरीर के कॉलम को छिड़कने के जवाब में अनुबंध करते हैं, यह सुझाव देते हैं कि मैकेनिकल उत्तेजनाओं के जवाब में संकुचन को मध्य युग्मन द्वारा मध्यस्थ किया जाता हैउपकला कोशिकाओं में एचएएच अंतर जंक्शन, जबकि स्वस्थ संकुचित व्यवहार तंत्रिका कोशिकाओं 13 में अंतर जंक्शनों के माध्यम से युग्मन द्वारा मध्यस्थता है।

नर्व-फ्री हाइड्रा भोजन या कम ग्लूटाथियोन 3 के साथ पेश किए जाने पर अपना मुंह नहीं खोलता, यह सुझाव देता है कि संवेदी न्यूरॉन्स भोजन की उपस्थिति का पता लगाने और खुले मुंह को संकेत देने के लिए आवश्यक हैं। इसके अलावा, तंत्रिका जाल आसमाटिक दबाव को समझने में एक भूमिका निभाते हैं, क्योंकि तंत्रिका रहित जानवर स्वभाव से अपने आंतरिक हाइड्रोस्टेटिक दबाव को मुंह खोलने से नियंत्रित करने में असमर्थ हैं, जिससे उनके लक्षण गुब्बारे की उपस्थिति 3 , 4 ( चित्रा 1 बी ) हो सकती है। लगातार मैन्युअल डिफ्लेशन द्वारा तंत्रिका मुक्त हाइड्रा में हाइड्रोस्टैटिक दबाव का विनियमन हाइपोस्टोम और बॉडी कॉलम में कुछ असामान्य आकारिकी का नुकसान हुआ। हालांकि, पुरानी अपस्फीति के कारण वृद्धि के साथ हस्तक्षेप हुआ, एलविचलन, उभरता हुआ, और ऊतक संगठन 8

हालांकि नसों से मुक्त हाइड्रा स्वयं को खिलाने में सक्षम नहीं हैं और इन्हें स्वयं पर बल देते हैं, इन्हें प्रयोगशाला में मैन्युअल रूप से बल-खिला कर और प्रत्येक जानवर को फेंकने से अनिश्चित काल तक बनाए रखना संभव है। पिछला प्रकाशनों ने बल-खिला और नर्व-मुक्त हाइड्रा को मारने के तरीकों का वर्णन किया है, हालांकि इन प्रोटोकॉल में सूक्ष्मदर्शी युक्तियों का उपयोग शामिल है, जिन्हें उचित आकार के साथ सावधानी से खींच लिया जाना चाहिए और साथ ही टिउइंग 14 द्वारा विंदुक से जुड़े मुखपत्र का उपयोग करना चाहिए। यहां, भोजन और बरामद करने का एक सरल, सुरक्षित, और अधिक समय-कुशल तरीका वर्णित है।

इसके अलावा, पिछले अध्ययनों में व्यक्तिगत कोशिकाओं में निश्चित जानवरों के पृथक्करण और कोशिका आकृति विज्ञान 3 , 4 , 15 की परीक्षा के माध्यम से तंत्रिका कोशिकाओं की अनुपस्थिति की जांच करना शामिल था। एचपहले, अल्फ़ा-ट्यूबिलिन के टीरोबर्टेड कार्बोक्जिल-टर्मिनस के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का प्रयोग हाइपोस्टोम 13 , 16 में न्यूरॉन्स की कमी की जांच के लिए मृदु करने के लिए एक मानार्थ तरीके के रूप में किया गया था। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि peduncle में न्यूरॉन्स भी इस एंटीबॉडी 13 का उपयोग करके देखे जा सकते हैं, हालांकि इन न्यूरॉन्स और साथ ही शरीर के कॉलम में उनको बाहर करना मुश्किल है। जबकि इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री हायोस्टोम में तंत्रिका कोशिकाओं की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पर्याप्त है और सेल प्रकार के आकारिकी पर विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है, इन्हें अंतरालीय स्टेम कोशिकाओं के अनुपस्थिति और इन कोशिकाओं के अन्य डेरिवेटिव्स का इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। पृथक्करण और कोशिका आकृति विज्ञान अध्ययन अधिक कठोर हैं और इलाज के प्रत्येक चरण के बाद शेष प्रत्येक सेल प्रकार की संख्या का एक मात्रात्मक खाता दे सकते हैं।

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Protocol

1. डबल कोल्चिसिन उपचार

  1. हाइड्रा मध्यम 3 , 4 , 17 में एक 0.4% कोलेचिइन (वजन / मात्रा) समाधान करें।
    सावधानी: कोलेसिसीन तीव्रता से विषैले होते हैं, अगर निगल लिया जाता है, तो आनुवंशिक दोष का कारण बन सकता है, और आँखों के नुकसान का कारण हो सकता है। एक धूआं हुड में पाउडर को संभाल लें और पूर्ण निजी सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें।
  2. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 8 घंटे के लिए पेट्री डिश में 5 हाइड्रा प्रति एमएल कोल्चेसिसिन समाधान के अनुपात में 0.4% कोलेचिइन्स में 24 घंटे के लिए हाइड्रा वल्गरिस (एईपी तनाव का इस्तेमाल किया गया था) का सेवन किया गया था।
    नोट: 5 हाइड्रा / एमएल कॉलीनिसिन हाइड्रा के साथ पकवान से अधिक धन से बचने के लिए उपयोग करने के लिए कितना समाधान का निर्धारण करने के लिए एक दिशानिर्देश है। बाद के क्लीनिंग्स और समाधान परिवर्तनों के लिए समाधान की समान मात्रा का उपयोग करें।
  3. कोल्विकिसन समाधान निकालें और बदलेंकोलेचिइन के बिना स्वच्छ हाइड्रा माध्यम के साथ। हाइड्रा माध्यम में 50 माइक्रोग्राम / एमएल रिफाम्पिसिन को स्थानांतरित करने से पहले हाइड्रा को एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ स्वच्छ हाइड्रा माध्यम में 5 बार धोएं। एक 18 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में हाइड्रा रखें।
    नोट: 1-2 सप्ताह के उपचार के लिए डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) में पर्याप्त 1000 एक्स रिफामिकिन स्टॉक (50 मिलीग्राम / एमएल) 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। सटीक राशि हर दिन उपयोग किए गए समाधान की कुल मात्रा से निर्धारित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि 2 व्यंजन होते हैं, तो प्रत्येक में 10 एमएल का समाधान होता है जिसे रोजाना दो बार बदलना पड़ता है, एक दिन में 40 मिलीलीटर समाधान का उपयोग किया जाएगा, प्रतिदिन 40 μL प्रति दिन या 560 μL दो सप्ताह की अवधि में फिर स्टॉक को हाइड्रा माध्यम पर 1: 1000 पतला किया जाता है।
    सावधानी: डीएमएसओ एक दहनशील तरल है और आसानी से त्वचा में प्रवेश करती है, शरीर में अन्य भंग करने वाले रसायनों को अनुमति देता है। हाथएक धूआं हुड में विलायक ले और पूरी पीपीई पहनें। नोट, डीएमएसओ 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज हो जाता है
  4. राइफैम्पिकिन युक्त हाइड्रा माध्यम को दो बार दोबारा बदलें जब तक कि हाइड्रा रोकना कोशिकाओं को माध्यम में खारिज नहीं किया जाता है, जो आम तौर पर 1 सप्ताह बाद के उपचार से होता है। इस बिंदु पर, एक बार दैनिक माध्यम बदल सकता है उपचार के बाद के दिनों के दौरान, हाइड्रा अपने जाल को पूरी तरह से खो देंगे। एक दूसरे के संपर्क में हाइड्रा होने से बचें, क्योंकि वे एक साथ फ्यूज कर सकते हैं और अजीब तरीके से हाइड्रा ( चित्रा 2 ए ) का परिणाम निकाल सकते हैं ।
    1. संपर्क को रोकने के लिए, एक परिपत्र गति में पकवान घूमने से बचें। इसके बजाय, डिश को ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज दिशाओं में धीरे-धीरे उत्तेजित कर दें जब तक कि हाइड्रा अलग न हो जाए। हाइड्रा को 18 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखकर डिश का निरीक्षण करें और आवश्यकतानुसार समायोजित करें।
      नोट: उस दिन के लिए कि मध्यम दो बार बदल जाता है, मध्यम बदलेंएक बार सुबह और फिर दोपहर / शाम में।
  5. एक बार जाल शुरू करने के लिए शुरू हो जाते हैं, पेट को खिलाते हैं और सप्ताह में 3 से 4 गुना हाइड्रा (अनुभाग 2 और 3 देखें) शुरू करते हैं। कोलेचिइन उपचार के 8- 9 दिन के बारे में, हाइड्रा अपने जाल को वापस करने के लिए शुरू हो जाएगा।
    ध्यान दें: तम्बू बदलते व्यक्तियों के बीच भिन्न होता है कुछ तम्बू वृद्धि के लक्षण दिखाते समय 8 से 9 दिन से अधिक समय लग सकते हैं। जो लोग अपने जाल को और साथ ही अजीब तरह से आकार देने वाले ( चित्रा 2 बी ) जानवरों या जानवरों को बहुत कम खिलाया जाना चाहिए, उन्हें हटाया जाना चाहिए। ये हाइड्रा दूसरे उपचार से बच नहीं पाएंगे। हाइड्रा भी कली हो सकती है। हालांकि, कुछ कलियों में अभी भी मध्यवर्ती कोशिकाएं हो सकती हैं और स्वयं को खाने में सक्षम हो सकती हैं।
    1. किसी भी कलियों को निकालें जो सहायता के बिना खा सकते हैं और माता-पिता के जानवर से अलग कर सकते हैं। इन जानवरों को लाइव आर्टेमिया को जोड़कर पहचानेंपकवान खिलाती है और देखता है कि जानवरों को आर्टेमिया को अपने दम पर पकड़ने और खाने के लिए या नहीं। 1 या 2 हाइड्रा अपने दम पर खा सकते हैं। ये भी खारिज किया जाना चाहिए।
      नोट: तंत्रिका मुक्त हाइड्रा में एक विशिष्ट गुब्बारा जैसा आकारिकी है, और स्पर्शक जो सामान्य (नीमेटोसाइट्स के नुकसान के कारण) की तुलना में कम और पतले हैं और इस प्रकार आसानी से सामान्य दिखने वाले जानवरों ( चित्रा 1 ए, 1 बी ) से अलग हो सकते हैं।
  6. पहला कोलेक्शिन उपचार के तीन सप्ताह बाद, कोल्विकिन उपचार दोहराएं (चरण 1.1 - 1.5)। शेष अवर कोशिकाओं और तंत्रिका कोशिकाओं को खत्म करने के लिए एक दूसरे कोल्विकिन उपचार आवश्यक है।

2. फोर्स-फीडिंग

  1. आर्टेमिया अल्सर को एक संकीर्ण और लंबा कांच के कंटेनर में जोड़ें, जो नीचे तख़्ता है। आर्टेमिया पानी (6.72 एम। NaCl) के साथ कंटेनर भरें एक्सा से बचेंएक उच्च हेच उपज के लिए 1 एल पानी में 1 ग्राम सिस्ट्स का आकार।
    1. कंटेनर के शीर्ष परफफिलम को कवर करें और कंटेनर में पैराफिलम के माध्यम से 10 एमएल सीरियल विंदुक डालें। एक मछलीघर वायु पंप को टयूबिंग संलग्न करके और विंदुक के चारों ओर टयूबिंग को फिट करके वातन प्रदान करें। सुनिश्चित करें कि विंदुक टिप कंटेनर के नीचे पहुंचता है और यह कि कोई भी अल्सर नीचे बसे नहीं है। आर्टेमिया 48 घंटे के बाद उछल आएगा
      नोट: आर्टेमिया को पकड़ने के कई अलग-अलग तरीके हैं जो शायद ही ठीक काम कर सकते हैं।
  2. आर्टेमिया जाल से आर्टेमिया के पानी से आर्टेमिया जाल (मछलीघर की आपूर्ति कंपनियों से उपलब्ध) में तनाव डालें और उन्हें पानी में लगभग 20 ग्राम हाइड्रा माध्यम के साथ एक डिश में डालने से पहले धो लें। आर्टेमिया पानी की लवणता हाइड्रा के लिए बहुत अधिक है, इसलिए आर्टेमिया को इस्तेमाल किए जाने से पहले धोया जाना चाहिए।
  3. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत,आर्टेमिया को हल्के संदंश की एक जोड़ी के साथ हल्के ढंग से फैलाएंगे। हिम्मत को बाहर निकालने के लिए मुश्किल से बचने से बचें, क्योंकि यह संदंश को चिपकाएगा और खिलाना मुश्किल बना देगा। हल्के ढंग से इसे हाइड्रा को खिलाने से पहले आर्टेमिया को निचोड़ने से पाचन प्रक्रिया 14 में मदद मिलेगी। फास्ट फीडिंग की सुविधा के लिए डिश में हाइड्रा के पास ताजा तौर पर मार डाले आर्टेमिया रखें।
    नोट: सभी बाद के चरणों एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत किया जाता है।
  4. पेडुनकल द्वारा हाइड्रा को पकड़ने के लिए एक संदंश का उपयोग करें। हाइड्रा को खिलाने की प्रक्रिया के दौरान पेडनीकल को जारी रखना जारी रखें संदंश की दूसरी जोड़ी का उपयोग करना, हाइड्रा अनुबंध बनाने के लिए शरीर के स्तंभ को चुटकी।
  5. एक साथ संदंश की दूसरी जोड़ी के सुझावों को पकड़े हुए, हाइपोस्टोम (पशु के मौखिक अंत में गुंबददार संरचना) के केंद्र में नलें। कभी-कभी मुंह खोलने का कारण बनता है मैंच मुंह को टैप करके नहीं खुलता, मुंह के मध्य में संदंशों को सम्मिलित करके मुंह को छिद्र करता है और फिर संदंश की युक्तियों पर थोड़ा दबाव जारी करता है। यह पंचर द्वारा मुंह खोलने को तैयार करना चाहिए।
    नोट: हाइड्रा मुंह खोला जाने पर गिर सकता है और गिर सकता है ( चित्रा 2 सी )। यदि ऐसा होता है, तो आर्टेमिया अभी भी हाइड्रा में डाला जा सकता है। अगर ऐसा करना बहुत मुश्किल है, तो अगले हाइड्रा पर जाएं और कुछ समय बाद मूल हाइड्रा पर वापस जाएं और फिर से प्रयास करें। हाइड्रा बाद के मुंह खोलने के दौरान जितना ज्यादा गिरावट नहीं करता।
  6. जल्दी से संदंश के साथ आर्टेमिया उठाएं और उन्हें हाइड्रा के गैस्ट्रिक गुहा में डालें। जितना संभव हो उतना आर्टेमिया डालें जब तक कि गैस्ट्रिक गुहा पूरा न हो और हाइड्रा , दुर्घटना क्षतिग्रस्त बिना आर्टेमिया डाली जा सकेंसहयोगी किसी भी आर्टेमिया को अंदर खींचकर, या मुंह को बंद करने से रोकता है। औसतन, यह 5-6 आर्टेमिया है , हालांकि 12 से अधिक बड़े जानवरों को खिलाया गया है।
    1. यदि मुंह बंद करना शुरू होता है, तो ऊपर वर्णित संदंश के साथ फिर से खुलें; हालांकि, सावधानी बरतनी चाहिए क्योंकि किसी भी आर्टिमीआ को पहले ही पशु के अंदर से बाहर आना शुरू हो सकता है जब मुंह को फिर से खोल दिया जाता है।
    2. अगर पूरे आर्टेमिया के लिए हाइड्रा बहुत छोटा है, तो स्कैल्पल का उपयोग करके आर्टेमिया काट कर और हाइड्रा के छोटे टुकड़ों को खाएं । यदि आर्टिमीया हाइड्रा के अंदर नहीं रहता है, तो आर्टेमिया के खिलाफ संदंश को दबाए जाने के लिए आवश्यक हो सकता है कि जब तक इसका मुंह बंद नहीं हो जाता तब तक इसे हाइड्रा के अंदर रखना चाहिए।
  7. एक गिलास पाश्चर पिपेट के साथ हाइड्रा को तब्दील करें, सावधानीपूर्वक हाइड्रा माध्यम में ताजे 50 μg / mL रफामपिसिन के साथ एक डिश के लिए आकस्मिक बोरिंग से बचें। अगर एक आर्टेमिया को च से निकाल दिया गया थास्थानांतरित करने के दौरान हाइड्रा को रोम, नए डिश में जबकि इसे पुनर्निर्मित करें।
    नोट: हाइड्रा को स्थानांतरित करने के लिए एक गिलास विंदुक का उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह पाया गया है कि प्लास्टिक की तुलना में हाइड्रा ग्लास के लिए कम चिपक जाता है। विंदुक की लंबाई कोई फर्क नहीं पड़ता, लेकिन 5 इंच pipettes का उपयोग करना कुछ हद तक आसान हो सकता है।

3. बर्चिंग

  1. खाने के बाद 8 से 20 घंटे के बीच किसी भी समय अप्रासंगिक सामग्री को निकालने के लिए हाइड्रा को बुर्ज करें।
  2. पी 320 या समान धैर्य वाले सैंडपेड के साथ 30 जी पिपोडिमिक सुई के बिंदु तक रेत नीचे तक टिप फ्लैट है।
    नोट: 27 जी पिप्रोमडिमिक सुई भी काम करेगा, लेकिन उच्च गेज की छोटी टिप बेहतर है।
  3. एक डिस्पोजेबल 1 एमएल प्लास्टिक सिरिंज के लिए सुई संलग्न करें और सिरिंज को हाइड्रा मध्यम में ताजे 50 ग्राम / एमएल रिफाम्पिसिन भरें।
    नोट: एक एकल हाइड्रा को ढकने से 0.05 एमएल से 0.1 एमएल का समाधान होता है। एक 1 एमएल सिरीएनजी बल से नियंत्रित होने के बाद बेहतर होता है और समाधान की मात्रा बाहर आ रही एक बड़ा मात्रा सिरिंज के साथ अधिक कठिन है।
  4. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, ठीक बिंदु संदंश के साथ हाइड्रा के पेडिंगल को पकड़ो और सुई के साथ हाइपोस्टोम के केंद्र पर नल लें। यदि मुंह नहीं खुलता है, तो हाइपोस्टोम में संदंश सम्मिलित करें और भोजन के लिए ऊपर वर्णित मुँह खोलें।
    नोट: सभी बाद के चरणों एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत किया जाता है।
  5. सिरिंज का उपयोग पूरी जानवर को उड़ाने से बचने के लिए बहुत धीरे से करें, गैस्ट्रिक गुहा 50 μg / mL rifampicin समाधान के साथ जब तक सभी मलबे निष्कासित नहीं हो जाती। हाइड्रा के आकार की अनुमति नहीं है, तो सुई जरूरी हाइड्रा में डालने की आवश्यकता नहीं है। सुई मुँह खोलने के करीब आयोजित की जा सकती है और सीधे मुंह की ओर इशारा करती है।
  6. ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, हाइड्रा को ताजे 50 के साथ एक डिश में छिड़क दिया गया81; जी / एमएल राइफैम्पिसिन हाइड्रा माध्यम में

4. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से गुणवत्ता नियंत्रण

नोट: निम्न प्रोटोकॉल प्रोटोकॉल से शेनक, एमए, एट अल द्वारा अनुकूलित किया गया है । 18 , और बोत्गेर, ए 1 9 सभी चरणों को कमरे के तापमान (आरटी) पर किया जाता है जब तक अन्यथा नोट नहीं किया जाता है। एक नाइटर का उपयोग ऊष्मायन चरणों के लिए किया जा सकता है और धुंधला गुणवत्ता में सुधार हो सकता है। हालांकि, यदि हाइड्रा एक-दूसरे के साथ उलझा हो जाते हैं, तो बिना सभी कदम भी किए जा सकते हैं।

  1. अवरुद्ध समाधान तैयार करें: 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% डीएमएसओ 1x फॉस्फेट-बफ़ेड खारा (पीबीएस) में। इस उपाय को 4 डिग्री सेल्सियस तक उपयोग करें (चरण 4.6 और 4.11)। समाधान 1 से 2 दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए सभी समाधान खतरनाक कचरे के रूप में ठीक से एकत्र किए जाने चाहिए।
  2. हाइड्रा में 200 μL 2% urethane में हाइड्रा आराम करो1 मिनट में 1.7 एमएल माइक्रोसेंटप्रूफ्यूज ट्यूबों के लिए एडियम 4 शर्तों में से प्रत्येक के लिए 5 हाइड्रा प्रति ट्यूब का उपयोग करें: तंत्रिका मुक्त, अनुपचारित, कोई प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अनुपचारित, और कोई माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ अनुपचारित
    नोट: 1 मिनट से अधिक न हो यहां का समय महत्वपूर्ण है क्योंकि जानवरों को यूरेथेन में बहुत अधिक समय व्यतीत करने के बाद खराब स्थिति में होगा।
  3. Urethane निकालें और हाइड्रा माध्यम में 15 मिनट के लिए 200 μL 4% पैराफॉर्माल्डहाइड (पीएफए) में हाइड्रा को ठीक करें ।
  4. नमूनों को 1 बार 10 मिनट प्रत्येक के लिए 1x पीबीएस के साथ धो लें।
    नोट: पीबीएस और पीबीएसटीक्स के साथ सभी वाशिंग 500 μL समाधान के साथ किया जाता है।
  5. 15 मिनट के लिए पीबीएस में 500 μL 0.5% ट्राइटन एक्स-100 के साथ प्रसार करें
  6. 0.5% ट्राइटन एक्स-100 निकालें और ब्लॉकिंग समाधान के 500 μL जोड़ें। नमूनों को कम से कम 1 घंटे के लिए ब्लॉक करें
  7. अवरुद्ध समाधान में एंटी-टाइरोसिन-ट्यूबिलिन एंटीबॉडी 1: 200 को पतला।
    नोट: यह एकाग्रता डी थीप्रयोगात्मक रूप से समाप्त अगर नियंत्रण में संकेत बहुत कमजोर पाया जाता है, तो एकाग्रता को बढ़ने की आवश्यकता हो सकती है। यदि निंदनीय बाध्यकारी है, तो एकाग्रता की कमी हो सकती है। एंटीबॉडी के पूर्व-ऊष्मायन भी गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को कम करने में मदद कर सकता है।
  8. नमूनों से अवरुद्ध समाधान निकालें और तंत्रिका मुक्त Hydra , अनुपचारित नियंत्रण, और कोई माध्यमिक के साथ अनुपचारित नियंत्रण के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 μL जोड़ें। बिना प्राथमिक उपचार के नियंत्रण के लिए, एंटीबॉडी के बिना केवल 200 μL अवरुद्ध समाधान जोड़ें।
  9. नमूनों को रात भर (> 12 घंटे) 4 डिग्री सेल्सियस से सेते हैं
    नोट: वैकल्पिक रूप से, 5 से 6 आर आर पर सेते हैं
  10. प्राथमिक एंटीबॉडी को निकालें और बड़े पैमाने पर नमूनों को 1x पीबीएस (पीबीएसटीएस) में 0.3% ट्राइटन एक्स -100 के साथ धो लें।
    नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी को बचाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, क्योंकि इसे कम से कम 2 से 3 बार पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  11. बकरी एंटी-माउस एचपी माध्यमिक एंटीब्यू डालनाओडी 1: 500 ब्लॉकिंग समाधान में। तंत्रिका मुक्त हाइड्रा , अनुपचारित नियंत्रण और बिना प्राथमिक उपचार वाले नियंत्रण के 200 μL जोड़ें। अनुपचारित नियंत्रणों के लिए बिना माध्यमिक, एंटीबॉडी के बिना केवल 200 μL ब्लॉकिंग समाधान जोड़ें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है, जिसके लिए चरण 4.13 - 4.17 की आवश्यकता नहीं है। फ्लोरोसेंट माध्यमिक का उपयोग करना समय बचाता है और आम तौर पर पर्याप्त होता है, लेकिन एचपी द्वितीयक वृद्धि संवेदनशीलता प्रदान करता है। माध्यमिक की एकाग्रता को प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया गया था। अगर नियंत्रण में संकेतों को बहुत कमजोर पाया जाता है, तो एकाग्रता को बढ़ने की आवश्यकता हो सकती है। यदि निंदनीय बाध्यकारी है, तो एकाग्रता की कमी हो सकती है।
  12. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूने सेते हैं
  13. माध्यमिक एंटीबॉडी को निकालें और पीबीएसटीएस के साथ बड़े पैमाने पर नमूनों को धो लें।
  14. 1x पीबीटी तैयार करें: 0.2% गोजातीय सीरम एल्बूमिन (वजन / मात्रा), और 0.05% टिविंश 20 1x पीबीएस में। एस सेते हैं30 मिनट के लिए 1x पीबीटी में अमोन
  15. 1x पीबीटी निकालें और 1: 1000 एनएचएस-फ्लोरोसिसिन और 1: 10,000 एच 2 ओ 2 में 1x पीबीटी में नमूनों को अंधेरे में 15 मिनट से निकालें। इस चरण से, नमूने को अंधेरे में जितना संभव हो उतना अधिक रखें, क्योंकि फ्लोरोसेंट सिग्नल कम हो जाएंगे क्योंकि वे प्रकाश के संपर्क में हैं।
    नोट: राजा, आरएस और न्यूमार्क, पीए 20 द्वारा एक विस्तृत मछली प्रोटोकॉल के बाद एनएचएस-फ्लुरेससेन तैयार किया गया था
  16. पीबीएसटीक्स के साथ 3 बार नमूनों को जल्दी से धो लें, फिर 30 मिनट के लिए 2 बार।
  17. धुलाई जारी रखने के लिए पीबीएसटीसी में नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात छोड़ दें।
  18. 1x पीबीएसटीएक्स के साथ कुछ और धोएं। सेल नाभिक को देखने के लिए, 4 ', 6-डायंडिनो-2-फेनिलंडोल, डाइहाइड्रोक्लोराइड (डीएपीआई) का उपयोग करके डीएनए काउंटरस्टेन्ग के लिए निम्नलिखित वैकल्पिक कदम उठाएं। अन्यथा, नमूने अब इमेजेट किए जा सकते हैं।
  19. 5 एमजी / एमएल डीएपीआई स्टॉक को पीबीएसटीएस में 1: 500 की कामकाजी एकाग्रता में पतला करें और प्रत्येक ट्यूब में 200 μL जोड़ें। Incu30 मिनट के लिए नमूनों को बाएं
    सावधानी: डीएपीआई एक ज्ञात कैसरजन है पूर्ण पीपीई पहनें
  20. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग से पहले डीएपीआई को निकालें और नमूनों को 2-3 बार पीबीएसटीएस के साथ धो लें।

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Representative Results

प्रारंभिक 8 घंटे के कोल्विकिन उपचार के तुरंत बाद, सभी हाइड्रा जीवित रहें। इनमें से कुछ हाइड्रा में केवल तम्बू स्टब शेष होंगे ( चित्रा 3 ए ), जबकि अन्य लोग पूरी तरह से अपने जाल को नष्ट कर देंगे ( चित्रा 3 बी )। निम्नलिखित 1 या 2 दिनों में, जब तक सभी हाइड्रा ने अपने जाल को खो दिया हो, तब तक टेनेक्टिक सिकुड़ते रहेंगे। उपचार के बाद लगभग 1 सप्ताह, हाइड्रा टैंकल रेग्रोथ के लक्षण दिखाएगा, जिसमें टेनेटिक ( चित्रा 3 सी ) की तरह छोटी सी स्टब होती है, इससे पहले कि वे पूरी तरह से अपने टेनेटिक ( चित्रा 3 डी ) को पुनर्जीवित करें। मूल हाइड्रा में , लगभग 50-60% अंततः उपचार के बाद 1-2 सप्ताह के भीतर अपने जाल को पुनर्जन्म करते हैं।

एस के बादEcond उपचार, जानवरों की वसूली पहली इलाज के बाद उस के समान है। इस प्रकार, जानवरों की मूल संख्या के लगभग 10%, जो दोनों उपचारों में चले गए थे, ठीक हो गए और प्रयोग के लिए उपयुक्त आकार ( चित्रा 1 बी ) में बढ़ रहे हैं। ये हाइड्रा में भेड़-बकरियां हैं जो अनुपचारित जानवरों की तुलना में पतले दिखाई देते हैं, ऊतक अधिक पारदर्शी होते हैं, और आसमाटिक दबाव ( चित्रा 1 ए , 1 बी) को राहत देने के लिए उनके मुंह खोलने में असमर्थता के कारण सूजन दिखाई देगा। किसी भी जानवर को जो कुछ नहीं खिलाया जाता है, वह कुछ हफ़्ते तक जीवित रह सकता है, हालांकि, जानवरों के आकार के आकार में कमी आती है और उन्हें खाने के लिए अधिक मुश्किल हो जाती है।

दूसरे उपचार के बाद ठीक होने वाले हाइड्रा को अनिश्चित काल तक बनाए रखा जा सकता है। ये जानवर कली में सक्षम हैं, इस प्रकार जनसंख्या बढ़ रही है और बढ़ रही है इसके अतिरिक्त, जनसंख्या बढ़ सकती हैइन जानवरों को काटने और उन्हें 4 पुनर्जन्म करने की अनुमति

इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री दूसरे कॉल्विकिन उपचार के बाद हाइपोस्टोम में न्यूरॉन्स के नुकसान की पुष्टि करता है। हाइपोस्टोम में घने तंत्रिका जाल को एंटी-टायरोसिन-ट्यूबिलिन एंटीबॉडी 13 , 16 का उपयोग करके देखा जा सकता है और मुंह और स्पष्ट कोशिका निकायों ( चित्रा 4 ए ) से बाहर निकलने वाली अलग फाइबर दिखाती है। ये तंतु नर्व-मुक्त हाइड्रा में अनुपस्थित हैं जो कोल्सीसिन ( चित्रा 4 बी ) के साथ दोहरे उपचार द्वारा निर्मित किया गया है। इसके अलावा, डीएपीआई के साथ सह-धुंधला तंत्रिका-मुक्त हाइड्रा में कोशिका नाभिक की कम संख्या का पता चलता है जिसके कारण उपचारात्मक कोशिका वंश के कोशिकाओं के नुकसान के कारण उपचारात्मक उपचार की तुलना में उपचारात्मक उपचार ( चित्रा4 ए, 4 बी )

आकृति 1
चित्रा 1 तंत्रिका मुक्त और अनुपचारित हाइड्रा की तुलना
(ए) अनुपचारित हाइड्रा (बी) नर्व-फ्री हाइड्रा दूसरे कोलेचिइन उपचार के 22 दिन बाद। सूजन-रहित जानवरों में सूजन वाले शरीर के स्तंभ और पतले स्पर्शक को ध्यान दें। स्केल सलाखों 500 माइक्रोन हैं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 विकृत हाइड्रा के उदाहरण
(ए) दो हाइड्रा (बी) एक अजीब रूप से आकार वाले हाइड्रा (सी) एक हाइड्रा जो उसके मुँह खोलने के बाद ढंका हुआ है। स्केल सलाखों 400 माइक्रोन हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3 हाइड्रा की प्रतिनिधि छविएं पहले 8 घंटे के बाद कोल्चिसिन उपचार
(ए) उपचार के तुरंत बाद ठूंठदार जाल के साथ एक हाइड्रा । (बी) एक हाइड्रा जिसने उपचार के तुरंत बाद पूरी तरह से अपने मेचों को खो दिया है। (सी) एक हाइड्रा जो उपचार के बाद 8 दिनों के अपने मेदों को फिर से शुरू करना शुरू कर रहा है। (डी)उपचार के बाद 13 दिनों के बाद एक हाइड्रा ने अपने जाल को पूरी तरह बदल दिया है। स्केल सलाखों 400 माइक्रोन हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 Hypostome में तंत्रिका कोशिकाओं के नुकसान Immunohistochemistry द्वारा पुष्टि की जा सकती है।
(ए) एक अनुपचारित हाइड्रा का हाइपोस्टोम और (बी) नर्व-फ्री हाइड्रा के हायपोस्टोम को दूसरे कोल्चिसिन उपचार के बाद लगभग 2 सप्ताह, (i) एंटी-टाइरोसिन-ट्यूबिलिन एंटीबॉडी और (ii) डीएपीआई (Iii) ओवरले दिखाता है * मुंह का स्थान इंगित करता है अधिकतम z अनुमानों कताई डिस्क confocal प्रतिदीप्ति जेड ढेर से किए गए ई के साथ लिया500 एमएस (जीएफपी) और 15 एमएस (डीएपीआई) के एक्सपोजर चमक और इसके विपरीत दृश्यता में सुधार के लिए समायोजित किए गए थे। स्केल बार 20 माइक्रोन हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

हाइड्रा अंतःस्राय कोशिकाओं को एक डबल कॉल्विकिन उपचार 3 , 4 के माध्यम से समाप्त किया जा सकता है। पहले उपचार के बाद के दिनों में, हाइड्रा के संलयन से विकृत हाइड्रा में संलयन से बचने के लिए व्यक्तिगत हाइड्रा के बीच संपर्क को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, जानवरों को पहले उपचार के बाद बिना किसी खासतौर से खा सकते हैं, क्योंकि इन्हें दूसरे कोल्विकिन उपचार के रूप में हटाया जाना चाहिए क्योंकि ऐसे जानवरों के शेष मध्य कोशिकाओं को खत्म करने के लिए पर्याप्त नहीं होगा। दूसरे कोलेविसिन उपचार के बाद नर्व-मुक्त हाइड्रा की जीवित रहने की दर को अधिकतम करने के लिए, जानवरों को बहुत से आर्टेमिया के रूप में खिलाया जाना चाहिए, पहले इलाज से निम्नलिखित वसूली के रूप में संभव हो जाना चाहिए, 1 से 2 दिनों के बीच में ठीक होने और बढ़ने के लिए फीडिंग के बीच। प्रत्येक colchicine उपचार हाइड्रा कारण आकार में काफी कम करने के लिए कोशिकाओं के रूप में बड़े हो रहे हैं, तो हाइड्रा बड़ा प्रत्येक उपचार से पहले हैं, बीसंभावना है कि हाइड्रा एक आकार है कि खिलाया जा सकता है और बनाए रखा के लिए ठीक हो जाएगा etter

प्रत्येक उपचार के बाद हाइड्रा की कम बचने की दर के कारण, कई हाइड्रा से शुरू करने के लिए यह वांछनीय हो सकता है। हालांकि, एक बार में कई हाइड्रा पर इलाज शुरू करने के साथ सावधानी बरती जाए। इससे पहले उपचार को मुश्किल और बहुत अधिक समय लेने वाली होनी चाहिए। पहला उपचार बड़े आकारों में पहुंचने के बाद जानवरों को अच्छी तरह से खिलाया जाता है और इसलिए दूसरे उपचार के बाद उच्चतर जीवित रहने की दर है। इस प्रकार, यह कम से शुरू करने और बेहतर भोजन करने पर ध्यान देने के लिए अधिक उत्पादक हो सकता है। आम तौर पर, 1 से 2 लोगों के लिए 50 से 100 जानवरों की शुरुआत होती है। संभवतः सबसे बड़ा हाइड्रा के साथ शुरू करना सबसे अच्छा है, क्योंकि ये दो उपचारों से बेहतर होगा।

यहाँ वर्णित तंत्रिका कोशिकाओं की कमी वाले बल-खिला और बरामद हाइड्रा की विधि सुरक्षित, सरल और अधिक समय है- पिछले 3 , 4 , 14 में वर्णित तरीकों की तुलना में कुशल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संदंश और सीरिंज का इस्तेमाल हाथों की सूक्ष्मदर्शी युक्तियों को खींचने की आवश्यकता को समाप्त करता है, जो समय लेने और बनाना मुश्किल है। इन उपकरणों का उपयोग मुंह-विंदुक की आवश्यकता से बचा जाता है। संदंश का उपयोग करने के लिए फोर्स-फीडिंग सबसे पहले मुश्किल हो सकती है, लेकिन पर्याप्त समय और अभ्यास दिया जाता है, यह बहुत आसान और कुशल हो जाता है सबसे पहले, हाथी के हाथों में हेरफेर करने के लिए उपकरण के साथ कितना ताकत लगाई जानी चाहिए और यह महसूस करने के लिए पहले बल-भोजन और सामान्य हाइड्रा को मारना चाहिए । बल-खिला और बरामद करने के लिए इष्टतम उपकरण खोजने के लिए विभिन्न संदंश और सुई आकार का परीक्षण किया गया।

यहाँ वर्णित के रूप में एंटीबॉडी धुंधला उपयोग का उपयोग हायोस्टोम में तंत्रिका कोशिकाओं की अनुपस्थिति की जांच करने के लिए पर्याप्त है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी मध्यवर्ती कोशिकाओं को समाप्त कर दिया गया है, जानवरों को लुप्त हो सकता है औरउपस्थित कोशिकाओं के प्रकार की जांच 15 हो सकती है

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने सिरिंज और सुई तकनीक को अनुकूल बनाने और सुश्री डेनिएल हागस्ट्रॉम और डॉ। रोब स्टील के लिए मदद के लिए तंत्रिका मुक्त जानवरों को बनाने और बनाए रखने के मूल प्रोटोकॉल के बारे में चर्चा के लिए डॉ। डिक कैंपबेल (यूसी इरविन) का धन्यवाद किया है। (यूसी इरविन) पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए। यह काम आरसीएसए और एनएसएफ अनुदान सीएमएमआई -1447272 द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Colchicine Acros Organics 227120010
1 mL Syringe BD 301025
Brine Shrimp Eggs Brine Shrimp Direct N/A Can be purchased locally
Brine Shrimp Hatchery Dish Brine Shrimp Direct N/A
60 mm x 15 mm Petri Dish Celltreat 229663
30 G x 3/4" Hypodermic Needle Covidien 1188830340 A 27G needle may also be used
2 x Fine-tip Tweezers Dumont 0109-5-PO
Rifampicin EMD Millipore 557303
Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) Enzo ADI-SAB-100-J
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9703-100
Scalpel Fisher 08-920A
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10437028
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
PBS Tablets MP Bio 2810305
Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine Sigma T9028
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Hydrogen Peroxide Sigma 216763
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148
Triton X - 100 Sigma T9284
Tween 20 Sigma P1379
Urethane Sigma U2500
Air Pump Tetra 77846-00
Glass Pasteur Pipette VWR 53283-916 Length of the pipet does not matter
15 mL Tube VWR 89039-670
P320 Sandpaper 3M IBGABBV00397 Can be purchased at local home improvement store

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 125, कोल्विकिसिन खिला तंत्रिका मुक्त मध्यवर्ती कोशिकाएं इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
नर्व-मुक्त के निर्माण और दीर्घकालिक रखरखाव<em&gt; हाइड्रा</em
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Tran, C. M., Fu, S., Rowe, T.,… More

Tran, C. M., Fu, S., Rowe, T., Collins, E. M. S. Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra. J. Vis. Exp. (125), e56115, doi:10.3791/56115 (2017).

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