Summary
Aqui, descrevemos um método que combina em situ MHC-tetrâmero coloração com imuno-histoquímica para determinar a localização, fenótipo e a quantidade de pilhas de T antígeno-específicos nos tecidos. Este protocolo é usado para determinar as características espaciais e fenotípicas de células T CD8 de antígeno-específicas em relação a outro tipo de célula e estruturas nos tecidos.
Abstract
As células T são essenciais para muitos processos imunológicos, incluindo a detectar e eliminar as células infectadas por vírus, evitando a auto-imunidade, auxiliando na produção de células B e células plasmáticas de anticorpos e detectar e eliminar as células cancerosas. O desenvolvimento do MHC-tetrâmero de coloração de células T antígeno-específicas, analisadas por citometria de fluxo tem revolucionado a nossa capacidade de estudar e compreender o immunobiology de células T. Embora extremamente útil para a determinação da quantidade e do fenótipo das células de T antígeno-específicas, citometria de fluxo não é possível determinar a localização espacial de pilhas de T antígeno-específicas de outras células e estruturas em tecidos e técnicas atuais de desagregação para extrair o T células necessárias para citometria de fluxo têm limitado eficácia em tecidos não-linfoides. In situ MHC-tetrâmero coloração (IST) é uma técnica para visualizar as células T que são específicas para os antígenos de interesse em tecidos. Em combinação com imuno-histoquímica (IHC), IST pode determinar a abundância, localização e fenótipo das células CD8 e CD4 T de antígeno-específicas em tecidos. Aqui, descrevemos um protocolo para manchar e enumerar as células T CD8 de antígeno-específicas, com fenótipos específicos localizados dentro de compartimentos de tecido específico. Estes procedimentos são as mesmas que usamos em nossa recente publicação por Li et al, intitulado "células produtoras de Simian vírus da imunodeficiência em folículos são parcialmente suprimidos pelo CD8 células+ In Vivo." Os métodos descritos são amplamente aplicáveis, porque pode ser usados para localizar, fenótipo e quantificar essencialmente qualquer célula T CD8 antígeno-específicos para os quais tetrâmeros MHC estão disponíveis, em qualquer tecido.
Introduction
As células T são essenciais para muitos processos imunológicos, incluindo a detectar e eliminar as células infectadas por vírus, evitando a auto-imunidade, auxiliando na produção de células B e células plasmáticas de anticorpos e detectar e eliminar as células cancerosas. O desenvolvimento de peptídeo/MHC classe I tetrâmero coloração de antígeno-específicas1 as células T CD8 e o mais recente desenvolvimento de MHC classe II tetrâmero coloração de células T CD42 por citometria de fluxo revolucionou a nossa capacidade de estudar e compreender o Immunobiology de células T. Embora extremamente útil para a determinação da quantidade e do fenótipo das células de T antígeno-específicas, citometria de fluxo não permitir a detecção da localização espacial das pilhas de T antígeno-específicas para outras células e estruturas nos tecidos e atual técnicas de desagregação para extrair as células T necessários por citometria de fluxo tem limitada eficácia em tecidos não-linfoides3.
Nós e os outros têm desenvolvido métodos usando peptídeo carregado MHC-classe I e classe tetrâmero II ou multimer reagentes para manchar as células CD8 e CD4 T antígeno-específicas em tecidos4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST estes métodos permitem a determinação do local, abundância e fenótipo de células CD8 e CD4 T antígeno-específicos tecidos e fornecer um meio para detectar dessas células em relação a outras estruturas nos tecidos e células. Nosso grupo tem usado extensivamente MHC-eu tetrâmero coloração para estudar o vírus de imunodeficiência humana (HIV) - e o vírus da imunodeficiência símia (SIV) - células T CD8 específicas nos tecidos linfoides, genitais e retais para obter uma compreensão do HIV e SIV imunopatogênese e para identificar correlações de vacinação bem sucedida estratégias14,15,16,17. Além disso, também desenvolvemos uma técnica que combina o IST com hibridação in situ (ISH) para localizar e quantificar as células T CD8 de vírus específicos e células infectadas por vírus em tecidos e para determinar os níveis de efetor-alvo na vivo 18 , 19.
Aqui, descrevemos um protocolo utilizando peptídeo carregado MHC-eu tetrâmeros manchar as células T CD8 de antígeno-específicas em secções de tecido fresco, para tecidos de corante de contraste usando IHC e quantificar células com fenótipos específicos em compartimentos de tecido específico. Estes procedimentos são os mesmos que foram utilizados em nossa recente publicação por Li et al, em que determinamos a localização, abundância e fenótipo de células T específicas SIV em tecido linfoide durante a infecção crônica do SIV em macacos20.
Para este procedimento, tecidos frescos são seccionados e incubados durante a noite com MHC do peptide-carregado-eu tetrâmeros conjugados a moléculas de tiocianato de fluoresceína (FITC). Então, eles são fixos em paraformaldeído. Após a fixação do tecido, o sinal de tetrâmeros o MHC é amplificado usando anticorpos de coelho anti-FITC e incubadas com fluorescente etiquetados anticorpos IgG anticoelho que mais amplificam o sinal dos limite tetrâmeros. IHC é usado em conjunto com o IST para caracterizar as células T antígeno-específicas e células circundantes. Anticorpos que reconhecem epitopos na superfície das células ou no espaço extracelular são incluídos na incubação preliminar com os tetrâmeros. Anticorpos que reconhecem epítopos intracelulares exigem permeação da parede celular antes da coloração. As secções de tecido manchado são fotografadas usando um microscópio confocal e analisaram utilizando o software confocal. Pilhas etiquetadas são quantificadas utilizando microscopia confocal software ou ImageJ. O protocolo descrito pode ser usado para manchar essencialmente qualquer célula T CD8 antígeno-específicas em qualquer tecido para qual MHC-eu tetrâmeros estão disponíveis.
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Protocol
1. dia 1: corte de tecido fresco e incubação primário
- uso um bisturi para cortar o tecido fresco em pedaços pequenos (aproximadamente 0,5 cm de largura por 0,5 cm de altura). Separadamente cada tecido para um êmbolo de cola e incorporá-los com 3-5 mL de agarose de baixo ponto de fusão de 4% em PBS. Rotule o êmbolo com a informação do tecido usando um adesivo. Colocá-lo em um suporte refrigerado em um balde de gelo para solidificar o.
- Ativar o micrótomo e defina a espessura das seções a 200 µm. Instale uma lâmina de barbear o micrótomo e insira o êmbolo montada com tecido no banho de micrótomo.
- Preparar o tampão fosfato salino com heparina (PBS-H) adicionando-se 100 µ g/mL ou 18,7 U/mL heparina para PBS para preservar o RNA e para permitir que aplicações potenciais ISH a jusante. Encher a banheira do micrótomo, cobrindo o tecido incorporado, com 100-120 mL de PBS estéril, refrigerado-H. Adicione cubos de gelo de PBS-H para o banho para manter a temperatura em 0 - 2 ° C. Start o micrótomo e corte o tecido em 200 µm seções.
Nota: É importante manter os tecidos refrigerados no gelo para minimizar a atividade celular nos tecidos e porque o tecido fresco é mais fácil de seção quando é tranquilo. PBS sozinho pode ser usado se não existem planos para jusante ISH. - Como alternativa, para tecidos que não cortadas com um micrótomo (por exemplo, intestino e pulmão), usar um bisturi ou lâmina de barbear para cortar o tecido em tiras finas como perto possível a 200 µm.
- Rotular a tampa das placas de cultura de tecidos de 24-bem com a informação da amostra experimental e colocar as câmaras de tecido em poços correspondentes. Use um pincel para transferir as seções para uma câmara de tecido conjunto no poço de uma placa de cultura de tecidos de 24-poço contendo 1 mL de refrigerados PBS-H.
Nota: As câmaras de tecido reutilizável devem ser feitas antes de iniciar a coloração. Câmaras de tecido podem ser feitas usando um tubo de snap-cap 14 mL polipropileno fundo redondo e engranzamento de fio. Use uma lâmina afiada para cortar a parte inferior de um tubo de snap-cap 14 mL polipropileno fundo redondo. Corte a malha de arame em um círculo para caber o buraco no fundo do tubo. O círculo de malha de arame usando um bico de Bunsen, até ficar em brasa de calor. Definir o círculo de malha de arame para baixo muito rapidamente e empurre o tubo para dentro da malha. Verifique se o engranzamento de fio é firmemente ligado ao fundo do tubo e então cuidadosamente cortar o topo do tubo na marca de 3 mL, usando uma lâmina de barbear afiada. Coloque até 3 seções de tecido em cada câmara de tecido, ou até 1 cm 2 de tecido por bem. Manter pelo menos um poço vazio entre poços com combinações de anticorpos diferentes para evitar a contaminação cruzada. - Proceder ao primário tetrâmero e anticorpo que mancha imediatamente depois de terminar a transferência de todas as seções cortadas em câmaras de tecidos. Manter as seções submerso e refrigeradas em 1 mL de PBS-H em todos os momentos.
- Incubar as seções de tecido durante a noite com 0,5 µ g/mL de conjugado FITC, peptídeo-carregado MHC-eu tetrâmeros diluídos em PBS-H, com 2% de soro de cabra normal (NGS). Incluir o mouse ou outros anticorpos de coelho não dirigidos a epitopos extracelulares de interesse nesta incubação (por exemplo, os anticorpos de anti-CD8 rato diluída a 1: 500 em PBS-H, com 2% NGS). Coloque 1 mL de anticorpos diluídos em cada poço.
Nota: Tenha cuidado ao selecionar o CD8 anticorpos, como alguns podem realçar e alguns podem inibir tetrâmeros MHC ligação a receptores de células T 4 , 21. O anticorpo de CD8 anti-humano rato descrito aqui é instável e às vezes resulta em coloração um pouco fraco. Ele é usado aqui para etiquetar triplo, porque é o único não-coelho e anticorpos de CD8 sem mouse testaram que as células T CD8 de macaco reso manchada. - Use 1 mL de solução por alvéolo para o anticorpo primário e incubação do subsequentes todas as e realizar isso e todos incubação do subsequente a 4 ° C, com as placas em uma plataforma oscilante.
Nota: Os tecidos devem flutuar livremente na câmara.
2. Dia 2: Fixação e incubação secundário
- após a incubação primária, lavar as seções duas vezes com 1 mL de PBS-H refrigerado por 20 min a cada lavagem. Para fazer isso, transferindo as câmaras de tecido para uma placa de cultura de tecido de 24-bem diferente contendo 1 mL de PBS-H refrigerado em poços correspondentes.
Nota: Tenha cuidado para não pingar o conteúdo de uma amostra experimental em outro quando se deslocam entre as câmaras de tecido. Para todos os subsequentes incubação do e lavagens, da mesma forma transferi a câmara de tecido para um prato limpo, contendo a solução adequada. Certifique-se de monitorar as seções nas câmaras de tecido durante o procedimento para certificar-se de que as seções não ficar preso aos lados das câmaras de tecido. Se eles, empurrá-los de volta para a solução. - Corrigir as seções com 1 mL de fresco tampão PBS paraformaldeído 4% para 2 h à temperatura ambiente (não excessivamente corrigir). Lavagem com PBS-H frio duas vezes por 5 min.
Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; usar equipamento de protecção adequado.
Nota: Se a recuperação do antígeno e permeabilização é necessária para detectar intracellular epitopes, antígenos podem ser recuperados por ebulição as seções em ureia de mol 0,01 após a fixação do paraformaldehyde. - Transferir as seções em placas de cultura 24-poço contendo ureia de mol 0,01 e colocar estas placas em um forno de microondas. Ferva as seções três vezes por cerca de 10 s cada um, para um total de 30 s.
Nota: Tenha muito cuidado, como ferver a solução pode forçar as seções fora dos poços. Se isso acontecer, use um pincel de adiar as seções das paredes da câmara de tecido ou da tampa da placa na parte inferior da câmara de tecido apropriado. - Prévio para a incubação do anticorpo secundário, permeabilize e bloquear as secções de tecido incubando-os em solução de bloqueio contendo PBS-H, 0,3% de detergente (PBS-H-T) e 2% NGS sobre um roqueiro para 1 h a 4 ° C. Perform subsequente incubação do anticorpo com NGS PBS-H-T/2%.
- Para a incubação secundária, transferir as seções nas câmaras de tecido para poços contendo coelho anti-FITC 1:10,000 de anticorpo diluído em NGS PBS-H-T/2%. Incubar durante uma noite.
- Perform counterstaining usando anticorpo anti-CD20 de rato diluído 1: 200 em PBS-H-T/2% NGS. Para essa opção, recuperar os epítopos, se necessário, permeiam as células e bloquear antes esta incubação, conforme descrito acima.
3. Dia 3: Incubação terciária
- após a segunda incubação, lavar as seções três vezes em PBS-H a 4 ° C, durante pelo menos 20 min.
- Realizar uma incubação final com o apropriado fluorescente etiquetado anticorpos (por exemplo, de cabra anticoelho conjugado amarelo esverdeado, cabra anti-rato conjugados tintura muito vermelha e cabra anti-rato tintura verde conjugado anticorpos diluído 1:5, 000, 1:5, 000 e 1:2, 000, respectivamente, em PBS-H-T/2% NGS). Incubar durante uma noite.
Nota: neste ponto, a incubação pode ser estendida por até três dias se necessário. Manter as seções protegidas da luz envolvendo as placas em folha de estanho durante este incupasso bation e, posteriormente, como luz sacia fluorophores.
4. Dia 4: As seções de montagem
- lavar as seções três vezes em PBS-H pelo menos 20 min.
Nota: Se o planejamento para a jusante ISH 19, corrigir as seções em paraformaldeído 4% para 1 h para garantir os tetrâmeros e anticorpos no lugar e depois lavar as seções duas vezes com PBS-H por 5 min cada.
Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; usar equipamento de protecção adequado. - Usar um pincel para transferir as seções para uma lâmina de microscópio. Tenha cuidado para não cutucar o tecido demais. Cubra cada seção com glicerol/gelatina contendo 4 mg/mL de n-propil galato ou outro meio de montagem, contendo um fluoróforo conservante. Cobrir com uma lamela.
- Armazenar os slides em um recipiente protegido contra luz slide em -20 ° C. Lave as placas de cultura de tecidos e remover os rótulos nas tampas usando álcool.
Nota: As placas podem ser reutilizadas..
5. Aquisição de imagens de microscópio Confocal
- captura imagens de alta resolução com um microscópio confocal, usando o apropriado lasers e filtros para cada fluoróforo ( figura 1A e B).
Nota: Neste exemplo, um microscópio confocal (consulte a Tabela de materiais) foi usado. Imagens foram coletadas usando o 561 nm laser em 20% de energia para as células de T de antígeno-específicas rótulo amarelo esverdeadas, o laser de 488 nm em potência de 10% para as células B CD20-expressando de rótulo verde e 640 nm laser em 15% de energia para as células T CD8 de longe com rótulo vermelho. Utilizaram-se os 20 X objetivo e uma abertura numérica de 0,8. - Sequencialmente coletar intervalos de z-série em 3 µm (ou outro) em três canais em vários campos de 800 x 800 pixels. Construir uma montagem dos campos coletados ( Figura 1 -E). Nomeie cada imagem de montagem com base nas informações do slide correspondente e salvar para análise.
- Realizar a análise quantitativa de imagem usando o software de análise e quantificação do respectivo microscópio confocal ou ImageJ.
6. Análise quantitativa de imagem
Nota: análise quantitativa de imagem pode ser realizado usando software de análise e quantificação do microscópio confocal ou usando o software ImageJ. Aqui, o ImageJ foi usado como exemplo.
Montagem de- aberto por confocal arrastando-o para a janela do ImageJ ( Figura 2A).
Nota: ImageJ pode abrir diretamente montagens coletadas por muitos diferentes microscópios confocal. Se a montagem não pode ser aberta diretamente pelo ImageJ, exportar o z-scan selecionado como um arquivo TIFF para abri-la - Duplicar o z-scan selecionado para análise (" imagem "-> " duplicar ") ( Figura 2B).
- Dividir os diferentes canais (" imagem "-> " cor "-> " Split canais ") ( Figura 2).
- Desenhar o ROI da análise quantitativa no canal correspondente para ser objectivo e adicioná-lo ao gerente do ROI pressionando " T " no teclado. Medir a área de.
Nota: O Gerenciador de ROI do ImageJ mostra a área em µm 2 ( Figura 2D). - Ajustar o brilho da fluorescência e contraste do canal a ser analisado (" imagem "-> " ajuste "-> " brilho/contraste ") ( Figura 2E).
- Achatar o ROI na imagem (" Gerenciador de ROI "-> " Flatten ") ( Figura 2F).
- Quantificar as células positivas a imagem usando o " multi-ponto " ferramenta ( Figura 2).
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Representative Results
A Figura 1 mostra como coletar imagens confocal, usando um microscópio confocal. A Figura 2 demonstra a análise quantitativa de imagem usando o ImageJ. Figuras 3 e 4 mostram representante imagens dos tecidos do nó de linfa de uma SIV infectado macaque do rhesus manchado com tetrâmeros de MHC e CD8 anticorpos anticorpos CD20 e servem para demonstrar a especificidade da MHC-tetrâmero de coloração. A Figura 3 compara MHC classe I tetrâmeros carregado com um peptídeo de SIV em comparação com as seções do mesmo tecido manchado com o MHC-classe eu tetrâmeros carregado com um peptídeo irrelevante. A Figura 4 mostra que células manchadas com o tetrâmero de peptídeo-MHC/SIV são co manchadas com CD8 anticorpos, mas não CD20 anticorpos, que mancham as células B. A Figura 5 mostra um exemplo de uma montagem criada a partir de vários campos de z-series confocal usados para quantificação de tetrâmero manchado células com fenótipos específicos em diferentes compartimentos anatômicos do nó de linfa. A ampliação mostra uma área do nó de linfa com um folículo de células B delineado pela coloração de CD20 e circundante zona de células T, na qual podem ser detectadas células MHC-tetrâmero-manchado, alguns dos quais co expressam Ki67, que é um marcador de proliferação e ativação de células T. Esta combinação de coloração permite a determinação do fenótipo de células T CD8 de SIV específicas dentro e fora da célula B folículos, em relação às células T CD8 de SIV-específicas e para outras células expressando Ki67 e as células B.
Figura 1: Representante Screenshots mostrando como coletar imagens Confocal, usando um microscópio Confocal. Aquisição de (A) o modo usado para coletar imagens confocal. (B) canais utilizados para a coleção de imagens. (C) 20 X objetivo e 800 x 800 pixel campos foram usados na coleção de imagens. (D) um sequencial z-pilha foi coletado em intervalos de 3 µm. (E) telhas foram adoptadas para delinear e coletar imagens em vários campos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Representante Screenshots demonstrando quantitativa de imagem análise usando o ImageJ. (A) abrir uma montagem confocal arrastando-o para a janela do ImageJ. (B) duplicado o z-scan selecionado para análise. (C) dividir os diferentes canais. (D) desenhar o ROI da análise quantitativa no canal correspondente, para ser objetiva e adicioná-lo ao gerente do ROI pressionando "t". (E) ajuste o brilho da fluorescência e contraste do canal a ser analisado. Flatten (F) o ROI na imagem. (G) contagem de células de positivo na imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : IST combinou com IHC em seções linfonodal axilar de um macaco Rhesus infectados com SIV. Mamu - A * 02 tetrâmeros carregados com peptídeos SIV Nef YY9 foram usados para manchar as células T CD8 de antígeno-específicas, e semelhantes tetrâmeros carregados com um peptídeo FLP irrelevante do vírus da hepatite B foram usados como um controle negativo (vermelho). Anticorpos anti-CD20 de mouse foram usados para manchar o CD20+ B células (verde), e os anticorpos anti-CD8 de rato foram usados para manchar o CD8+ T células (azul). (A), A imagem representativa de uma seção de linfonodal axilar manchado com YY9 tetrâmeros, CD20 e CD8 anticorpos. (B) a mesma imagem como no painel um mostrando o tetrâmero YY9 mancha sozinho. (C) a imagem representativa de uma seção da mesma linfonodal axilar, corados com tetrâmeros FLP e anticorpos CD20 e CD8. C (D) a mesma imagem como no painel com o tetrâmero FLP mancha sozinho. Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : IST combinado com IHC mostrando a especificidade de manchar o MHC-tetrâmero. Seção de representante linfonodal axilar manchada com Mamu - A * 02 tetrâmeros carregados com peptídeos Nef YY9 de células T CD8 de SIV específicos de rótulo (vermelhas), anticorpos anti-CD20 de rato para células B de rótulo (verdes) e os anticorpos anti-CD8 rato etiqueta T CD8 células (azuis) (A ). É uma célula T CD8 de SIV específicos tetrâmero + (B), CD20– (C) e CD8+ (D). Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: IST combinou com IHC para mostrar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas. (A) representante linfonodal axilar seção manchada com Mamu - A * 02 tetrâmeros carregados com peptídeos Nef YY9 para rotular as células T CD8 de SIV específicos (vermelhas), anticorpos Ki67 etiquetar pilhas proliferating (verde) e anticorpos IgM para células de rótulo B (azul). Barra de escala = 100 µm. alargamento (B) de uma região selecionada no painel r. IgM coloração define a área folicular, que é marcada como "F"; a área extra-foliculares é marcada como "EF". Células de tetrâmero+ são indicadas com setas. Barra de escala = 100 µm. representante tetrâmero+ Ki67 celular– (C, D, E) e tetrâmero+ Ki67+ célula (F, G, H). Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
IST combinada com IHC fornece uma ferramenta essencial para detectar, caracterizar e quantificar as células T CD8 de antígeno-específicas em ambientes nativos com o contexto de outras células e estruturas do tecido. Aqui, descrevemos os procedimentos detalhados para IST combinada com IHC, seguido de análise quantitativa de imagem, para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T CD8 de antígeno-específicas em linfonodos de macacos rhesus. Coloração semelhante pode ser aplicada ao ser humano, rato, ou outros tecidos de espécies para as qual MHC-eu tetrâmeros estão disponíveis. Além disso, peptídeo tetrâmero de MHC classe II ou dextramer coloração pode ser executada usando metodologias relativamente semelhantes para rotular as células T CD4 de antígeno-específicas em tecidos4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST também pode ser combinado com ISH para determinar, por exemplo, na vivo células efetoras-alvo níveis18,19. No futuro, será interessante transportar IST/IHC ainda mais combinando IST/IHC com avançados em situ RNA e DNA deteção metodologias. Avanços recentes em ensaios de hibridização em situ incluem o desenvolvimento de RNAscope e DNAscope24. Estas técnicas permitem a detecção de alvo do RNA e DNA nos tecidos. Será emocionante combinar essas metodologias com IST e IHC para detectar simultaneamente as células T CD8-vírus-específicas, RNA viral, DNA viral e anticorpo-etiquetado antígenos de interesse.
Enquanto nós originalmente descritos métodos IST com tecidos frescos, os tecidos que foram corrigidos por uma curta duração e tecidos congelados4, nos últimos anos, temos exclusivamente usado seções de tecido fresco, que consistentemente produzem as manchas da mais alta qualidade e permitir o exame das células em secções de tecido grosso. Como uma alternativa aos procedimentos aqui apresentados, um pode aplicar tetrâmeros aos tecidos, incubar durante uma noite, corrigir, incorporar e cryopreserve no meio de congelação (por exemplo, OCT), produzir seções finas congeladas e executar IHC posterior22. Da mesma forma, nós rotineiramente manchar um subconjunto das secções de tecido com tetrâmeros sozinho e depois congelar as seções na OCT para permitir combinações counterstaining adicionais no futuro. Além disso, oriundas de peptídeo-MHC Qdot 655-conjugado podem ser usadas para visualizar diretamente as células T antígeno-específicos no tecido criopreservado as seções13.
Descrevemos aqui tetrâmero indireto de coloração. Direto de coloração usar tetrâmeros APC ou PE-conjugados também foi mostrado para trabalhar4,22. Neste caso, a concentração de tetrâmero de MHC exigido é maior do que usado na coloração de tetrâmero indireto. Em nossas mãos, uma concentração de 20 µ g/mL de tetrâmero APC-etiquetado foi eficaz na detecção de células antígeno-específicas. No entanto, a intensidade de coloração foi muito menor do que o obtido com rotulagem indireta, que inclui amplificação com anticorpos anti-FITC.
Nós achamos que o uso de um micrótomo baseado em compressão (ver a Tabela de materiais) para corte de tecido fresco facilitou o processo de corte de seções de tecido fresco como comparado ao uso de uma vibração micrótomo23. No entanto, em casos onde um micrótomo baseado em compressão não estiver disponível, um micrótomo vibratória ou bisturi pode ser usado para corte de tecido fresco.
Uma grande limitação dessa técnica é o uso de tecidos frescos. Usar tecidos frescos é muito mais difícil do que tecidos congelados ou fixos, porque eles exigem processamento e atenção imediata. Nós enviamos com êxito os tecidos frescos durante a noite no gelo em meio de cultura de tecido ou PBS-H. No entanto, há problemas ocasionais com frete; por exemplo, as tempestades de neve adiaram a remessa de tecidos durante 48 h ou mais. Nestes casos, nós achamos que fresco tecidos seccionados e aqueles manchados pós-extração de 48 h geralmente mostram coloração específica, com sinais de alguma degradação do tecido; tecidos manchados pós-extração de 72 h também são degradados para coloração. Também achamos que a remessa de tecidos frescos com blocos de gelo que estão muito frio ou muito perto de que tecidos podem congelar os tecidos durante o transporte; Este congelamento geralmente destrói o tecido para a coloração. Assim, é extremamente importante navio tecidos frescos, refrigerados, mas não congelada e iniciar o IST coloração dentro de 24 h. processamento de tecido fresco também requer uma grande quantidade de estudantes e pessoal de tempo, como os tecidos de vários animais ou os participantes do estudo não podem ser coletados e manchados juntos em uma data posterior. Apesar dessas dificuldades, encontramos que seções de tecido fresco são a melhor escolha para coloração de IST/IHC bonito, específico.
Outra limitação do método IST/IHC descrito aqui é a abordagem indireta de coloração. Devido a limitações no número de espécies distintas de animais disponíveis para gerar combinações de anticorpo secundário, estamos limitados pelo anticorpo indireto coloração métodos de anticorpos fluorescentes apenas três ou quatro combinações de coloração de cada vez. Isto limita a quantidade de informações que podem ser coletadas em uma laje de tecido. Coloração de IHC direto supera essa limitação e pode expandir as capacidades, detecção de antígenos anticorpos marcados de oito ou mais simultaneamente, embora com cada anticorpo produzindo um sinal fluorescente muito mais fraco em comparação com métodos indirectos. Assim, IHC indireta pode ser usado como uma alternativa ao IHC indireta para counterstaining IST-manchado tecidos, permitindo a detecção de aumento do número de antígenos celulares quando combinado com a detecção de IST de células T CD8 de antígeno-específicas.
Em alguns casos, autofluorescência substancial e/ou tetrâmero ou anticorpo inespecificas podem ocorrer com IST/ISH. Devido a isso, bons controles positivos e negativos são necessários para discernir manchas específicas do plano de fundo e autofluorescent de coloração. Bom negativo controla para MHC tetrâmeros incluem tecidos de controlo negativo (por exemplo, os tecidos não infectados; tecidos manchados com MHC eu tetrâmeros carregado com peptídeos irrelevantes ou irrelevantes tetrâmeros MHC; ou, em uma pitada, tecidos manchados com não tetrâmeros mas com anticorpos de amplificação).
Em resumo, o MHC I IST combinada com IHC é uma ferramenta valiosa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T CD8 de antígeno-específicas em tecidos. Esta metodologia permite a detecção de células T CD8 de antígeno-específicas em ambientes nativos, com a localização relativa a outros tipos de células e estruturas de tecido mantidas. Este método é amplamente aplicável, porque ele pode ser usado para localizar, fenótipo e quantificar essencialmente qualquer célula T CD8 antígeno-específicas para qual MHC tetrâmeros estão disponíveis, em qualquer tecido.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública concede a partir do National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2,000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
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