Summary
Através de um tratamento duplo com colchicina, uma toxina derivada de plantas que mata células separadoras, Hydra vulgaris isenta de nervos pode ser gerada. Essas Hydra não podem alimentar ou criar por conta própria. Este artigo descreve um método melhorado para a manutenção a longo prazo de Hydra vulgaris sem nervos no laboratório.
Abstract
A linhagem celular intersticial de Hydra inclui células estaminais multipotentes e seus derivados: células da glândula, nematócitos, células germinativas e células nervosas. As células intersticiais podem ser eliminadas através de dois tratamentos consecutivos com colchicina, uma toxina derivada de plantas que mata células em divisão, eliminando o potencial de renovação das células diferenciadas derivadas das células estaminais intersticiais. Isso permite a geração de Hydra que carece de células nervosas. Um pólipo livre de nervos não pode abrir a boca para alimentar, por exemplo, ou regular a pressão osmótica. Tais animais, no entanto, podem sobreviver e ser cultivados indefinidamente no laboratório, se regularmente forçados e erguidos. A falta de células nervosas permite estudos sobre o papel do sistema nervoso na regulação do comportamento e regeneração dos animais. Os protocolos previamente publicados para a manutenção da Hydra sem nervos envolvem técnicas desatualizadas, como a pipetagem bucal com micropipetas tIps para alimentar e limpar a Hydra . Aqui, é introduzido um protocolo melhorado para a manutenção da hidra livre de nervos. As pinças de ponta fina são usadas para forçar a abertura da boca e inserir Artemia recentemente matada. Após a alimentação forçada, a cavidade do corpo do animal é lavada com meio fresco usando uma seringa e uma agulha hipodérmica para remover material não digerido, aqui referido como "eructo". Este novo método de alimentação forçada e eructação de hidratação livre de nervos através do uso de fórceps e seringas elimina a necessidade de pipetagem bucal usando pontas de micropipetas extraídas à mão. Isso torna o processo mais seguro e significativamente mais eficiente no tempo. Para garantir que as células nervosas no hipossêtomo tenham sido eliminadas, é realizada a imuno-histoquímica utilizando tirosina-tubulina.
Introduction
O sistema nervoso de Hydra consiste em uma rede nervosa, com neurônios associados a ambas as camadas de tecido epitelial 1 . A rede nervosa é mais densa no hipossênero e pedúnculo e menos densa na coluna 2 do corpo. As células nervosas são originárias de células estaminais intersticiais, que são células-tronco multipotentes que originam células secretoras, nematócitos, células germinativas e neurônios 1 . É possível eliminar as células intersticiais de Hydra vulgaris através do tratamento com colchicina 3 , 4 , uma toxina derivada de plantas que mata células em divisão. Embora a colicicina tenha inibido a polimerização de microtúbulos em outros organismos, um estudo anterior mostrou que os microtúbulos estão presentes na Hydra ao longo de todo o tratamento, sugerindo que a colchicina não age dessa maneira na Hydra 3 . Outra stSugere que a colchicina não se liga de forma eficiente à tubulina em alguns organismos, incluindo Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas e Schizosaccharomyces pombe, o que pode explicar essa diferença 5 . O tratamento com colchicina induz a fagocitose das células intersticiais pelas células epiteliais endodérmicas 3 e, portanto, permite a criação de animais que faltam células nervosas, células da glândula e nematócitos. Não está claro por que as células intersticiais são particularmente suscetíveis ao tratamento com colchicina. Dado que as células intersticiais pós-mitóticas e a linhagem das células estaminais intersticiais são danificadas e fagocitadas, Campbell concluiu que a colicicina não afetou diretamente a atividade mitótica 3 . Notavelmente, o tratamento com colchicina funciona bem em Hydra vulgaris, mas foi demonstrado que não funciona também em outras espécies, como Hydra oligactis 6 . Hydra viridis livre de nervos 7 . A hidra sem nervos (também às vezes referida como " Hydra epitelial" 8 ) é, portanto, uma ferramenta útil para estudar os papéis desses tipos de células especializadas a partir da linhagem celular intersticial na homeostase e regeneração do tecido.
Hydra pode ser o único exemplo conhecido de um animal capaz de viver sem um sistema nervoso. Hydra sem nervos serve como um modelo particularmente útil para dissecar o papel da rede nervosa na regulação da regeneração, homeostase e comportamento da Hydra . Por exemplo, a introdução de células intersticiais na hidra livre de nervos através do enxerto permitiu a caracterização da diferenciação de células nervosas como altamente específico da região 9 . Além disso, uma vez que Hydra livre de nervos pode se regenerar, elesPermitir a investigação de caminhos de regeneração independentes do sistema nervoso. Um desses exemplos é a neurogênese apical e a formação da cabeça, que demonstrou depender da função cnox-2 no sistema nervoso em Hydra de tipo selvagem, mas parece ser dispensável na hidra livre de nervos, sugerindo que pode haver um processo alternativo de regeneração da cabeça 10 .
A hidra sem nervos também tem sido utilizada para estudar a expressão das células epiteliais e a regulação de genes neurogênicos e de neurotransmissão após a perda de neurogênese 11 . A hidra sem nervos não exibe rajadas de contração espontâneas 12 , indicando que essas explosões são reguladas pelo sistema nervoso. Hydra do Nerve-free, no entanto, contrata em resposta a beliscar a coluna do corpo com fórceps, sugerindo que a contração em resposta a estímulos mecânicos é mediada por acoplamento através deJunções gap gh nas células epiteliais, enquanto o comportamento contrátil espontâneo é mediado pelo acoplamento através de junções gap nas células nervosas 13 .
A hidra sem nervos não abre a boca quando é apresentada com alimentos ou glutationa reduzida 3 , sugerindo que os neurônios sensoriais são necessários para detectar a presença de alimentos e sinalizar a boca para abrir. Além disso, a rede nervosa parece desempenhar um papel na detecção da pressão osmótica, porque os animais sem nervos são incapazes de regular de forma autônoma sua pressão hidrostática interna através da abertura da boca, causando a aparência característica do balão 3 , 4 ( Figura 1B ). O regulamento da pressão hidrostática na hidra livre de nervos por deflação manual freqüente levou à perda de alguma morfologia anormal na coluna de hipossetro e corpo. No entanto, a deflação crônica levou à interferência com o crescimento,Organização de articulação, brotação e tecido 8 .
Embora a hidra não livre de nervos seja incapaz de alimentar e, por exemplo, sozinha, é possível mantê-los indefinidamente no laboratório manualmente forçando e erguendo cada animal. Publicações anteriores descreveram métodos de alimentação forçada e eructação de Hydra sem nervos, no entanto, esses protocolos envolveram o uso de dicas de micropipetas que devem ser puxadas manualmente para o tamanho apropriado, bem como o uso de um bocal conectado à pipeta pela tubulação 14 . Aqui, é descrito um método de alimentação e burping mais simples, seguro e com maior tempo.
Além disso, estudos anteriores envolveram verificar a ausência de células nervosas através da dissociação de animais fixos em células individuais e exame de morfologia celular 3 , 4 , 15 . HAntes, foi utilizada a imuno-histoquímica com um anticorpo monoclonal contra o terminal carboxilo tirosinado da alfa-tubulina como método complementar para maceração para verificar a depleção de neurônios no hiposstoma 13,16. Estudos anteriores mostraram que os neurônios no pedúnculo também podem ser visualizados usando este anticorpo 13 , no entanto, esses neurônios, bem como aqueles na coluna do corpo, são mais difíceis de distinguir. Embora a imuno-histoquímica seja suficiente para confirmar a ausência de células nervosas no hiposstoma e não requer experiência em morfologia do tipo celular, não pode ser usado para verificar a ausência das células estaminais intersticiais e os outros derivados dessas células. Os estudos de dissociação e morfologia celular são mais rigorosos e podem fornecer uma contagem quantitativa dos números de cada tipo de célula que permanece após cada etapa do tratamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tratamento duplo de colchicina
- Faça uma solução de 0,4% de colchicina (peso / volume) em Hydra medium 3 , 4 , 17 .
Cuidado: Colchicina é extremamente tóxica, fatal se ingerido, pode causar defeitos genéticos e pode causar danos nos olhos. Pegue o pó em uma chaminé e use equipamentos de proteção pessoal completos (PPE). - Incubar Hydra vulgaris (estirpe AEP aqui utilizada) que foram submetidos à privação durante 24 horas em 0,4% de colchicina na proporção de 5 Hydra por mL de solução de colchicina em uma placa de Petri durante 8 h à temperatura ambiente no escuro.
Nota: 5 Hydra / mL colchicina é uma diretriz para determinar a quantidade de solução a ser utilizada para evitar o superlotação do prato com Hydra . Use o mesmo volume de solução para limitações subsequentes e mudanças na solução. - Remova a solução de colchicina e substituaCom meio de hidra limpo sem colchicina. Lave o Hydra 5 vezes por transferência serial com uma pipeta Pasteur de vidro para limpar o meio de Hydra antes de transferir para 50 μg / mL de rifampicina no meio de Hydra . Mantenha a Hidra em uma incubadora a 18 ° C.
Nota: Pode ser armazenada uma quantidade suficiente de 1000 x rifampicina (50 mg / mL) em sulfóxido de dimetilo (DMSO) durante 1-2 semanas de tratamento a 4 ° C. A quantidade exata pode ser determinada pelo volume total de solução utilizada a cada dia. Por exemplo, se houver 2 pratos, cada um contendo 10 mL de solução que precisa ser alterado duas vezes por dia, um total de 40 mL de solução será usado em um dia, correspondendo a 40 μL de estoque de 1000X por dia ou 560 μL Durante um período de duas semanas. O estoque é então diluído 1: 1000 em meio Hydra após o uso.
Cuidado: O DMSO é um líquido combustível e penetra prontamente na pele, permitindo outros produtos químicos dissolvidos no corpo. MãoDeixe o solvente em uma exaustão e use PPE cheio. De notar, o DMSO congela a 4 ° C - Mude o meio de Hydra contendo rifampicina duas vezes por dia até o Hydra parar de expulsar as células para o meio, o que é geralmente por 1 semana após o tratamento. Neste ponto, o meio pode ser alterado uma vez por dia. Durante os dias que seguem o tratamento, a Hydra perderá completamente seus tentáculos. Evite que o Hydra entre em contato, uma vez que eles podem fundir-se e resultar em Hydra de forma estranha ( Figura 2 A ).
- Para evitar contato, evite rodar o prato em movimento circular. Em vez disso, agite suavemente o prato nas direções vertical e horizontal até o Hydra se espalhar. Inspecione o prato ao colocar a Hidra na incubadora a 18 ° C e ajuste conforme necessário.
Observação: para os dias em que o meio é alterado duas vezes, mude o meioUma vez de manhã e novamente à tarde / à noite.
- Para evitar contato, evite rodar o prato em movimento circular. Em vez disso, agite suavemente o prato nas direções vertical e horizontal até o Hydra se espalhar. Inspecione o prato ao colocar a Hidra na incubadora a 18 ° C e ajuste conforme necessário.
- Uma vez que os tentáculos começam a se formar, comece a forçar e eructar o Hydra 3 a 4 vezes por semana (ver Seções 2 e 3). Cerca de 8-9 dias após o tratamento com colchicina, o Hydra começará a desenvolver seus tentáculos de volta.
Nota: O crescimento do tentáculo varia entre os indivíduos. Alguns podem demorar mais de 8 a 9 dias antes de mostrar sinais de crescimento do tentáculo. Aqueles que não regeneram seus tentáculos, bem como animais estranhos ( Figura 2 B ) ou animais muito pequenos para serem alimentados devem ser removidos. Esses Hydra provavelmente não sobreviverão ao segundo tratamento. A Hydra também pode brotar. No entanto, alguns dos botões podem ainda ter células intersticiais e poder comer por conta própria.- Remova quaisquer botões que possam comer sem assistência e se separar do animal pai. Identifique esses animais adicionando Artemia ao vivo aoAlimentando o prato e observando se os animais pegarão e comerão o Artemia por conta própria. 1 ou 2 Hydra também podem comer por conta própria. Estes também devem ser descartados.
Nota: A hidra sem nervos possui uma característica morfologia semelhante a um balão e tentáculos mais curtos e mais finos do que o normal (devido à perda de nematócitos) e, portanto, podem ser facilmente distinguidos dos animais com aparência normal ( Figura 1 A, 1B ).
- Remova quaisquer botões que possam comer sem assistência e se separar do animal pai. Identifique esses animais adicionando Artemia ao vivo aoAlimentando o prato e observando se os animais pegarão e comerão o Artemia por conta própria. 1 ou 2 Hydra também podem comer por conta própria. Estes também devem ser descartados.
- Três semanas após o primeiro tratamento com colchicina, repita o tratamento com colchicina (passos 1.1 - 1.5). Um segundo tratamento com colchicina é necessário para eliminar as células intersticiais remanescentes e as células nervosas 3 .
2. Força-Alimentação
- Adicione os cistos de Artemia a um recipiente de vidro estreito e alto que se afunde no fundo. Encha o recipiente com água de Artemia (NaCl 6,72 M). Evite exceCom 1 g de cistos por 1 L de água para um maior rendimento da escotilha.
- Cubra a parte superior do recipiente com parafilme e insira uma pipeta sorológica de 10 mL através do parafilme no recipiente. Forneça a aeração conectando tubos a uma bomba de ar do aquário e encaixando a tubulação em torno da pipeta. Certifique-se de que a ponta da pipeta alcance a parte inferior do recipiente e que nenhum cisto esteja instalado na parte inferior. O Artemia irá escotilhar depois das 48 h.
Nota: Existem muitas maneiras diferentes de criar Artemia que pode funcionar tão bem.
- Cubra a parte superior do recipiente com parafilme e insira uma pipeta sorológica de 10 mL através do parafilme no recipiente. Forneça a aeração conectando tubos a uma bomba de ar do aquário e encaixando a tubulação em torno da pipeta. Certifique-se de que a ponta da pipeta alcance a parte inferior do recipiente e que nenhum cisto esteja instalado na parte inferior. O Artemia irá escotilhar depois das 48 h.
- Coloque o Artemia da água Artemia em uma rede Artemia (disponível nas empresas de abastecimento de aquários) e lave-os por cerca de 20 s em água DI antes de colocá-los em um prato com meio Hydra . A salinidade da água de Artemia é muito alta para Hydra , então o Artemia deve ser lavado antes de serem usados.
- Sob um microscópio de dissecação,Euthanize o Artemia apertando-os ligeiramente com um par de pinças finas. Evite espremer com força o suficiente para expulsar as tripas, pois isso irá manter a pinça e dificultar a alimentação. Apertar ligeiramente o Artemia antes de alimentá-lo ao Hydra ajudará no processo de digestão 14 . Coloque o Artemia recentemente morto perto da Hidra no prato para facilitar a alimentação rápida.
Nota: Todas as etapas subseqüentes são feitas sob um microscópio de dissecação. - Use um par de pinças para segurar a Hydra pelo pedúnculo. Continue segurando o pedúnculo durante o processo de alimentação da Hydra . Usando um segundo par de fórceps, pitada a coluna do corpo para fazer o contrato Hydra .
- Enquanto segura as pontas do segundo par de fórceps juntos, toque no centro do hipossetro (a estrutura em forma de abóbada na extremidade oral do animal). Isso, por vezes, faz com que a boca se abra. EuF a boca não abre batendo, perfure a boca, inserindo a pinça no centro do hipossetro e depois solte levemente a pressão nas pontas da pinça. Isso deve esticar a abertura da boca feita pela punção.
Nota: O Hydra pode desinflar e desabar quando a boca é aberta ( Figura 2 C ). Se isso ocorrer, o Artemia ainda pode ser inserido no Hydra . Se é muito difícil fazê-lo, avance para o próximo Hydra e volte ao Hydra original um pouco mais tarde e tente novamente. A Hydra tende a não se esvaziar tanto durante as aberturas de boca subseqüentes. - Pegue rapidamente Artemia com a pinça e insira-os na cavidade gástrica da Hydra . Insira o máximo de Artemia possível até a cavidade gástrica estar cheia e mais Artemia não pode ser inserida sem danificar a Hidra , acidenteAliado retirando qualquer Artemia para dentro, ou impedindo que a boca se feche. Em média, isso é de 5 a 6 Artemia , no entanto, até 12 foram alimentados aos animais maiores.
- Se a boca começar a fechar, estique-se novamente com a pinça conforme descrito acima; No entanto, deve ser tomado cuidado, pois qualquer Artemia já dentro do animal pode começar a sair quando a boca é reaberta.
- Se a Hydra é muito pequena para um Artemia inteiro, corte o Artemia usando um bisturi e alimente as peças menores da Hydra . Se o Artemia não ficar dentro da Hidra , pode ser necessário pressionar a pinça contra o Artemia para mantê-lo dentro da Hidra até sua boca se fechar.
- Transferir a Hydra alimentada com uma pipeta Pasteur de vidro, cuidadosamente para evitar eructos acidentais, em um prato com rifampicina fresca de 50 μg / mL em meio Hydra . Se um Artemia foi expulso fRom a Hydra enquanto se transfere, reinsira-a enquanto estiver no novo prato.
Nota: Uma pipeta de vidro é usada para transferir a Hydra , pois descobriu que a Hydra se encaixou menos no vidro em comparação com o plástico. O comprimento da pipeta não importa, mas usar pipetas de 5 polegadas pode ser um pouco mais fácil.
3. Burping
- Burp Hydra para remover material não digerido a qualquer momento entre 8 e 20 h após a alimentação.
- Areia no ponto de uma agulha hipodérmica 30G com P320 ou papel de lixa de grão semelhante até a ponta ser plana.
Nota: Uma agulha hipodérmica 27G também funcionaria, mas a ponta menor do calibre mais alto é preferível. - Anexe a agulha a uma seringa de plástico descartable de 1 mL e encha a seringa com rifampicina fresca de 50 μg / mL em meio Hydra .
Nota: Burping One Hydra leva cerca de 0,05 mL a 0,1 mL de solução. Um syri de 1 mLNge é preferível, uma vez que o controle da força e do volume da solução que sai é mais difícil com uma seringa de volume maior. - Sob um microscópio de dissecação, segure o pedúnculo da Hidra com fórceps finos e toque no centro do hipossetro com a agulha. Se a boca não abrir, insira fórceps no hiposstoma e abra a boca como descrito acima para alimentação.
Nota: Todas as etapas subseqüentes são feitas sob um microscópio de dissecação. - Use a seringa para nivelar, muito gentilmente, para evitar o afundamento de todo o animal, a cavidade gástrica com a solução de rifampicina a 50 μg / mL até que todos os detritos tenham sido expulso. A agulha não precisa necessariamente ser inserida na Hydra se o tamanho da Hydra não permitir. A agulha pode ser realizada perto da abertura da boca e apontada diretamente para a boca.
- Usando uma pipeta Pasteur de vidro, transfira a Hydra para um prato com 5081; g / mL de rifampicina em meio Hydra .
4. Controle de qualidade via imuno-histoquímica
NOTA: O protocolo a seguir é adaptado de protocolos por Shenk, M. A, et al. 18 , e Böttger, A 19 . Todas as etapas são feitas à temperatura ambiente (RT), a menos que seja indicado de outra forma. Um nutator pode ser usado para as etapas de incubação e pode melhorar a qualidade da coloração. No entanto, se o Hydra se enroscar um com o outro, todas as etapas também podem ser realizadas sem.
- Prepare a solução de bloqueio: 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de DMSO em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). Armazene esta solução a 4 ° C até o uso (passos 4.6 e 4.11). A solução pode ser armazenada por 1 a 2 dias.
Nota: Todas as soluções utilizadas neste protocolo devem ser devidamente coletadas como resíduos perigosos. - Relaxe Hydra em 200 μL de 2% de uretano em Hydra mEdium durante 1 min em tubos de microcentrífuga de 1,7 mL. Use 5 Hydra por tubo para cada uma das 4 condições: livre de nervo, não tratada, não tratada sem anticorpo primário e não tratada sem anticorpo secundário.
Nota: Não exceda 1 min. O momento aqui é crítico, pois os animais estarão em mau estado depois de passarem muito tempo em uretano. - Remova o uretano e repare a Hidra em 200 μL de paraformaldeído a 4% (PFA) no meio Hydra durante 15 min.
- Lave as amostras 3 vezes com 1x PBS por 10 minutos cada.
Nota: Todas as lavagens com PBS e PBSTx são feitas com 500 μL de solução. - Permeabilize com 500 μL de Triton X-100 a 0,5% em PBS durante 15 min.
- Remova o Triton X-100 a 0,5% e adicione 500 μL da solução de bloqueio. Bloqueie as amostras por pelo menos 1 h.
- Diluir o anticorpo anti-tirosina-tubulina 1: 200 em solução de bloqueio.
Nota: Esta concentração foi deTerminou experimentalmente. Se o sinal nos controles for muito fraco, a concentração pode precisar ser aumentada. Se houver ligação não específica, a concentração pode precisar ser diminuída. A pré-incubação do anticorpo também pode ajudar a reduzir a ligação não específica. - Remova a solução de bloqueio das amostras e adicione 200 μL do anticorpo primário à Hydra sem nervos, controles não tratados e controles não tratados com nenhum secundário. Para os controles não tratados com nenhum primário, apenas adicione 200 μL de solução de bloqueio sem o anticorpo.
- Incubar as amostras durante a noite (> 12 h) a 4 ° C.
Nota: Alternativamente, incubar 5 a 6 h à TA. - Remova o anticorpo primário e lave as amostras extensivamente com 0,3% de Triton X-100 em 1x PBS (PBSTx).
Nota: Salve o anticorpo primário e armazene a 4 ° C, pois pode ser reutilizado pelo menos 2 a 3 vezes. - Diluir antibiótico secundário de cabra anti-mouse hPOdy 1: 500 em solução de bloqueio. Adicione 200 μL à Hydra sem nervos, controles não tratados e controles não tratados com nenhum primário. Para os controles não tratados com nenhum secundário, apenas adicione 200 μL de solução de bloqueio sem o anticorpo.
Nota: Alternativamente, um anticorpo secundário fluorescente pode ser usado, para o qual as etapas 4.13 - 4.17 não são necessárias. O uso de um secundário fluorescente economiza tempo e geralmente é adequado, mas o secundário hP fornece sensibilidade aumentada. A concentração do secundário foi determinada experimentalmente. Se os sinais nos controles forem muito fracos, a concentração pode precisar ser aumentada. Se houver ligação não específica, a concentração pode precisar ser diminuída. - Incubar as amostras durante a noite a 4 ° C.
- Remova o anticorpo secundário e lave as amostras amplamente com PBSTx.
- Prepare 1x PBT: 0,2% de albumina de soro bovino (peso / volume) e Tween20 a 0,05% em 1x PBS. Incube o sAmples em 1x PBT por 30 min.
- Remova o 1x PBT e incuba as amostras em 1: 1000 NHS-fluoresceína e 1: 10 000 H 2 O 2 em 1x PBT durante 15 min no escuro. A partir desta etapa, mantenha as amostras no escuro, tanto quanto possível, à medida que o sinal fluorescente diminuirá quando estiverem expostos à luz.
Nota: NHS-fluoresceína foi preparada seguindo um protocolo FISH detalhado por King, RS e Newmark, PA 20 - Lave as amostras 3 vezes com PBSTx rapidamente, então 2 vezes por 30 min.
- Deixe as amostras em PBSTx durante a noite a 4 ° C para continuar lavando.
- Faça mais algumas lavagens com 1x PBSTx. Para visualizar núcleos celulares, execute as seguintes etapas opcionais para contra-coloração de DNA usando dicloridrato de 4 ', 6-diamindino-2-fenilindol, (DAPI). Caso contrário, as amostras podem ser visualizadas agora.
- Diluir 5 mg / mL de DAPI para uma concentração de trabalho de 1: 500 em PBSTx e adicionar 200 μL a cada tubo. IncuBate as amostras por 30 min.
Cuidado: DAPI é um carcinógeno conhecido. Use PPE completo. - Remova o DAPI e lave as amostras 2 a 3 vezes com PBSTx antes da imagem com microscopia de fluorescência.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Imediatamente após o tratamento inicial de 8 h de colchicina, todos os Hydra sobrevivem. Algumas dessas Hydra terão apenas os talões do tentáculo restantes ( Figura 3 A ), enquanto outros terão perdido completamente seus tentáculos ( Figura 3 B ). Durante os seguintes 1 ou 2 dias, os tentáculos continuarão a diminuir até que todas as Hydra tenham perdido seus tentáculos. Cerca de 1 semana após o tratamento, a Hydra apresentará sinais de rebrota do tentáculo, com pequenos talões como tentáculos ( Figura 3 C ) antes de regenerar completamente seus tentáculos ( Figura 3 D ). Do Hydra original, cerca de 50-60% eventualmente regeneram seus tentáculos entre 1-2 semanas após o tratamento.
Seguindo o sO tratamento econômico, a recuperação dos animais é semelhante à que ocorreu após o primeiro tratamento. Assim, cerca de 10% do número original de animais que entraram em ambos os tratamentos se recuperam e crescem até um tamanho adequado para experimentação ( Figura 1 B ). Esses Hydra têm tentáculos que aparecem mais finos do que os de animais não tratados, têm um tecido que é mais transparente e aparecerá inchado devido à incapacidade de abrir a boca para aliviar a pressão osmótica ( Figura 1 A , 1B). Todos os animais que não são alimentados podem sobreviver por algumas semanas, no entanto, os animais desgastados vão diminuir de tamanho e tornar-se cada vez mais difíceis de alimentar.
A hidra que se recupera após o segundo tratamento pode ser mantida indefinidamente. Esses animais são capazes de brotar, sustentando e aumentando a população. Além disso, a população pode ser cultivadaCortando esses animais e permitindo que eles se regenerem 4 .
A imuno-histoquímica confirma a perda de neurônios no hipossênome após o segundo tratamento com colchicina. A rede de nervos densos no hiposstoma pode ser visualizada usando um anticorpo anti-tirosina-tubulina 13 , 16 e mostra fibras distintas irradiando para fora da boca e órgãos celulares óbvios ( Figura 4 A ). Essas fibras estão ausentes em Hydra sem nervos que foram produzidas por duplo tratamento com colchicina ( Figura 4 B ). Além disso, a co-coloração com DAPI revela um número reduzido de núcleos celulares na hidra sem nervos em comparação com os controles não tratados devido à perda de células da linhagem celular intersticial como resultado dos tratamentos com colchicina ( Figura4 A, 4B ).
Figura 1 . Comparação de Hydra sem nitrogênio e sem tratamento.
(A) Hydra não tratada. (B) Hydra sem nervos 22 dias após o segundo tratamento com colchicina. Observe a coluna do corpo inchado e os tentáculos finos no animal livre de nervos. As barras de escala são de 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2 . Exemplos de Hydra Deformada.
(A) Dois Hydra (B) Uma Hidra estranhamente moldada. (C) Uma Hidra que desinfetou depois de ter sua boca aberta. As barras de escala são 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 3 . Imagens representativas da hidra após o primeiro tratamento de colchicina de 8 h.
(A) A Hydra com tentáculos fofa imediatamente após o tratamento. (B) Uma hidra que perdeu completamente seus tentáculos imediatamente após o tratamento. (C) A Hydra que está começando a regenerar seus tentáculos 8 dias após o tratamento. (D)A Hydra que recuou completamente seus tentáculos 13 dias após o tratamento. As barras de escala são 400 μm. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 4 . A perda de células nervosas no Hypostome pode ser confirmada pela imuno-histoquímica.
(A) O hipossêtomo de um hipossomo de Hidra e (B) não tratado de uma Hydra sem nervos aproximadamente 2 semanas após o segundo tratamento com colchicina, marcado com (i) anticorpo anti-tirosina-tubulina e (ii) DAPI. (Iii) mostra a sobreposição. O * indica a localização da boca. As projeções z máximas foram feitas a partir de pilhas de fluorescência confocal de disco giratório tomadas com eXposures de 500 ms (GFP) e 15 ms (DAPI). O brilho eo contraste foram ajustados para melhorar a visibilidade. As barras de escala são 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
As células intersticiais da Hydra podem ser eliminadas através de um tratamento com colchicina dupla 3 , 4 . Nos dias que se seguem ao primeiro tratamento, é fundamental evitar o contato entre Hydra individual para evitar a fusão de peças Hydra em Hydra deformada. Além disso, os animais que podem comer sem assistência após o primeiro tratamento devem ser removidos, pois o segundo tratamento com colchicina pode não ser suficiente para eliminar as células intersticiais remanescentes desses animais. Para maximizar a taxa de sobrevivência de Hydra sem nervos após o segundo tratamento com colchicina, os animais devem ser alimentados com a maior quantidade possível de Artemia após a recuperação do primeiro tratamento, com 1 a 2 dias entre as mamadas para se recuperar e crescer. Cada tratamento com colchicina faz com que a Hidra diminua significativamente de tamanho à medida que as células são absorvidas, de modo que, quanto maior a hidra são anteriores a cada tratamento, a BAs chances de que a Hydra se recuperem em um tamanho que possa ser alimentado e mantido.
Devido à baixa taxa de sobrevivência de Hydra após cada tratamento, pode ser desejável começar com muitas Hydra . No entanto, deve-se ter cuidado com o tratamento inicial em muitas hidra ao mesmo tempo. Isso tornará a alimentação após o primeiro tratamento difícil e extremamente demorada. Os animais alimentados bem após o primeiro tratamento se recuperam em tamanhos maiores e, portanto, têm uma maior taxa de sobrevivência após o segundo tratamento. Assim, pode ser mais produtivo começar com menos e se concentrar em alimentar melhor. Geralmente, começando com 50 a 100 animais é gerenciável para 1 a 2 pessoas. Também é melhor começar com a maior Hydra possível, pois estes sobreviverão melhor aos dois tratamentos.
O método de alimentação forçada e eructa que Hydra está faltando células nervosas descritas aqui é mais seguro, mais simples e mais tempo- eficiente do que os métodos descritos nos últimos 3 , 4 , 14 . O uso de fórceps e seringas comercialmente disponíveis elimina a necessidade de dicas de micropipetas tiradas à mão, que são demoradas e difíceis de fazer. O uso dessas ferramentas também evita a necessidade de pipeta de boca. Forçar a alimentação usando fórceps pode ser difícil no início, mas com tempo e prática suficientes, torna-se bastante fácil e eficiente. Primeiro, deve-se praticar a alimentação forçada e a burra Hydra normal para ter uma idéia da quantidade de força a ser usada com as ferramentas e como manipular Hydra . Foram testadas várias pinças e tamanhos de agulhas para encontrar as ferramentas ideais para alimentação forçada e eructamento.
O uso de coloração de anticorpos como descrito aqui é apenas adequado para verificar a ausência de células nervosas no hipossêtomo. Para garantir que todas as células intersticiais tenham sido eliminadas, os animais podem ser macerados eOs tipos de células presentes podem ser examinados 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecem ao Dr. Dick Campbell (UC Irvine) por discussões sobre o protocolo original para gerar e manter animais sem nervos, a Sra. Rui Wang para ajudar a adaptar a seringa e a técnica da agulha, e a Sra. Danielle Hagstrom e o Dr. Rob Steele (UC Irvine) para comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela concessão RCSA e NSF CMMI-1463572.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
