Biology

Dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비

Published: December 19, 2007 doi: 10.3791/562

Lutz G. W. Hilgenberg¹, Martin A. Smith¹

¹Department of Anatomy and Neurobiology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

이 비디오는 후반 배아와 초기 출생 후의 마우스 피질에서 문화의 연결을 생성하는 절차를 보여줍니다. 이러한 문화가 immunocytochemistry, 생화학, 전기 생리학, 칼슘, 나트륨 이미징에 사용되며 출생 후의 치명적인 유전자 변이를 가지고 유전자 변형 동물의 개발의 연결을 연구하는 플랫폼을 제공하실 수 있습니다.

Abstract

이 비디오는 후반 배아와 초기 출생 후의 마우스 두뇌의 대뇌 피질의 연결을 문화를 생성하는 과정을 통해 여러분을 안내할 것입니다. 이러한 문화가 immunocytochemistry, 생화학, 전기 생리학, 칼슘, 나트륨 이미징, 단백질 및 / 또는 RNA 격리를 포함하여 다양한 어플 리케이션에 사용될 수 있습니다. 이 문화는 또한 늦은 배아 또는 출생 후의 치명적인 유전자 변이를 가지고 유전자 변형 동물의 개발의 연결을 연구하는 플랫폼을 제공합니다. 절차는 상대적으로 바로 전달됩니다 조직 문화 기술의 경험을 필요로하고 당신이 제대로 준비가되어있다면 더 이상보다 두세 시간 걸릴 안됩니다. thalamo - 피질 섬유 트랙트에서 대뇌 피질의 껍질주의 분리 원치 않는 비의 연결을 세포의 수를 줄일 수 있습니다. 의 연결을 세포의 수율은 효소 인큐베이션 단계 뒤에 부드럽게 피질 조직의 조각을 씹다 증가합니다. 그것이 세포 상조의 연결을 세포 죽음에 불필요한 부상을 방지 등이 필수적입니다. 이러한 문화가 glia 피더 세포의 부재로 유지되므로, 그들은 또한 뉴런에서 풍부한 성장 문화의 추가 혜택을 제공합니다.

Protocol

culturing의 하루 전에 준비 :

무균 해부 솔루션 (DS)를 준비합니다.
NBM/B27 (B27 보충제로 Neurobasal Mediom)를 준비합니다.
필요한 경우 압력솥 ddH ₂ O가 있으며, 유리 coversilps을 소독.
폴리 - D - 라이신과 코트 조직 문화 요리 또는 유리 coverslips.

폴리 - D - 라이신 코팅 :

무균 조건 하에서 culturing 전에 하루를 준비합니다.

얼음 10X PDL 장소의 해동의 나누어지는.
PDL 1 ML 9 ML 살균 울트라 필터 물을 추가하고 (1X) 잘 섞는다.
다음과 같이 실온에서 하룻밤 1X PDL로 코트 표면 :
- 유리 coverslips (Bellco 유리 주식 회사 캣 # 1943-00012.) : 75 μl / coverslip
  또는
- 24 잘 문화 플레이트 : 잘 300 μl /
  또는
- 35mm 문화 요리 : 1ml/dish
멸균 물 (액체를 대기음으로 살균 파스퇴르 pipettes를 사용)으로 5 배 헹굼.
표면이 완전히 건조 될 때까지 물을 제거합니다.

Culturing 절차 (무균 조건 하에서 층류 후드에서 수행)

슈퍼 접착제를 사용하여 마이크로톰 Vibraslicer (캠덴 인 스트 루먼트 (주))의 지원 블록에 한천과 접착제 그것 블록을 잘라 버릴거야.
늦은 배아 단계 (E17 - 18) 마우스 fetuses, euthanise 댐을 사용하는 경우, 배아 자루에서 자궁 무료 개인 fetuses를 제거합니다. 플레이스 멸균 페트리 접시에 fetuses 계속은 아래에 설명했다.
참살 마우스 태아 또는 펍 (귀하의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 승인에 따라 지침).
감기 DS 가득한 60mm 배양 접시에있는 왓먼 필터 종이 디스크에 피부와 두개골과 장소의 두뇌를 제거합니다.
멸균 면도날을 사용하여 소뇌를 잘라.
주걱을 사용하여 두뇌를 들고 필터 종이에 여분의 액체를 배수, 다음 장소에서 Vibraslicer 지원 블록과 접착제의 뇌 (꼬리 쪽 위쪽 및 한천에 직면하고 복부 부분)에 머리를 전송할 수 있습니다.
감기 DS와 챔버를 입력합니다. 8-9로 속도 선택을 설정합니다.
후각 망울에서 시작, 200-400 μm의 섹션을 잘라 버릴거야. Vibraslicer의 날개가 피질를 입력하면, 600μm 코로나 섹션을 절단 시작합니다. P0 마우스 두뇌 4-5 사용 가능한 조각 산출 동안 E17 - 18 마우스 두뇌는 일반적으로 3-4 사용 가능한 조각 산출.
10 ML 유리 파스퇴르 pipet을 취소 - 연결의 리버스 엔드를 사용하여 DS 2 분류 35mm 페트리 접시에 뇌 조각을 전송합니다.
피질을 절개하다 및 모세관 튜브에서 나온 유리 바늘을 사용하여 meninges를 제거합니다.
작은 조각, 길이 0.5-1 mm로 대뇌 피질의 rinds 컷.
0.2 μm의를 통해 필터 ES는 35mm 페트리 접시에 5 CC 주사기에 부착된 필터.
필터 ES를 포함하는 페트리 접시에 대뇌 피질의 조직 조각을 전송합니다.
37 ° C 30 분 알을 품다.

그 동안에 :

후드, Vibraslicer 및 해부 도구를 청소하십시오.
60mm 페트리 접시에 따뜻한 NBM/B27 5 ML을 추가합니다.

30 분 후. 부화 :

10 ML의 DS에 조직을 전송합니다. 1 분에 대한 청산하자.
첫째 안녕 튜브 소용돌이 모양으로 조직을 전송 후 2-3 분 쉬라 구.
초 하이로 전송합니다. 위에서 반복합니다.
첫째 리로 전송합니다. 위에서 반복합니다.
둘째 리로 전송합니다. 위에서 반복합니다.
셋째 리로 전송합니다. 위에서 반복합니다.
미디어와 60mm 요리에 조직을 전송합니다.

해부 현미경 아래에서 :

깨끗한 조직의 파편과 부드럽게 조직을 느슨하게하기 위해 가져온 유리 pipet (구멍 크기를 감소 사용)을 통과하여 각 조각을 씹다.
NBM + B27의 나머지 부분을 (. - 35mm 요리 부드럽게 믹스 및 정착에 조직의 대형 조각 기다리는 5 24 잘 접시 또는 11 ML 13 ML 총 만들기)이있는 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
전송 세포 현탁액 (24 잘 접시 또는 2 ML / 35mm 문화 요리 / 음 0.5 ML).
유리 coverslips를 사용하는 경우, coverslip 당 80 μl 세포 현탁액을 추가하고 세포가 더 많은 NBM/B27 미디어 챔버 홍수 전에 준수하는 조직 문화 인큐베이터에서 1 시간을 허용합니다.
37 ° C와 5% CO _2의 문화를 유지합니다.

내일

24 잘 플레이트 (cNBM/B27; cNBM/B27 매체의 준비 프로토콜 아래에 나타납니다) NBM/B27 매체를 갖추 0.5 ML 이외의 연결을 세포와 각 잘 피드

35mm 요리 : cNBM/B27 매체 0.5 ML를 교체하십시오.

신선한 cNBM/B27 모든 2~3일과 매체의 0.5ml을 대체하여 문화를 유지합니다.

문화 미디어가 glia 세포의 증식을 촉진하지는 않지만, 문화가 필요한 경우 추가로 glial 세포의 수를 줄이기 위해 문화의 일 3-5에서 5μM FDU (5 - 플루오로 - 2' - deoxyuridine, 시그마 F0503)로 치료하실 수 있습니다.

SET - UP 해부 문화

70 % EtOH에서 해부 도구를 소독하거나 압력솥 :

가위 (med. 작은) Spatulas (med. 작은)
핀셋 (med. 작은) 면도날
vibraslicer 버퍼 목욕 블레이드
두뇌를위한 블레이드 지원 작은 금속 웨지

기타 자료 :

페트리 요리 (60 ㎜)
페트리 요리 (35 ㎜)
필터 용지
유리 pipet 10 ML
멸균 일회용 pipets, 5,10, 25 ML
주사기 필터, 0.2 μm의
주사기 5 CC
원심 분리기 튜브 15 ML
무균 파스퇴르 유리 pipets
PDL 코팅 문화 요리 또는 유리 coverslips

라벨 육 15 ML의 원심 분리기 튜브와 준비를 따르십시오 :

지하철 # 1 : 효소 솔루션 :

포함 5 ML의 DS에 papain (워싱턴 LS 03,126) 50 U를 추가합니다

L - cystein의 100μl (0.8mg)
7 μl 0.1N NaOH
50 μl APV (5mM)

취소하고 실온에서 솔루션을 둡니다. 그 효소 솔루션은 처음에는 '흐리고'표시 및 사용하기 전에 명확해야합니다합니다.

튜브 # 2 & # 3 : 히 효소 억제제 :

3 ML DS + 300 μl BSA / 티 + 30 μl APV (5mM).

거품을 피하기 위해 부드럽게 믹스 살다가 두 1.5ml aliquots로 나눕니다.

튜브 # 4 - # 6 : 낮음 효소 억제제 :

8 ML DS + 80 μl BSA / 티 + 80 μl APV (5mM).

거품을 피하기 위해 부드럽게 믹스 세 2.6 ML aliquots로 나눕니다.

플레이스 튜브 얼음이 # 6을 통해 # 2 번호. 튜브 # 1 (효소 솔루션) 실온에서 둡니다.

솔루션과 ALIQUOTS

솔루션 A (살린 버퍼) 시그마 공식 WT 500 ML [CONC.]
염화나트륨 (소금) NaCl S - 9625 58.45 80.0g 137mM
염화칼륨 KCl P - 4504 74.56 4.0g 5.4mM
나트륨 인산 이염 무수 나 ₂ HPO ₄ S - 0876 142.0 0.24g 0.17mM
인산 칼륨 일염기의 무수 KH ₂ PO ₄ P - 5379 136.09 0.3g 0.22mM

400 ML 울트라 필터링 물에 용해까지 모든 재료와 혼합을 나가는거야. 500 ML에 마지막으로 볼륨을 가져와. 깨끗한 병에과 압력솥에 넣습니다. 4 ° C 보관 및 레이블 "DS 솔루션".

솔루션 B (Hepes) 시그마 공식 WT 250 ML [CONC.]
Hepes Hepes H - 3375 283.3 20.97g 9.9mM

200 ML에 울트라 필터 물을 추가합니다. 해산까지 믹스 250 ML에 최종 볼륨을 가지고. 깨끗한 병에과 압력솥에 넣습니다. 4 ° C 보관 및 레이블 "DS 솔루션 B".

워킹 솔루션 500 ML [CONC.]
울트라 여과 물 400 ML
증권 솔루션 25 ML
증권 솔루션 B 14 ML
D (+) - 포도당 시그마 G - 8270 3.0 g 33.3mM
자당 시그마 S - 0389 7.5 g 43.8 MM

1N NaOH와 7.4으로 산도를 조정합니다. 울트라 여과 물 500 ML에 마지막으로 볼륨을 가져와. 깨끗한 유리병과 압력솥에 가만히 따르다. 4 스토어 ° C. 라벨 '분석 해 봅시다 솔루션 ".

폴리 - D - 라이신 준비 :

1mg/ml에서 무균 H ₂ O에서, 폴리 - D - 라이신의 10X 재고 솔루션 (시그마 P - 7280 PDL)를 준비합니다.
1.0 ML의 aliquots을 만듭니다. 이 솔루션은 최대 3 개월까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.

미디어

의 10ml 추가 B - 27 보충 (Gibco 17504-044) 500 ML의 NBM 병 (Neurobasal 매체, Gibco 21103-049)에 적용됩니다.
4 40 ML aliquots하고 저장하십시오 ° C.

APV

10 MG APV의 유리병 10 ML 살균 H ₂ O를 추가 (2 - 아미노 -5 - phosphonopentanoic 초산, 시그마 A - 5282)과 철저히 섞는다.
-20 ° C.에 180 μl aliquots 및 상점 준비

BSA / 티

10 ML의 DS에 1g BSA (보빈 알부민. 시그마 A - 7030)과 1g 트립신 억제제 (시그마 T - 9253)을 디졸브.
1N NaOH와 7.4으로 산도를 조정합니다.
0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터링하여 소독.
-20 ° C. 400 μl aliquots 및 저장소로 나눌

L - 시스테인

Eppendorf 튜브에 200 μl DS에 0.6 MG L - 시스테인 (시그마 C - 7755)를 해산.

한천 (4 %)

100 ML 멸균 물의 Bacto 아가르 4 G (Difco 0140-01)을 디졸브. 문화 필요한 ° C까지 4 계속.
전자 아가르는 35mm 페트리 접시 녹으 입력합니다. 진정 및 중합에 앉아 보자.

PAPAIN (워싱턴 LS 03,126)

NUNC 문화 병에 e_title "> 비상의 연결을 문화

코팅 문화 병 (4 Nunc 병)

1X PDL를 만들기 위해 10X PDL 3 튜브에 각각 9 ML 멸균 물을 추가합니다.
첫번째 병 30 ML 1X PDL을 전송합니다.
모든 성장 표면이 덮여 때까지 약간 이동합니다. 1 분 앉아 보자.
둘째 병 1X PDL을 전송합니다. 1 분 앉아 보자.
포스 세번째 병 반복합니다.
150 ML 무균 H ₂ O.와 배 모두 네 병을 씻어

효소 솔루션 (ES)를 준비 :

결정이 녹아 때까지 0.6 ML의 원심 분리기 튜브 무게 0.8 아웃 MG L - 시스테인 (시그마 C7755)은 150ml DS와 와동를 추가합니다.
15 ML 원뿔 관 5 ML의 DS를 전송 후, L - 시스테인 150ml를 추가합니다.
50 단위 Papain를 추가합니다. (워싱턴 LS 03,126)
7ml 0.1N NaOH를 추가합니다.

준비 멤 (GIBCO # 11090-081)

500 ML의 멤 병에서 65 ML을 제거합니다. 포도당 준비 10 ML을 저장합니다.
5 ML 펜 / Strep을 (Gibco # 15070-063) 추가합니다.
10 ML 1M 포도당 (시그마 G - 8270) (1.8 g / 10 ML 멤)를 추가
50 ML 태아 소 혈청 (Gibco # 16140-071) 또는 보빈 카프 세럼 (오메가 BC - 04)를 추가합니다.
4 잘 섞어서 나누어지는 및 저장 ° C.

NEUROBASAL MEDIUM/B-27 보충 (NBM/B27)
NBM 500 ML (Gibco # 21103-049), B - 27 (50X), 10 ML (Gibco # 17504-044)

NBM 병 및 혼합에 B - 27 유리병의 전체 내용을 추가합니다.
4 ° C.에서 나누어지는 및 저장

뇌 조직의 해부

드라이 해부하기 전에 70 % EtOH에서 도구를 해부.
3-15 ML 튜브의 각 10 ML의 DS를 전송합니다.
마우스 새끼를 (P0 - P3)을 선택, 당신은 4 병 세 두뇌가 필요합니다.
35mm 페트리 접시에 차가운 DS를 추가합니다.
마우스 강아지 참살하고 머리를 절개하다.
감기에 DS를 포함하는 페트리 접시에 플레이스 두뇌.
유리 피펫을 통과하기 위해 충분히 작은 조각으로 조직을 잘라.

효소 분리

파스퇴르 피펫으로 접시에서 가능한 한 많은 DS로 제거합니다.
0.2 μm의 필터와 5cc 주사기를 통해 필터 ES.
조직과 함께 접시에 ES를 배치합니다.
37 조직을 품어 30 분 ° C 배양기 (CO ₂ 무료).

조직 워싱

가능한 작은 ES로 받아보실하는 최초의 DS 튜브에 유리 피펫로 전송 조직.
1,500 rpm으로 30 초위한 원심 분리기.
조직 및 반복 절차를 두 번 더 전송합니다.

가루약

50ml 원심 튜브에 멤 / FBS 38 ML을 플레이스
이 배양 접시에 35mm 요리 및 전송 조직에 멤 / FBS 3 ML을 추가합니다.
부드럽게 1000μl eppendorf의 pipet 팁 통해 triturating하여 조직을 떼어 놓다.
멤 / FBS의 38ml를 포함하는 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 잘 섞는다.

도금

각 병의 세포 현탁액 및 미디어 동등한 금액을 얻기 위해서는 수직으로 문화 병 스탠드.
각각의 문화 병에 멤 / FBS 90 ML 놔.
각 병의 세포 현탁액의 10 ML을 추가합니다.
레이블 : 비의 연결, 이니셜 및 날짜. 37 ° C와 5% CO ₂ 알을 품다.

수유

에서 3 일 또는 4, 따뜻한 멤 / FBS (가만히 따르다 모든 미디어 및 멤 / FBS 100 ML로 대체)로 피드 세포. 문화 합류 될 70-10일 걸릴 수 있습니다.
일 7-10에 NBM/B27에 대한 미디어를 변경합니다.
다음날, 미디어를 수집합니다. 0.22μm로 필터
40 ML의 aliquots을 만들어 멤 / FBS와 문화를 피드.
2 삼일 다음 NBM/B27 미디어를 변경
다음날, 수집 및 절차를 반복합니다.
약 미디어를 수집 보관. 이주.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Potassim Chloride	Sigma-Aldrich	P4504
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	S0876
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Neurobasal Media (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid	Sigma-Aldrich	A5282
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papain	Worthington Biochemical	LS 03126
Sterile 0.2 μm Syringe Filter	Fisher Scientific	DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11090-081	with Earle’s saltswithout L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063	for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-071	needed for non-neuronal cultures
Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle	Fisher Scientific	12-565-25	Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom "Imaging dishes"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Glass bottomed, 35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!