Biology

Подготовка диссоциированных Мышь корковых культур Нейрон

Published: December 19, 2007 doi: 10.3791/562

Lutz G. W. Hilgenberg¹, Martin A. Smith¹

¹Department of Anatomy and Neurobiology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

Это видео показывает процедуру для создания нейронных культур с конца эмбриона и раннего послеродового коры мыши. Эти культуры могут быть использованы для иммуноцитохимии, биохимии, электрофизиологии, кальция и натрия изображений и обеспечить платформу для изучения нейронных развития трансгенных животных, которые несут послеродового летальная мутация гена.

Abstract

Это видео поможет вам процесс создания корковых нейронов культур с конца эмбриона и раннего постнатального мозга мыши. Эти культуры могут быть использованы для разнообразных приложений, включая иммуноцитохимии, биохимии, электрофизиологии, кальция и натрия с изображениями, белка и / или РНК изоляции. Эти культуры также предоставляют платформу для изучения нейронных развития трансгенных животных, которые несут конце эмбриона или послеродового летальная мутация гена. Процедура сравнительно простой, требует некоторого опыта в ткани культуры и техники не должно занять больше времени, чем два-три часа, если вы должным образом подготовлены. Тщательное разделение корковых кожуру от таламо-корковые волокна тракта позволит сократить количество нежелательных без нервных клеток. Чтобы повысить урожайность нервных клеток растирают кусков корковой ткани мягко после шага инкубации фермента. Это необходимо, так как предотвращает ненужное повреждение клеток и преждевременной гибели нейронов клетки. С этих культур ведутся в отсутствие клеток глии подачи, они также предлагают дополнительное преимущество растущих культур обогащенные нейронами.

Protocol

Подготовка до дня культивирования:

Подготовка стерильного рассекает решение (DS).
Подготовка NBM/B27 (Neurobasal Mediom с B27 добавки).
Автоклав DDH ₂ O и стерилизовать стеклянные coversilps, если нужно.
Пальто культуры тканей посуду или стеклянные покровные с поли-D-лизина.

Поли-D-лизин Покрытие:

Подготовка день до культивирования в стерильных условиях.

Оттепель аликвоту 10X PDL и место на льду.
Добавить 9 мл стерильного ультра-фильтрованной воды до 1 мл PDL и хорошо перемешать (1X).
Пальто поверхности 1X PDL ночь при комнатной температуре следующим образом:
- стекла покровные (Bellco стекла, Inc Cat # 1943-00012.): 75 мкл / покровное
  ИЛИ
- 24-луночный планшет культуры: 300 мкл / лунку
  ИЛИ
- 35 культура блюдо: 1ml/dish
Промыть 5 раз стерильной водой (используйте стерильные пипетки Пастера для аспирации жидкости).
Удалить воду, пока поверхность полностью не высохнет.

Культивирование процедуры (сделано в ламинарный поток капот в стерильных условиях)

Вырежьте блоке агар и приклейте ее на поддержку блока микротома Vibraslicer (Campden инструменты ООО) с помощью супер клея.
При использовании поздней эмбриональной стадии (E17-18) мыши плода, euthanise плотины, удалить матку и свободной личности плодов из эмбриональных мешок. Место плодов в стерильную чашку Петри и продолжают, как описано ниже.
Обезглавьте плода мыши или щенка (следовать руководящим принципам, утвержденным вашего Институциональные уходу и использованию животных комитет).
Удалить кожу и череп и мозг место на диске Ватман бумажный фильтр в чашку Петри 60 мм заполнены холодной DS.
Отрежьте мозжечка использованием стерильного лезвия бритвы.
Возьмите мозга с помощью шпателя и слейте лишнюю жидкость на фильтровальную бумагу, а затем перенести мозга Vibraslicer блок поддержки и клей мозг в месте (хвостовой стороной вверх и вентральной части перед агар).
Заполните камеры с холодной DS. Установите переключатель скоростей до 8-9.
Вырезать 200-400 мкм разделов, начиная от обонятельной луковицы. Как только лезвие Vibraslicer входит коры, начинают резки 600μm корональные разделы. E17-18 мозга мыши обычно дает 3-4 полезной ломтиками, в то время как P0 мозга мыши дает 4-5 полезной ломтиками.
Передача мозга ломтиков до 35 мм чашки Петри помечены DS 2 с помощью обратного конца не-подключено 10 мл стеклянные пипетки Пастера.
Рассеките из мозга и мозговых оболочек удалить с использованием стеклянных игл вытащил из капилляров.
Вырезать коры корки на мелкие кусочки, 0.5-1 мм в длину.
Фильтр ES через фильтр 0,2 мкм прилагается к 5 мл шприца в 35 мм чашке Петри.
Передача корковой части ткани Петри содержащие фильтруется ES.
Инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин.

В то же время:

Очистка капот, Vibraslicer и рассекает инструментов.
Добавьте 5 мл теплой NBM/B27 в 60 мм чашке Петри.

Через 30 мин. инкубации:

Передача ткани до 10 мл DS. Давайте решать в течение 1 мин.
Передача ткани первую трубу Привет сучки и пусть решить в течение 2-3 мин.
Переезд на второй Привет. Повторите как указано выше.
Трансфер в первом Ли. Повторите как указано выше.
Переезд на втором Ли. Повторите как указано выше.
Передача третьей Ли. Повторите как указано выше.
Передача ткани 60 мм блюдо со СМИ.

Под микроскопом вскрытия:

Чистая мусора из ткани и растирают каждый кусочек, осторожно, проходящих через вытащил стекло пипетки (использование уменьшения диаметров отверстий), чтобы расслабить ткани.
Передача клеточной суспензии до 15 мл коническую трубку с остальными НБМ + B27 (Убедитесь в общей сложности 13 мл на 24-луночный планшет или 11 мл в течение 5 - 35. Блюда мм Осторожно перемешать и ждать большие куски ткани для урегулирования).
Передача клеточной суспензии (0,5 мл / лунку для 24-луночного планшета или 2 мл / 35 мм культуры блюдо).
При использовании стекла покровные, добавить 80 мкл суспензии клеток в покровное и позволит 1 час в культуре ткани инкубатор для клеток придерживаться до затопления камеры с более NBM/B27 СМИ.
Поддержание культур при 37 ° С и 5% СО _2.

Следующий день

24-луночный планшет: Feed каждую лунку по 0,5 мл не-нервных клеток условный NBM/B27 среды (cNBM/B27; протокол для подготовки cNBM/B27 среду приводится ниже)

35 блюд: Замените 0,5 мл с cNBM/B27 среды.

Поддерживать культуру заменив 0,5 мл свежей среды с cNBM/B27 каждые 2-3 дня.

Хотя питательные среды не способствует распространению глии клетки, культуры можно лечить с помощью 5 мкм FDU (5-фтор-2'-дезоксиуридина, Sigma F0503) на 3-5 дня в культуре в целях дальнейшего сокращения числа глиальных клеток в случае необходимости.

SET -UP для Разбор и культуры

Стерилизовать рассекает инструменты в 70% этанола или автоклаве них:

Ножницы (med. и маленький) Шпатели (med. и маленький)
Пинцет (med. и маленький) лезвие бритвы
Нож для ванны буфера vibraslicer
Малый клин металла для лезвия Поддержка мозга

Другие материалы:

Чашки Петри (60 мм)
Чашки Петри (35 мм)
Фильтровальная бумага
Стекло пипеткой 10 мл
Стерильные одноразовые пипец, 5,10 и 25 мл
Шприц фильтр, 0,2 мкм
Шприц 5 мл
Пробирки центрифужные, 15 мл
Стерильные Пастера стекла пипец
PDL покрытием блюда культуры или стекла покровные

Этикетка шесть 15 мл центрифужные пробирки и последующей подготовки:

Труба № 1: Фермент решение:

Добавить 50 U папаина (Уортингтон LS 03 126) до 5 мл DS, содержащий:

100 мкл L-цистеина (0,8 mg)
7 мкл 0,1 н NaOH
50 мкл APV (5мм)

Оставьте раствор при комнатной температуре, чтобы очистить. Обратите внимание, что фермент решение появится "облачно" на первый и потребности, чтобы очистить перед использованием.

Труба № 2 и № 3: Привет ингибитор фермента:

3 мл DS + 300 мкл BSA / Ti + 30 мкл APV (5 мм).

Осторожно перемешать, чтобы избежать пузырей, а затем разделите на две порции 1,5 мл.

Труба № 4 - № 6: Низкий ингибитор фермента:

8 мл DS + 80 мкл BSA / Ti + 80 мкл APV (5 мм).

Осторожно перемешать, чтобы избежать пузырей, делят на три 2,6 мл аликвоты.

Место труб номером # 2 до # 6 на льду. Оставьте трубку № 1 (раствор фермента) при комнатной температуре.

РЕШЕНИЯ И Аликвоты

Решение (солевой буфер) Sigma Формула вес 500 мл [конц.]
Хлорид натрия NaCl S-9625 58,45 80.0g 137 мм
Хлорид калия KCl P-4504 74,56 4,0 г 5,4 мм
Диаммоний фосфат натрия безводный Na ₂ HPO ₄ S-0876 142,0 0.24g 0.17mM
Калий фосфат безводный Монокальцийфосфат KH ₂ PO ₄ С-5379 136,09 0,3 г 0.22mM

Взвесьте все ингредиенты и перемешать до растворить в 400 мл ультра фильтрованной воды. Принесите конечный объем до 500 мл. Место в чистую бутылку и автоклав. Хранить при температуре 4 ° С и этикетка "DS решение".

Раствор В (Hepes) Sigma Формула вес 250 мл [конц.]
Hepes Hepes H-3375 283,3 9,9 20.97g

Добавить ультра-фильтрованной воды до 200 мл. Смешайте до полного растворения и довести до конечного объема 250 мл. Место в чистую бутылку и автоклав. Хранить при температуре 4 ° С и этикетка "DS Раствор В".

Рабочий раствор 500 мл [конц.]
Ультра фильтрованной воды 400 мл
Маточного раствора 25 мл
Маточного раствора B 14 мл
D (+)-Глюкоза Sigma G-8270 3,0 г 33.3mM
Сахароза Sigma S-0389 7,5 г 43,8 мМ

Отрегулируйте рН до 7,4 1н NaOH. Принесите конечный объем до 500 мл с ультра фильтрованной воды. Декантировать в чистую стеклянную бутылку и автоклав. Хранить при температуре 4 ° С. Этикетка "Пройдя решение".

Поли-D-лизин приготовления:

Подготовка 10x маточного раствора поли-D-лизина (PDL; Sigma P-7280) в стерильной H ₂ O в 1mg/ml.
Сделать 1,0 мл аликвоты. Этот раствор можно хранить при температуре -20 ° C до 3 месяцев.

МЕДИА

Добавить 10 мл B-27 Дополнение (Gibco 17504-044) к 500 мл НБМ бутылку (Neurobasal Средний, Gibco 21103-049).
Сделайте 40 мл аликвоты и хранить при 4 ° C.

APV

Добавьте 10 мл стерильной H ₂ O, чтобы флакон 10 мг APV (2-амино-5-phosphonopentanoic кислоты, Sigma-5282) и тщательно перемешать.
Подготовка 180 мкл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C.

BSA / Ti

Растворите 1 г BSA (бычьего альбумина. Сигма-7030) и 1 г ингибитора трипсина (Sigma Т-9253) в 10 мл DS.
Отрегулируйте рН до 7,4 1н NaOH.
Стерилизовать фильтрованием через фильтр 0,2 мкм шприц.
Разделить на 400 мкл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C.

L-цистеин

В пробирку Эппендорфа растворить 0,6 мг L-цистеин (Sigma C-7755) в 200 мкл DS.

Агар (4%)

Растворите 4 г Агар Бакто (Difco 0140-01) в 100 мл стерильной воды. Хранить при температуре 4 ° С до необходимого для культуры.
Микроволновая Агар, чтобы расплавить и заполнить 35 мм чашки Петри. Дайте остыть и полимеризации.

Папаин (Уортингтон LS 03126)

e_title "> НЕ-нейронов КУЛЬТУР В Nunc БУТЫЛОК КУЛЬТУРА

ПОКРЫТИЕ КУЛЬТУРА бутылки (4 Nunc бутылок)

Добавить 9 мл стерильной воды для каждого из 3 труб 10X PDL, чтобы сделать 1X PDL.
Передача 30 мл 1X PDL в первую бутылку.
Перемещение немного, пока все поверхности покрыты роста. Дайте настояться в течение 1 мин.
Передача 1x PDL на вторую бутылку. Дайте настояться в течение 1 мин.
Повторите с третьей и четвертой бутылки.
Тщательно промойте все четыре бутылки 2X 150 мл стерильного H ₂ O.

ПОДГОТОВЬТЕ раствора фермента (ES):

В 0,6 мл Вес трубки центрифуги из 0,8 мг L-цистеин (Sigma C7755), добавьте 150 мл DS и вихревые пока кристаллы растворились.
Передача 5 мл DS в 15 мл коническую трубку, затем добавить 150 мл L-цистеин.
Добавить 50 единиц папаин. (Уортингтон LS 03126)
Добавить 7 мл 0,1 N NaOH.

ПОДГОТОВЬТЕ MEM (GIBCO # 11090-081)

Удалить 65 мл из 500 мл бутылки MEM. Скидка 10 мл подготовить Глюкоза.
Добавьте 5 мл Pen / Strep (Gibco # 15070-063).
Добавьте 10 мл 1М Глюкоза (Sigma G-8270) (1,8 г / 10 мл MEM)
Добавьте 50 мл фетальной телячьей сыворотки (Gibco # 16140-071) или говядина телячьей сыворотки (Омега BC-04).
Тщательно перемешать, аликвоты и хранят при температуре 4 ° C.

NEUROBASAL ДОПОЛНЕНИЯ MEDIUM/B-27 (NBM/B27)
НБМ, 500 мл (Gibco # 21103-049), В-27 (50х), 10 мл (Gibco # 17504-044)

Добавить все содержание B-27 флакона с бутылкой НБМ и перемешать.
Алиготе и хранить при температуре 4 ° C.

Рассечение тканей головного мозга

Сухой рассекающих инструментов из 70% этанола до вскрытия.
Передача 10 мл DS в каждом из 3-15 мл трубки.
Выберите мышью щенков (P0 - P3), вам потребуется три мозги на 4 бутылки.
Добавить холодной DS до 35 мм блюдо Петри.
Обезглавьте мыши щенка и препарировать мозги.
Место мозги в чашке Петри содержащие холодной DS.
Чоп ткань на куски, достаточно малы, чтобы проходить через стеклянную пипетку.

Фермент ДИССОЦИАЦИЯ

Удалить столько DS как можно дальше от блюдо с пипетки Пастера.
Фильтр ES через фильтр 0,2 мкм и 5cc шприц.
Место ЧС на блюдо с ткани.
Инкубируйте ткани при температуре 37 ° C инкубатора (CO _{2 бесплатных)} в течение 30 мин.

СТИРАЛЬНЫЕ ТКАНИ

Передача ткани со стеклянной пипетки в первую трубу DS, убедившись, чтобы получить так мало ES насколько это возможно.
Центрифуга в течение 30 сек при 1500 оборотах в минуту.
Передача ткани и повторите процедуру еще два раза.

Растирание

Место 38 мл MEM / FBS в 50 мл центрифужную пробирку
Добавьте 3 мл MEM / FBS на 35 мм блюдо и передачи ткани этой чашке Петри.
Диссоциируют ткани, слегка растирая его через 1000μl кончиком пипетки Eppendorf.
Передача клеточную суспензию в пробирку 38ml из MEM / FBS и хорошо перемешать.

ПОКРЫТИЯ

Стенд культуры бутылки вертикальном положении, чтобы получить равное количество суспензии клеток и средств массовой информации в каждой бутылке.
Положите 90 мл MEM / FBS в каждой культуре бутылку.
Добавьте 10 мл клеточной суспензии в каждую бутылку.
Лейбл: Non-нейронов, инициалы и дату. Инкубировать при 37 ° С и 5% СО _2.

КОРМЛЕНИЕ

В День 3 или 4, корма клетки с теплой MEM / FBS (сцеживать все средства массовой информации и заменить его на 100 мл MEM / FBS). Культуры могут принять 7-10 дней, чтобы стать вырожденная.
В День 7-10 изменение средств массовой информации для NBM/B27.
На следующий день, собирать средства массовой информации. Фильтр с 0.22μm
Сделать аликвоты 40 мл и кормовых культуры с MEM / FBS.
Следующие 2 или 3 дня, изменение средств массовой информации для NBM/B27
На следующий день, собирать и повторите процедуру.
Имейте сбор средств массовой информации в течение ок. 2 недели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Potassim Chloride	Sigma-Aldrich	P4504
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	S0876
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Neurobasal Media (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid	Sigma-Aldrich	A5282
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papain	Worthington Biochemical	LS 03126
Sterile 0.2 μm Syringe Filter	Fisher Scientific	DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11090-081	with Earle’s saltswithout L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063	for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-071	needed for non-neuronal cultures
Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle	Fisher Scientific	12-565-25	Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom "Imaging dishes"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Glass bottomed, 35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!