Summary
伊蚊蚊感染了沃尔巴克的蚊子被释放到自然种群中, 以抑制媒的传播。我们描述了将Ae. 蚊与沃尔巴克感染在实验室中进行实验和现场发布的方法, 并采取预防措施以尽量减少实验室的适应和选择。
Abstract
伊蚊蚊实验感染了沃尔巴克的蚊子被用于控制媒的传播, 如登革热、基孔肯亚和 Zika。沃尔巴克-受感染的蚊子可以被释放到田间, 通过不相容的交配减少人口的大小, 或者通过不耐病毒传播的蚊子来改变种群。为了使这些策略成功, 从实验室释放到野外的蚊子必须与本土蚊子竞争。然而, 在实验室中维持蚊子会导致近亲繁殖、遗传漂移和实验室适应, 从而减少他们在野外的体能, 并可能混淆实验结果。为了测试不同的沃尔巴克感染在该领域中的适用性, 有必要在多个世代的受控实验室环境中维护蚊子。我们描述了在实验室中维护Ae. 蚊蚊子的简单协议, 它适用于沃尔巴克感染和野生类型的蚊子。这些方法最大限度地减少实验室适应和实施交, 以提高实验对野外蚊子的相关性。此外, 殖民地是保持在最佳条件下, 以最大限度地提高他们的适用性开放的野外发布。
Introduction
伊蚊蚊蚊子负责传播世界上一些最重要的媒, 包括登革热、Zika 和基孔肯亚1。这些病毒正日益成为全球健康的威胁, 因为在热带地区的Ae. 蚊的广泛分布继续扩展2、34。雌性Ae. 蚊优先于人血的5 , 因此倾向于与人类紧密地生活在一起, 特别是在人口最稠密的城市地区。通过与人类的密切联系, 他们也适应在人工生境中繁殖, 包括轮胎、花盆、水槽和水箱6,7。Ae. 蚊还可以很容易地适应实验室环境, 在从字段直接收集后, 它们无需任何特殊要求即可进行维护, 这与伊蚊属属8中的其他物种不同, 9,10。他们的易于维护已经看到他们广泛的研究在实验室中的广泛领域, 最终旨在控制蚊子可能传播的疾病。
传统上, arboviral 控制在很大程度上依赖于杀虫剂的使用来减少蚊子的数量。然而, 越来越多的兴趣的方法, 在实验室饲养的改良蚊子, 然后释放到自然的人口。释放蚊子可以修改基因11,12,13, 生物14,15, 通过辐照16, 化学处理17,18,或者使用组合技术19来抑制蚊子的数量, 或者用不耐 arboviral 传输的蚊子来替代它们, 如20。
沃尔巴克是当前用作媒的生物控制代理的细菌,.最近在Ae. 蚊中引入了几株沃尔巴克, 实验使用胚胎微注射21,22,23,24。这些菌株降低了媒在蚊子中传播和复制的能力, 减少了它们的传输电位23,25,26,27,28.沃尔巴克感染由母亲传给后代 , 但某些菌株在感染的男性与未感染的女配时会导致不孕 ,22。因此,沃尔巴克-受感染的雄性可以大量释放, 以抑制自然蚊子的数量, 最近在其他的伊蚊属物种1529中演示了这一点。但是, 由于沃尔巴克还会在Ae. 蚊中抑制 arboviral 传输, 因此蚊子也可以被释放, 以更差的向量替换本地种群。使用沃尔巴克进行实验感染的Ae. 蚊现在正被释放到多个国家的字段中, 这些应用后一种方法是14,3031。
基于沃尔巴克的 arboviral 控制方法依赖于对沃尔巴克、蚊子和环境之间的交互的正确理解。沃尔巴克在广泛的昆虫中自然发生, 而引入蚊子的菌株在它们的效果中是多种多样的32。由于新的沃尔巴克感染类型被引入到Ae. 蚊24中, 因此有必要在各种情况下对其对蚊子的适应性、繁殖和 arboviral 干扰的影响进行描述。因此, 需要在实验室进行严格的试验, 以评估沃尔巴克菌株在该领域取得成功的可能性。
使用沃尔巴克感染的Ae. 蚊的开放字段版本通常需要每发布区域数千到数万蚊子, 每个星期都要饲养14,3031。初始释放的成功可以通过释放蚊子的大尺寸, 以最大限度地提高其繁殖力33和交配成功3435。蚊子也应该适应他们将在野外经历的条件, 但是长期的实验室饲养可能会导致行为和生理学的变化, 这可能会影响到现场性能36,37, 38。
我们描述了一个简单的协议, 在实验室中使用基本设备来饲养Ae. 蚊。该协议适用于野生型和沃尔巴克感染的蚊子, 后者可能需要特别注意, 因为有些沃尔巴克菌株对蚊子的生命有实质性影响-历史特征39,40. 饲养条件避免过度拥挤和争夺食物以生产出一致大小的蚊子, 这对媒介能力和体能实验都是至关重要的, 并确保蚊子在野外释放时是健康的41.我们还采取预防措施, 以减少选择压力和确保下一代从一个大的, 随机池取样, 以减少实验室适应和近亲繁殖。然而, 实验室环境与野外条件明显不同, 在放松条件下的长期维护可能会使蚊子在释放时的适应度降低到37,42,43.因此, 我们周期性地将雌性从实验室线交叉到野外收集的雄性, 从而在基因上类似于实验比较的菌落, 并适应目标领域的人口39。这些方法不需要任何专门的设备, 可以扩展到每星期为现场发布的数万人的后方。该议定书还优先考虑蚊子在几代人之内和不同的适宜性, 这是在自然种群中建立的昆虫的重要考量。该协议适用于大多数需要维护Ae. 蚊的实验室, 特别是在实验比较中, 蚊子和 relatability 的质量是很重要的。
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Protocol
由墨尔本大学人类伦理委员会 (批准 #: 0723847) 批准对人体的蚊子进行血液喂养。所有志愿者都提供了书面同意。
1. 幼体饲养
注: 蚊子被关押在26±0.5 ° c 和50-70% 相对湿度, 与 12:12 h (光照: 暗) 光周期为这个殖民地维护协议。这些条件与澳大利亚凯恩斯的平均气候条件相似, 在Ae. 蚊生存和发展的最佳热范围内,44,45,46。高温可能导致来自蚊子菌落的沃尔巴克感染的丢失, 应避免47。我们每个人口至少保持500人, 以尽量减少近亲繁殖;维护更小的大小的殖民地可能有健身后果 [罗斯et al.未发布]。在这些条件下, 假设足够的营养, 平均生成时间为28天 (参见表 1)。
- 将卵浸入基质中的托盘 (图 1A) 中, 包含3升水 (反渗透水或老化自来水, 通过在使用前24小时将自来水放入托盘中而产生), 〜300毫克的鱼食品 (一粒压碎的药片, 请参见材料表) 和少量的活性干酵母颗粒可诱发孵化48。
- 在孵化后的一天, 使用玻璃吸管将大约500幼虫转移到含有4升水的托盘 (图 1B), 使用一个遥控器计数器计数。在每个托盘上加两片碎鱼食品。如果需要, 使用不同大小的容器饲养幼虫 (图 1A), 但保持幼虫密度低于0.5 幼虫/毫升, 以避免过度拥挤。
- 每天检查托盘, 确保幼虫有足够的食物;每两天将大约两片食物放到托盘上。提供食物ad 随意但确保在这段时间内有0.5 毫克/幼虫/日可供开发, 以确保同步和身体尺寸一致, 否则实验结果可能会被混淆 (见代表性结果)。
- 注意避免幼虫的过度, 特别是在较小的饲养容器中, 水的表面积和体积较少。如果水看起来混浊或者有明显的幼虫死亡, 用淡水代替它;如果以最佳方式喂养幼虫, 死亡率应可忽略不计。
2. 成人诞生
注意: 幼虫在孵化后五天内将开始蛹, 如果喂养良好, 多数应在孵化后七天蛹。成人将开始出现大约二天在蛹以后, 如果保持优选地在26° c (参见代表性结果)。幼虫发育通常不受沃尔巴克感染的影响, 当充足的食物提供23,39,49。
- 孵化七天后, 将托盘的全部内容通过细网格 (孔径 0.4 mm) 浇注。将过滤后的幼体水保留在 ovicups (参见 "血液喂养和产卵" 部分)。倒置的网格和蘸入一个塑料容器与200毫升的水转移蛹。如果有幼虫存在, 提供额外的食物。
- 准备成人出现的笼子 (图 1C), 提供两杯10% 蔗糖溶液 (图 1F) 和两杯潮湿的棉绒以防止干燥 (图 1E)。
- 如果蛹不需要按性别分类, 将蛹的盖容器放入笼中, 并将盖子略微开半掩, 使成虫进入笼中。或者, 在容器上放置一个倒漏斗, 以尽量减少溺水。确保所有的成年人在从笼子里取出容器之前就已经出现, 以防止对慢速开发人员的选择。
3. 交的蛹性别鉴定
- 如果蛹确实需要按性别 (例如, 用于交), 将蛹从幼虫盘中移除, 并将性别 (图 2) 分离成塑料容器 (图 1A), 每24小时200毫升水, 直到每个性别的所需数量已经达到。把盖子放在容器上, 让它们闭上。
- 成人将出现在容器中;在释放到笼子之前确认他们的性别 (图 2C)。在成年前24小时内性不正确的器, 以达到性成熟。一旦性别得到确认, 每24小时将成年人释放到笼子里。
-
要获得与自然种群相似的遗传背景的沃尔巴克-受感染的菌落, outcross 通过在实验室菌落中添加沃尔巴克-受感染的雌性从产卵收集的卵子中提取的未感染雄性的笼子字段39, 保持每个填充的500个人的规定密度。
- 重复交至少三个世代, 以产生至少87.5% 个与田间人口的相似的菌落39。关键: 确保在这个阶段的性别是正确的 (见步骤 3.1)。
- 雌性Ae. 蚊通常是在交配后的几个小时内进行人工授精的50。当交殖民地时, 允许雌性和雄性在各自的笼子里成熟两天, 然后将雌性吸进雄性笼子, 为所有男性提供均等的机会。
4. 供血和产卵
-
等待至少三天后, 最后一个女性出现之前, 血液喂养, 让充裕的时间成熟。血液喂养女性在两周内出现, 以防止过度死亡, 特别是对蚊子与沃尔巴克感染的负面影响长寿22,24,49。在喂养前的前一天去掉糖杯, 以提高喂养率。
- 请志愿者把前臂插入笼子, 让雌性蚊子喂食。大多数雌性应在5分钟内喂养饱食, 但为了减少对慢喂食者的选择, 将前臂留在笼中15分钟, 或直到所有雌性都明显肿胀;保护手不受叮咬的乳胶手套是可选的, 但推荐使用。
- 在血液喂养两天后, 放置两个装有幼体养育水的塑料杯, 并衬一条砂纸 (图 1G) (或滤纸 (图 1H)) 进入笼子, 雌性产卵。部分淹没在水中的砂纸条, 以保持其湿润。除去其他水源, 防止雌鸟在产卵杯外产卵。
注: 自来水可在杯中使用, 但幼体饲养的水可鼓励产卵51,52 , 雌鸟会更同步地产卵。
5. 蛋的收集和调理
- 雌鸟会在水线上方的砂纸上产卵;每天收集和更换的砂纸条, 直到没有更多的鸡蛋奠定。注意产卵可能持续长达一周。
- 部分干燥的砂纸条, 轻轻地涂抹在纸巾上, 三十年代, 注意不要把鸡蛋。然后, 用一张干纸巾把小条裹好, 放到一个密封的塑料袋里 (图 1I)。
- 在解剖显微镜下检查卵的状况 (图 3)。如果砂纸条太湿, 鸡蛋可能孵化之前被淹没在水中 (图 3B), 但如果干燥太严厉, 鸡蛋可能会崩溃 (图 3C)。
- 卵可以在三天 post-collection 的任何时间孵化;孵化所有的鸡蛋从每个殖民地, 收集了所有的日子, 在同一容器的水, 以确保下一代是抽样从一个大的, 随机的个人池。
- 为了长期贮存, 在20° c 左右的高度 (> 80%) 湿度保持在密封容器中的鸡蛋。在这些条件下, 没有沃尔巴克的鸡蛋可以保存几个月, 同时保持高孵化率53,54。
- 由于某些沃尔巴克感染会大大降低与年龄相关的卵子的生存能力4955, 在收集一周内将卵从沃尔巴克感染的行中孵化出来, 以防止有关株.一周后, 如果需要更多的卵子, 血液就会再次喂养雌性。
| 天 | 步 | ||
| 0 | 孵化蛋 | ||
| 1 | 将幼虫计数成托盘 | ||
| 7 | 将幼虫和蛹转移到菌落笼 | ||
| 17 | 血液喂养女性成人 | ||
| 21 | 开始收集鸡蛋 | ||
| 25 | 完成收集鸡蛋 | ||
| 28 | 孵化蛋 | ||
表 1: Ae. 蚊殖民地维护计划的概述在26° c.雌性供血和卵孵化的时机是灵活的, 但应避免这些阶段的长时间, 特别是对感染了沃尔巴克的蚊子, 以减少死亡率。按照这一计划, 在所有生命阶段, 只要幼虫得到最佳喂养, 就可以最大限度地减少对蚊子的选择。
图 1: 实验室中用于饲养Ae. 蚊的设备.(A) 用于孵化卵或饲养幼虫的塑料容器, 体积为500、750和5000毫升 (从左至右)。(B) 用于在受控密度下饲养幼虫的托盘, 通常为4升水中的500只幼虫。(C) 19.7 l 和 (D) 3 l 笼用于住房成人。应保持25成人或少于每公升的密度, 以提供足够的空间。(E) 35 毫升杯, 用湿棉绒作为水的来源, 供成年人使用。(F) 35 毫升杯, 蔗糖溶液通过脐带或牙科灯芯作为糖的来源提供。(G-H)盛满幼虫的水杯, 用砂纸或滤纸 (分别为G和H) 的产卵衬底。(I) 用于存储砂纸条或滤纸的拉链锁袋。砂纸上的黑点是蚊子的卵。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 外侧 (a) 和背部 (B) 的蛹和成虫的意见Ae. 蚊(C) 展示其性异形.男性被安置在左边和女性在右边在每个小组。当最佳喂养时, 雄性和雌性蛹按大小区分;雌性比雄性大 (A), 相对于有平坦两侧 (B) 的雄性, 雌虫的头比较高。在所有的饲养条件下, 雄性成虫很容易与雌性区别开来, 主要由其羽触角和长触须。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。四天旧Ae. 蚊鸡蛋在不同的条件下。(一个) 在砂纸条上保持完好的卵在高 (> 80%) 湿度, 但没有任何可见的湿气。如果正确维护了野生类型的Ae. 蚊, 则孵化率应高于90%。(B) 在被水淹没之前孵化的卵 (早熟孵化) 由分离的蛋帽和可见的幼虫区分。这表明砂纸条被保持太潮湿。(C) 干燥得太厉害的鸡蛋可能会倒塌, 而且它们的凹形外观明显可见。如果砂纸变得僵硬, 这也表明, 鸡蛋可能太干燥。请单击此处查看此图的较大版本.
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Representative Results
图 4演示了次优营养对Ae. 蚊幼虫发育的影响。当容器提供每只幼虫每天或少于0.25 毫克的食物时, 雄性和雌性的发育时间就会增加, 而且与0.5 毫克食物的容器相比, 它的同步性更低。如果在幼体发育的整个过程中没有提供足够的食物, 这可能会对维护计划产生不利影响。缓慢发展的个体有被选择的危险, 血液喂养可能被延迟, 并且有更高的风险成人死亡在再生产之前发生。
图 5显示了Ae. 蚊的机翼长度 (身体大小的估计). 成人在各种营养制度下饲养。当营养是次优时, 男性和女性的翼长度极大地减少并且变得更加易变。均匀的身体大小是重要的实验比较, 因为身体尺寸是积极与繁殖力, 和大蚊子预计将表现出更大的适用性在野外条件下33,34,35.
其他研究中描述了沃尔巴克感染对上述特性的影响, 但通常几乎没有影响23、39、49。
图 4: Ae. 蚊的累计比例 (A) 雌性和 (B) 在26° c 的不同食品制度下发展到成年的雄性。100 幼虫被饲养在500毫升水的容器中 (每毫升的幼虫密度为0.2 幼体), 提供不同水平的食物 (见材料表)并为它们的发育时间得分。只有存活到成年的幼虫被包括在内。误差线是标准误差, 每个处理的 n = 4 复制。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: Ae. 蚊的机翼长度 (A) 女性和 (B) 在不同的食物制度下发展的男性在26° c。100 幼虫在500毫升水的容器中饲养 (每毫升0.2 幼虫的幼虫密度), 并提供不同水平的食物。然后, 使用前面描述的方法56, 对成人的子集进行了测量。误差线是标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
按照此处提供的用于维护沃尔巴克感染的Ae. 蚊的协议, 应确保为实验和公开的现场发布提供一致质量的健康蚊子。与其他优先生产蚊子数量的协议相比 (参见参考57), 这些方法的重点是通过实施宽松的饲养条件, 在几代人内最大限度地提高他们的身体素质, 并跨越世代通过减少近亲繁殖, 选择和实验室适应。此协议也专门为ae. 蚊和沃尔巴克感染而设计, 但应适用于任何类型的ae. 蚊。然而, 它不适合饲养大量数量 (按每周数以百万计), 这可能是必要的无菌或不相容的昆虫释放需要高数字达到人口抑制57,58。
有一些关键的步骤应该小心地遵循。重要的是要喂养的幼虫最好, 并避免过度拥挤的持续时间, 其发展。这将确保蚊子的发展同步和一致的大小。在调节卵时也要特别注意;幼虫可以很容易孵化太快或卵可以枯萎, 如果产卵基质是太湿或干燥, 分别。在协议的所有步骤中, 我们建议允许尽可能多的人在蚁群中完成每个阶段的时间。对发育缓慢、成熟、血液喂养、排卵或孵化的个体的选择可能导致遗传变异的丧失。
我们注意到在维护沃尔巴克病毒感染的蚊子方面的一些进一步的考虑, 这在上面的协议中没有描述。沃尔巴克感染可能会从实验室的菌落中丢失, 因此我们建议定期监测菌落的沃尔巴克感染状态。我们使用定量聚合酶链反应 (qPCR)49,59每一代从每个沃尔巴克感染的行中测试至少30个人。如果任何个人对相应的沃尔巴克感染进行了阴性测试, 则可以通过将尽可能多的雌性隔离到受感染的蚁群中, 然后使用受感染者母亲的后代, 来纯化菌落, 以发现下一代。从实验室菌落中丢失的一些沃尔巴克菌株的原因在很大程度上是未知的, 但由于高温会导致沃尔巴克感染47的丢失, 因此可以解释为温度控制的失败. 60。
如果在饲养时没有注意到, 菌落和实验也可能会受到来自不同线的个体的污染。污染可能是由于不小心移的幼虫, 混合了批次的鸡蛋, 标签笼或不正确的交配蛹在十字架。因此, 在处理具有不同沃尔巴克感染类型的菌落时应特别注意。彻底清洁任何产卵杯, 饲养托盘和笼子, 然后再利用它们, 清理管之前处理每一个新的幼虫托盘和清洁网格每次转移幼虫和蛹到其他容器。此外, 检查手指的鸡蛋时, 处理砂纸带和使用新鲜的纸巾时, 干燥每一个地带, 确保成年人是正确的性行为, 然后才释放到笼子, 并处理任何逃犯迅速。采取这些预防措施应避免大多数污染, 但仍应使用诊断化验方法对蜂群进行常规监测59。
女性Ae. 蚊需要一顿血来产卵, 而世界各地的实验室提供各种方式, 从膜喂养系统57、受限制的动物61和, 在较小程度上, 人工血液62.然而, 与实验性的沃尔巴克感染的蚊子往往表现不佳的非人类血液, 并可能表现出减少的繁殖力和孵化率, 以及不完整的传输沃尔巴克到他们的后代63,64,65. 保持女性对人类气味的接受也很重要, 蚊子被释放到野外, 通过细胞膜或其他动物喂养它们可能会危及这种能力37。因此, 我们选择使用人类志愿者的前臂来进行这个群体维护协议, 尽管在某些情况下还需要其他方法。在直接与媒工作时, 应通过其他方式提供血液, 当菌落来自具有高病毒负荷的田间人群时, 应注意 transovarial 的媒可能发生66。如果人类志愿者最近访问过 arboviral 流行的国家, 可能会有传播的危险, 那么他们也不应该提供血液喂养。
我们的维护协议旨在最大限度地减少实验室适应和选择性压力, 但仍有改进的余地。Leftwich et al.42提供了进一步的建议, 以保持蚊子在野外释放的适宜性, 包括使用更多样和自然的幼虫饮食, 减少笼中成人的密度, 并提供一个复杂的环境。这些注意事项可能会增强Ae. 蚊的适用性, 但目前还没有证据表明, 根据此处描述的维护协议 (罗斯et al.未发布的), 实验室适应将导致适应性变化。对于空间和资源有限的实验室来说, 一些额外的措施可能是行不通的, 但仍值得调查。保持大的人口规模, 避免主要的选择压力, 通过饲养协议和实施定期交的野外蚊子应有助于确保高适应性的Ae. 蚊的开放字段发布。该方法所涉及的原则可用于饲养其他病媒物种以释放来操纵或压制自然种群。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
我们承认, 对, 克里斯柏鼎言, 彼得约翰逊和克莱尔多伊格为我们的殖民地维护方法的发展作出了贡献, 三名匿名的评论家为他们的建议, 帮助改进了原稿。我们的研究得到了国家卫生与医学研究理事会的项目赠款和奖学金, 以及惠康信托基金的翻译资助。PAR 是澳大利亚政府研究培训项目奖学金获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wild type Aedes aegypti | Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details | ||
| w Mel-infected Aedes aegypti | Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain | ||
| w AlbB-infected Aedes aegypti | Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain | ||
| w MelPop-infected Aedes aegypti | Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain | ||
| Instant dried yeast | Lowan | Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used | |
| 5 L plastic tub | Quadrant | Q110950 | Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used |
| Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) | Tetra | 16152 | Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE |
| Plastic containers | Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable | ||
| Glass pipette | Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez | ||
| Clicker counter | RS Pro | 710-5212 | Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y |
| Rearing trays | Gratnells | Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com | |
| Nylon mesh | Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white | ||
| Cages | BugDorm | DP1000 | Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html |
| 35 mL plastic cup | Huhtamaki | AA272225 | Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used |
| 35 mL plastic cup lid | Huhtamaki | GB030005 | Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used |
| Cotton wool | Cutisoft | 71841-13 | Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used |
| White Sugar | Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores | ||
| Rope | M Recht Accessories | C323C/W | Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/ |
| Plastic cup (large) | Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable | ||
| Sandpaper | Norton Master Painters | CE015962 | Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html |
| Filter paper | Whatman | 1001-150 | Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used |
| Latex gloves | SemperGuard | Z560979 | Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/ |
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