Summary
O objetivo do presente protocolo é descrever como usar o microirradiation do laser para induzir diferentes tipos de danos no DNA, incluindo relativamente simples quebras e danos complexos, para estudar o DNA danos reparação e sinalização fator montagem em locais de dano in vivo .
Abstract
Danos ao DNA induz respostas específicas de sinalização e reparação na célula, que é crítico para a proteção da integridade do genoma. Microirradiation do laser tornou-se uma valiosa ferramenta experimental para investigar o DNA danos resposta (DDR) na vivo. Permite análise de célula única de alta resolução em tempo real da dinâmica macromolecular em resposta ao dano induzida por laser, confinado a uma região de submicrometer no núcleo celular. No entanto, várias condições do laser têm sido utilizadas sem apreciação das diferenças nos tipos de danos induzidos. Como resultado, a natureza do dano é muitas vezes não bem caracterizado ou controlada, causando inconsistências aparentes nos perfis de recrutamento ou modificação. Temos demonstrado que as condições de irradiação diferentes (ou seja, diferentes comprimentos de onda bem como diferentes poderes de entrada (radiâncias) do laser femtosecond (fs) infravermelho próximo (NIR)) induziram assemblies distintos DDR e reparação de proteína. Isto reflete o tipo de dano do ADN produzido. Este protocolo descreve como titulação da potência do laser permite a indução de diferentes quantidades e complexidades de dano do ADN, que pode ser facilmente controlado por detecção de danos de base e reticulação, diferencial poli (ADP-ribose) (PAR), sinalização, e reparação de percurso específico fator módulos (assemblies) em locais de dano. Uma vez que as condições de danos são determinadas, é possível investigar os efeitos de dano diferente complexidade e sinalização diferencial danos, bem como depleção do feitor montante em qualquer fator de interesse.
Introduction
Na Vivo Sinalização de dano do ADN não é bem compreendido.
In vivo, o DNA é complexed com histonas e outros fatores para fibras de cromatina de forma. Regulamento da estrutura da cromatina é de suma importância para o metabolismo do DNA. Por exemplo, a variante de histona H2AX é fosforilada por ataxia-telangiectasia mutado (ATM) e outras cinases seguintes da dobro-Costa quebra indução (DSB) e é importante para a amplificação de sinal DSB danos, bem como fornecendo um site encaixe para outro fatores. Propagação de escolha de caminho de sinalização e reparação de danos aparecem criticamente ser influenciada pela estrutura da cromatina local em danos locais1. Um número de cromatina remodelação fatores acompanhantes de histona e histona modificando as enzimas na verdade são recrutados para danificar sites e são importante para o reparo de DNA eficiente, destacando a importância do Regulamento de cromatina no DDR e reparar2 , 3 , 4. Além disso, site de danos de cluster ou reposicionamento foi observada em levedura e drosófila5,6,7,8, uma reminiscência do relocalization dos loci de gene na compartimento de fracoes associado gene Regulamento9,10. Estudos recentes no rato e células humanas também revelaram a mobilização dos sites DSB, que influências reparar fidelidade e caminho escolha11,12. Isto levanta a possibilidade que DDR/reparação pode também ser intimamente ligada à arquitetura nuclear, organização de ordem superior da cromatina e cromossomo dinâmica no núcleo celular. Assim, é fundamental para desenvolver métodos de alta resolução para estudar DDR e processos no contexto do ambiente endógeno nuclear em uma célula viva de reparação a fim de compreender as consequências de curto e longo prazo de dano do ADN.
Papel crítico de PAR polimerase (PARP) para medir a extensão e o tipo de dano e regulamenta o Assembly de proteína no local do dano
PARP1 é um sensor de ADN nick rapidamente ativado por dano do ADN que desempenha um papel crítico no reparo de ADN13. PARP1 foi pensado originalmente para funcionar em conjunto com o x-ray reparação Cruz complementando 1 (XRCC1) para facilitar o reparo de excisão de base (BER), mas estudos recentes revelam seu papel em outras vias de reparo do DNA, incluindo ORL reparação14. Ativado PARP1 usos nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) como um substrato para ADP-ribosylate várias proteínas alvo, incluindo ele mesmo. Esta enzima e outros membros da família têm atraído muita atenção nos últimos anos como inibidores da PARP surgiram drogas terapêuticas tão promissoras para cancros. Embora inibidores da PARP inicialmente foram encontrados para ser eficaz no gene do cancro da mama (BRCA)-uma mutação de células de câncer de mama, existe agora uma pletora de evidências para seus efeitos em terapias de combinação e mono - juntamente com DNA prejudicial agentes/irradiação contra um amplo espectro de cancros com mutações, que não se limitando a BRCA15,16,17,18,19,20.
A nível molecular, ativação de PARP mostrou desempenham um papel crítico na organização da estrutura da cromatina local em sites de danos. Recrutamento de PAR-dependente de enzimas de modificação de cromatina facilita a reparação de ORL e ditames reparar escolhas de caminho, sugerindo o papel de andaimes importantes de modificação do PAR em locais de dano. 13,21,22,23,24,25,26,,27,28,29, 30,31 recentemente Demonstramos a exclusão da proteína p53-1 (53BP1) de dano sites por PAR 32, fornecendo uma explicação alternativa para dependentes de 53BP1 hyperactivation de endjoining não-homóloga ( NHEJ) por PARP inibidor e destacando a importância do PARP em ORL reparação via escolha33,34. PARP1 também diretamente PARylates e afeta a atividade da DNA vários reparos fatores14.
Usando o Laser Microirradiation como uma ferramenta para estudar a DDR/reparação na Vivo
Microirradiation do laser para produzir alterações sub mícron em cromossomos individuais foi primeiro descrita em 196935 e revisado em detalhes em 198136. Várias décadas mais tarde, microirradiation do laser foi mostrado para induzir dano de DNA em uma região submicrometer definido no núcleo celular e foi provado para ser uma técnica valiosa para o estudo de recrutamento ou modificações de vários fatores de lesões do ADN em vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. este método permite a detecção desses factores que não formam distintos focos induzida por irradiação (IRIF) em danos sites39,42. Também é possível examinar a spatiotemporal dinâmica de alterações estruturais da cromatina em sítios de dano e no resto do núcleo. Comparamos com cuidado os DDRs induzidas por sistemas diferentes de laser e poderes para avaliar a relação entre o tipo de dano do ADN e o microirradiation condições32,,43,44, de entrada 45. Os padrões de recrutamento aberrante de 53BP1 e oligospermia repetir fator obrigatório 2 (TRF2) foram observados nos estudos anteriores de dano do laser, que forneceram a base para a recorrente preocupação com a natureza "não-fisiológica" de dano induzido por laser46 ,,47,,48,49. Nós achamos que estas aparentes discrepâncias agora poderiam ser explicadas pelo diferencial PARP sinalizando que mede a quantidade e a complexidade do dano induzido32. Nós confirmamos que: 1) do laser-microirradiated células (mesmo após irradiação de entrada-potência alta) são presos em interfase, de uma forma de controle-dependente de ponto de verificação de danos e permanecem viáveis (pelo menos até 48 h)32,,50; e 2) reparação fator recrutamento/modificações fielmente recapitular aqueles observados com tratamento com agentes prejudiciais de DNA convencionais e indução de ORL por endonucleases32,39,42, 44,50,,51,52. Estes resultados suportam fortemente a relevância fisiológica de estudar a resposta celular induzida por danos de laser.
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Protocol
1. preparação da pilha básicos
Nota: Este passo é para a deteção de imunofluorescência padrão de recrutamento da proteína endógena ou modificação e para o uso de uma linha de celular estàvel expressar uma proteína recombinante fluorescente etiquetada. Por exemplo, células epiteliais de marsupial rim de Potorustridactylus (PtK2) expressando estàvel EGFP-53BP11220-1711 ou YFP-TRF2 foram usados na nossa anterior estudam (Figura 1)32. No primeiro caso, o foco, formando a região de 53BP1 (ácido aminado 1220-1711), que contém o domínio oligomerização, o domínio de Tudor e o motivo de recrutamento ubiquitylation-dependente (UDR), foi fundido ao GFP reforçada (EGFP-53BP11220-1711). Esta proteína de fusão recapitula o recrutamento local de dano do longa-metragem 53BP153,54,55. Em células HeLa, fluorescente etiquetadas subunidades de cohesin (por exemplo, hSMC1-GFP51, GFP-Scc1 (Rad21)52e GFP-SA2 51) devem ser estàvel expressa para assegurar eficiente incorporação do complexo e para recapitular o S/G2 ciclo celular danos específicos da fase site recrutamento do endógena cohesin51.
-
Propagar qualquer tipo de célula aderente para um prato de cultura de tecidos de 35mm com uma lamela em grade para permitir a identificação da célula individual. Ajuste o número de células iniciais para alcançar a confluência de 60% em 36-48 h com base na taxa de proliferação da linha celular particular. Por exemplo:
- Para PtK2 de células epiteliais renais marsupial (tipo selvagem ou aqueles estàvel expressando EGFP-53BP11220-1711 ou TRF2-YFP):4 células em 2 mL de placa 2.0 x 10 Advanced mínimo essencial médio (MEM) suplementado com 2 mM L-glutamina, 4% fetal bovino soro (FBS) e antibióticos (100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de µ g/mL) e incubar a 37 ° C, com 7% de CO2.
- Para HeLa, células com estàvel expressando fluorescente etiquetado proteínas recombinantes GFP-SA2: semente 1.0 x 105 células em 2 mL médio (DMEM modificado águia de Dulbecco) suplementado com 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 µ g/mL, e incubar a 37 ° C com 5% de CO2. Outras células HeLa também podem ser utilizadas inclusive nas células não modificadas ou expressando GFP-hSMC1.
- Permitir que as células para aderir e proliferar para 36-48 h antes da indução de dano do ADN na confluência de 30-60% (para permitir a visualização do número grade). Prossiga para a secção 4.
2. transiente Transfection
Nota: Às vezes boas anticorpos não estão disponíveis para detectar as proteínas endógenas. Se linha celular estàvel expressam proteínas marcador não estiverem disponível, realize transfections transitórias para monitorar proteínas fluorescente etiquetadas para análise de células vivas.
- Para as células HeLa, no dia 1, sementes de 6-8 x 104 células em meios de cultura 0,5 mL em um poço de uma placa de 24 e incubar um 100% umidificado incubadora a 37 ° C e com 5% de CO2. Consulte a etapa 1.1 para condições de meios de cultura.
- Dia 2, uso um plasmídeo de expressão mamíferos codificação um DNA fluorescente etiquetado reparar fator (por exemplo, GFP-NTH1 ou GFP-OGG1 para dano base32,44,56, GFP-Ku para alta dose DSBs57, GFP-53BP1 32 DSBs relativamente simples, ou outras proteínas de interesse fundido a tag fluorescente) para executar a transfeccao de DNA mediada por lipossomas. Dilua 0,3 µ g plasmídeo em 25 µ l de soro livre de meios de cultura em um tubo de 1,5 mL.
- Em outro tubo de 1,5 mL, diluir 1 µ l com base em lipossomas DNA reagente de transfeccao em 25 µ l de soro livre de meios de cultura e misture delicadamente.
- Misture o agente diluído de DNA e transfecção suavemente e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT) para formar complexos lipídios-DNA.
- Enxágue as células com 0,5 mL de meio de cultura, uma vez, remova a mídia e adicionar 0,5 mL meio de cultura fresco para as células (etapa 1.1).
- Adicione os complexos lipídios-DNA para as células. Misture suavemente agite a placa algumas vezes. Colocar as células de volta na incubadora como no passo 2.1.
- Após 4-6 h, remova a mídia de cultura de células e adicionar 300 µ l 0,05% Trypsin-EDTA. Removê-lo, adicionar 200 µ l do Trypsin-EDTA e incubar a incubadora de 37 ° C por 3-4 min.
- Após a confirmação de que as células são desanexadas, adicionar 800 µ l cultura mídia e ressuspender as células pipetando suavemente para separar as touceiras de célula. Transferir a suspensão de células para um prato de cultura de 35mm com uma lamela quadriculado e adicionar meios de cultura até um volume final de 2ml.
- Incubar as células na incubadora como no passo 2.1 por 48 h e, em seguida, prossiga para a secção 4.
Nota: Se a expressão da proteína recombinante é tóxica (células transfectadas mostram morfologia redonda ou irregular após incubação na etapa 2.8), encurtar o tempo de expressão e executar do laser microirradiation (secção 4) 16-20 h após a transfeccao contanto que o expressão da proteína pode ser confirmado (para a deteção de fluorescência, consulte a etapa 4.3). Neste caso, realize a transfeccao diretamente no prato 35 mm. Semente de 3,0 x 105 HeLa células em um prato de 35mm com uma lamela em grade para atingir aproximadamente 50-70% confluência após plasmídeos de DNA Transfect 30 h. e alterar a mídia 2-6 h depois do transfection. Proceder com laser microirradiation 12-20 h mais tarde, se a expressão da proteína é razoável e células aparecem saudáveis.
3. o ciclo celular de sincronização
Nota: Para o reparo para recombination homologous proteínas (HR), tais como a Rad51 e cohesin, o recrutamento é mais proeminente em fase S/G2 do ciclo celular, na qual HR reparação assume lugar51. Assim, para monitorar o recrutamento destas proteínas, sincronização de célula para a fase S/G2 é necessária.
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Sincronização de fase S/G2
- Use o protocolo de bloco de timidina duplo para sincronização de célula para S/G2 fase50,51. Após a semeadura as células em um prato de lamela quadriculada de 35mm (consulte a etapa 1.1), Incube as celulas com timidina (para obter uma concentração final de 2,5 mM) em meios de cultura (etapa 1.1) para 17 h a 37 ° C e com 5% de CO2.
- Enxagúe as células com 1 mL meio de cultura livre de timidina (etapa 1.1) duas vezes e incube as celulas em meios de cultura 2ml timidina-livre para 9 h como no passo 1.1.
- Adicione 200 µ l de solução-mãe de timidina 27,5 milímetros (dissolvida em meios de cultura) para os meios de cultura com as células para uma concentração final de timidina 2,5 mM. Incube as celulas como na etapa 3.1.1 para outro 15 h. enxaguar e incube as celulas em meios de cultura livre de timidina por 4-6 h e induzir a danos no DNA (secção 4).
- Confirmar a eficiência de sincronização usando marcadores do ciclo celular (Cyclin A2 e B1 para S/G2 e G2, respectivamente), S/G2 fase DNA danos reparação fatores específicos (por exemplo, Rad51 ou cohesin), ou por IdU/EdU incorporação (para células em fase S)51.
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Sincronização de fase G1
- Sementes de 6-8 x 104 células de HeLa em um prato de cultura de 35 milímetros com lamela quadriculado (passo 2.1).
- Depois de 2 dias, identifica células em metafase, que são ligeiramente levantada e redondas, sob um microscópio invertido usando o objectivo de X 10 e 10 X ocular as lentes. Adquira imagens para gravar a posição das células em metafase na lamela em grade.
- Após 3-4 h, confirmar a divisão da célula em duas células filhas (na fase G1) e induzir a danos no DNA (secção 4).
4. titulação de Laser de potência de entrada
Nota: No presente protocolo, podemos induzir dano de DNA usando um 780 nm pulsado sistema de laser NIR fs anexado a um microscópio confocal, ou 800 nm pulsado laser NIR de fs acoplado a um microscópio de fluorescência-epi invertido. Embora a potência de entrada (irradiância efectiva no ponto focal do laser na amostra) necessária para induzir DDR comparável é diferente nestes sistemas, o princípio básico da titulação de potência de entrada é aplicável a ambos, ou nenhum, NIR sistemas32,57 . A energia em situ por irradiação de pulso e pico do laser no ponto focal para os sistemas duas laser estavam no intervalo de 5.33 × 10-2-4 × 10-1 nJ e 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2, respectivamente,32.
- Ligue o laser NIR e permitir que o sistema de laser para aquecimento por 1h antes da utilização.
- Coloque um prato de células num palco aquecida (37 ° C) em uma câmara que permite CO2 (5%) e controle de umidade (100%).
Nota: Se uma câmara de2 CO não estiver disponível, use CO2-meios de cultura independente para até 5-6 h. Se não houver uma fase de aquecimento, manter as células sob o microscópio para < 20 min e substitua imediatamente para a incubadora de cultura de tecidos com controle de umidade, temperatura adequada e CO2. Estas condições de cultura podem variar dependendo do tipo de célula específica utilizado bem como o organismo de derivação (por exemplo, mamíferos e anfíbios). - Para análise de células vivas de proteínas fluorescente etiquetadas, selecione um filtro GFP (450-490 nm de excitação, emissão de 515-586 nm) ou Cy3 (540-552 nm de excitação, emissão de > 590 nm) para GFP ou proteína mCherry-fundido, respectivamente, usando uma 100 X ou imersão de óleo X 63 objetivo.
- Busca de células que possuem sinais de fluorescência comparáveis, refletindo a níveis comparáveis de expressão da proteína. Evite as células com expressão demasiado forte ou demasiado fraca para reduzir a variabilidade de célula para célula em medidas de fluorescência.
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Titula-se a potência de entrada do laser.
- 780 nm NIR do laser anexado a um microscópio confocal
- Use a função de lixívia de software para atingir faixas lineares dentro do núcleo celular para a exposição de varreduras de laser único (resolução 512 x 512 pixels, zoom X1, descorado região 4 x 50 pixels, tempo de permanência de pixel de 12,8 µs, iteração x1) com o objectivo de óleo (100 X / 1,3 at).
- Ajuste a porcentagem de transmissão do laser (usando o software/hardware embutido no sistema de microscópio a laser pelo fabricante) a 5% sem alterar outras configurações.
- Coloque um celular no centro do campo. Clique em região de ferramenta de interesse (ROI) e desenhar uma linha ou caixa (aproximadamente 50 x 4 pixels) no núcleo usando o mouse e clique no botão de "Bleach" para induzir dano do ADN.
Observação: Em etapas subsequentes de irradiação, "branqueamento" deve ser aumentado em incrementos de 5% a 40% ou até 100%, se necessário. - laser NIR 800 nm anexado ao microscópio de fluorescência-epi
- Controlar a entrada de alimentação através de um (63 X / 1.4 at) objectivo de imersão de óleo de contraste de fase por rotação motorizada de um filtro de polarização introduzido no caminho do feixe e montado em um palco de rotacional motorizado controlado por computador32,39 , 58.
- Ajustar o ângulo do polarizador (°) e medir a potência de entrada (mW) inserindo o microscópio, usando um medidor de energia do laser. Determine os ângulos de polarizador que fornecem poderes de entrada que variam de 20 mW-155 mW em incrementos de 5-10 mW.
- Defina o ângulo de polarizador que corresponde a 20 mW de potência de entrada.
Nota: Para o nosso sistema de laser, se o ângulo de polarizador é 40 °, o poder de entrada é 65 mW. Aumente a potência de entrada, com incrementos de 5-10 mW.
- 780 nm NIR do laser anexado a um microscópio confocal
- Para análise de células vivas, vá para as etapas 6.1 e 6.3. Para a deteção de imunofluorescência das proteínas endógenas ou modificações proceda à seção 5. Após a análise, vá para a etapa 4.7 para titulação mais do poder do laser. Para analisar o requisito de fator upstream, ir para a seção 7.
Nota: Recrutamento de fatores BER e NHEJ é rápida (dentro de alguns minutos) e transiente (< ~ h 30 min - 1 dependendo do fator e < ~ 4 h post danificar indução, respectivamente). Em contraste, o recrutamento dos fatores HR Rad51 e cohesin é detectável em ~ 30 min - 1 h e tendem a persistir mais de 8 h em DNA não reparados lesões44,50,51. Assim, é necessário examinar pontos pós irradiação para reparação de diferentes fatores de tempo diferente. - Aumentar a potência de entrada por incrementos desejados (ou seja, 5% para 780 laser NIR e 5-10 mW para 800 NIR) como na etapa 4.4 e repita os passos 4,5-4,7 em um novo conjunto de células para determinar o limiar (50% do recrutamento de mostrar células danificadas) e pico (100% de células show recrutamento) para cada proteína.
5. mancha da imunofluorescência
Nota: para a deteção de modificação covalente de proteínas, tais como o PAR (marcador de dano complexa) e a fosforilação de H2AX (γH2AX) (marcador DSB), bem como de dímero de pirimidina ciclobutano (CPD)/(6-4) photoproducts (6-4PP) e 8-oxoguanine (8-oxoG) (reticulação e base de marcadores de dano, respectivamente), células devem ser fixadas e coradas com anticorpos específicos. Além disso, é melhor confirmar os resultados obtidos com as proteínas recombinantes fluorescente etiquetadas pela pesquisa de anticorpos das proteínas endógenas, distinguir artefatos induzidos pela superexpressão de proteínas recombinantes de fusão.
- Corrigir células em pontos diferentes de tempo após a indução de danos (etapa 4.5) dependendo dos fatores, substituindo os meios de cultura (consulte a etapa 1.1) com 1,5 mL de paraformaldeído 4% / 1 X PBS durante 10 minutos a RT
Cuidado: Paraformaldehyde vapores são tóxicos e todo o trabalho deve ser feito em uma coifa ventilada. - Remover 4% paraformaldeído/PBS e adicione 1 mL de detergente/PBS de 0,5% por 10 min no RT
- Remover células de detergente/PBS e enxágue de 0,5% com 2 mL de PBS durante 5 min, duas vezes e incube as células em 2 mL de solução de bloqueio (soro de vitelo de 10%, 1% BSA/PBS) por 1h no RT
- Remover a solução de bloqueio e adicionar 2 mL de PBS para células e substituir PBS com solução de anticorpo primário 250 µ l de 3% BSA/PBS durante a noite a 4 ° C ou 1 h no RT. Use um 1: 200-diluição 1: 500 (concentração típica de aproximadamente 1 µ g/mL, empiricamente determinada) para detecção de anticorpos específicas para diferentes marcadores de dano de DNA (por exemplo, γH2AX/53BP1 (DSB); Ku (ORL, NHEJ); RAD51/cohesin (ORL, HR); CPD/6-4PP (reticulação dano); 8-oxoG/DNA (por exemplo, NTH1) glycosylases (base de dano); PAR (danos complexos de alta dose)).
- Remover a solução de anticorpo e enxagúe com 2 mL de PBS durante 5 min duas vezes, remover PBS e incubar com 250 µ l 0,1% anticorpo secundário em 3% BSA/PBS por 1h no escuro no RT
- Remover a solução de anticorpo secundário e adicionar 2 mL de PBS durante 5 min duas vezes e manter as células em 1,5-2 mL de solução Isotónica a 4 ° C para a imagem latente em etapas 6.1 e 6.2.
6. análise de fluorescência quantitativo de Immunostained ou células vivas
- Capturar imagens de células coradas ou ao vivo (n > 10) usando o microscópio utilizado para irradiação. Para o sistema de microscópio de fluorescência-epi, usar a resolução de 1.344 x 1.024 pixels e salvar imagens como arquivos TIFF de 16 bits. Para um microscópio confocal, use 1 ampliação de X; Laser de argônio para GFP/FITC, aqui vai 594 laser para Cy3/mCherry; 512 x 512 ou 1.024 x 1.024 pixels de resolução de imagem; 5, número de velocidade de digitalização: 1 para verificação rápida ou 2 + para uma média ao longo de várias digitalizações para melhorar o sinal à relação de ruído.
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Use uma análise de imagem, programas projetados para medir a intensidade do pixel.
- Use a ferramenta de retângulo de Volume para desenhar um ROI em torno do local do dano à imagem de célula individual. Use o mesmo tamanho ROI para medir o sinal de fluorescência de fundo no nucleoplasma adjacente, mas não se sobrepõem com os sites de danos. Isto é importante para a normalização de fotobranqueamento associado ao sistema de microscópio confocal-não.
- Para medir sinais de fluorescência usando o programa de análise de imagem, clique em "Relatório de análise de Volume" encontrado em caixa de ferramentas. Uma nova janela aparecerá. Sob a seção "Dados para exibição", marque somente o "Nome" e "Densidade". Clique em "Concluído" para visualizar as medições.
- Exporte os valores para um programa de planilha, clicando no ícone de tabela, encontrado na parte inferior da janela do relatório de Volume e selecionadas "abas (formato de excel)" para "Arquivo" e separadores de campo para exportar destino.
- Para obter sinais relativos, use o programa de planilha para dividir a intensidade de fluorescência no local do dano (coluna 1) por que no controle de fundo (coluna 2) na região do nucleoplasma e subtrair 1 para normalização.
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Análise de tempo-curso de fluorescência quantitativo em tempo real usando o microscópio confocal
- Identifica fluorescente etiquetadas proteína-positivo células usando o microscópio como no passo 4.3.
- Realize imagens de fluorescência de lapso de tempo antes de dano e nos pontos de tempo diferente após a indução de danos na secção 4. Primeiro desenhe a lixívia ROI (para indução de dano), em seguida, selecione o "Acquire > série temporal" submenu, defina "Número" como 20 e o "ciclo de atraso" como 30 s, escolher "branquear uma vez após a primeira varredura" e clique em "Iniciar B". Neste caso, a primeira imagem é adquirida imediatamente antes da indução de danos, seguida por 19 aquisições de imagem em um intervalo de 30 s. Intervalos ("atraso de ciclo") podem ser alterados dependendo da finalidade do estudo.
- Concluído o aquisição de imagem, clique em "Quer dizer" e desenhar o ROI na região de danos. Clique em "Show Table" para obter uma tabela que lista a intensidade dentro do ROIs selecionado. Normalizar os dados dividindo-se a intensidade da fluorescência do site da dano em pontos diferentes do tempo pela intensidade da região mesma antes de danos e subtrair por 1.
7. pequenos parasitas RNA (siRNA) Transfection
Nota: O esgotamento da proteína alvo é uma maneira eficaz de delinear a exigência do montante fator para o recrutamento de proteína observada danificar sites (secção 4). Além disso, a estratégia é a melhor maneira de abordar a especificidade de um anticorpo usado para detecção de imunofluorescência (ver secção 5).
- Dia 1: Preparar 2 poços de uma placa de 24 células HeLa semeando 6-8 x 104 células de HeLa em meios de cultura 0,5 mL em cada poço, um para transfeccao siRNA de controle e um para PARP1 siRNA (5'-CCG AGA AAT CTC TTA CCT CAA-3').
- Dia 2: Confirme que as células são aproximadamente 40-50% de Confluencia. Realizar a primeira rodada de transfeccao siRNA: diluir 5 pmol siRNA em 25 µ l de soro livre de meios de cultura, adicionar 3 lipídios µ l baseado reagente de Transfeccao para dentro do tubo, misture delicadamente e incubar durante 5-10 min a RT
- Enxagúe as células com meio de cultura fresco 0,5 mL de uma vez e manter as células em meio de cultura fresco de 0,5 mL (consulte a etapa 1.1).
- Adicionar os complexos RNA-lipídica para as células e misture delicadamente inclinando o prato e para trás. Colocar as células de volta na incubadora como no passo 2.1.
- Aspirar a mistura de transfeccao e adicionar 0,5 mL meio de cultura fresco (etapa 1.1) após 6 h.
- Dia 3: Realize a segunda rodada de siRNA transfections (consulte a etapa 7.2). Em seguida, as sementes 60-100% das células em um prato de lamela quadriculada de 35mm conforme descrito na etapa 2.3.
- Dia 5: Prosseguir com laser microirradiation usando a condição de poder do laser ideal para recrutamento máximo do fator de interesse, conforme determinado pela seção 4. Normalmente, esgotamento eficiente pode ser observado em cerca de 60-90% das células HeLa.
Nota: Como alternativa e complementar abordagem, inibidores, se disponível, pode ser usada para inibir a função do fator de interesse32,44. Para analisar o efeito da inibição da sinalização DDR, adicionar inibidor PARP 20 µM, 1 µM PAR glycohydrolase (PARG) inibidor ou 10 µM DNA-dependente proteína quinase com inibidor da subunidade catalítica (DNA-PKcs) e inibidor de ATM 10 µM em dimetilsulfóxido (DMSO) para o pratos 1 h antes da indução de danos. Adicione DMSO apenas às células de controle.
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Representative Results
Usando células PtK2 estàvel expressando EGFP-53BP11220-1711 ou TRF2-YFP, titulação de entrada de alimentação do laser foi realizada para determinar a condição ideal para o seu recrutamento (Figura 1)32.
Em locais de dano do laser de potência entrada alta, o agrupamento significativo de CPD (dano de reticulação normalmente gerado pelo dano de ultravioleta (UV)) bem como GFP-NTH1 DNA glycosylase que especificamente reconhece dano base foram observados. Além disso, foram observados sinais XRCC1 e CtIP maiores, refletindo o aumento do número de quebras e demonstrando que o complexo dano do ADN é induzido sob esta condição (Figura 2A). Outros glycosylases de DNA fundidos para proteínas fluorescentes (por exemplo, endonuclease GFP-nei VIII-como 2 (NEIL2) e GFP-8-Oxoguanine glycosylase (OGG1)) bem como nà eu também pode ser usado como marcadores de dano base44,59. Consistente com isso, achamos que a resposta do PAR é induzida significativamente por laser de potência entrada alta (ou seja, energia e irradiância no ponto focal na amostra), mas apenas fracamente pelo poder do laser de baixa no ponto focal (Figura 2B, canto superior esquerdo). POR sinais, mas não PARP1 a localização da proteína, em locais de danos foram sensíveis para o inibidor PARP (dados não mostrados). Além disso, siRNA específica para PARP1 diminuído tanto PAR e PARP1 em sites de danos (Figura 2B, canto superior direito)32. Sob a condição de alta potência de entrada, γH2AX aparece inicialmente no sites danos e rapidamente se espalha para o núcleo inteiro em um ATM/DNA-PK-dependente (Figura 2B, inferior). Semelhante propagação de ATM/DNA-PK-dependente de γH2AX foi relatado por γ-irradiação60. Obtiveram-se resultados consistentes com 800 e 780 nm NIR laser sistemas32. Tomados em conjunto, os resultados revelam que é possível dosear a potência do laser (e, portanto, energia e irradiância no ponto focal na célula) para encontrar as condições que induzem a diferentes graus de resposta PARP, correlacionando com o número de DSBs e o complexidade dos danos do DNA.
Os resultados acima, inicialmente, sugeriu que a presença de danos no DNA complexo pode ter causado o recrutamento diferencial de 53BP1 e TRF2. Curiosamente, no entanto, o recrutamento de1220-1711 53BP1 para um site de baixa potência dano foi efetivamente inibido pela presença do segundo site dano induzido por alta--poder de entrada no mesmo núcleo celular (Figura 3A , em contraste com Figura 3B ). Os resultados indicam que o dano de laser de alta potência entrada suprime 53BP1 recrutamento em trans. Inibição do PAR pelo inibidor PARP, bem como a inibição da γH2AX nuclear toda a espalhar-se por restauração de inibidores de ATM/DNA-PK este recrutamento até mesmo para o site de danos de alta potência de entrada (Figura 3A). Isto é diferente do recrutamento de mediador de DNA danos Checkpoint 1 (MDC1) para sites de dano, que primariamente foi inibida por dispersão de γH2AX e, portanto, foi restaurado por inibidores de ATM/DNA-PK, não inibidor de PARP (Figura 3A, inferior). Importante, hyperactivation do PAR por inibição PARG (sem afetar o status de γH2AX) efetivamente suprimido o recrutamento inicial 53BP1 mesmo em sites de baixo dano de entrada-poder que normalmente recrutar 53BP1 eficientemente (Figura 3B)32. Tomados em conjunto, esses resultados indicam aquele PAR de sinalização e não o tipo de dano por si, interfere com o recrutamento de 53BP132. Este é um exemplo da versatilidade do microirradiation do laser, que permite-nos examinar como vários sites de danos influenciam e interagirem uns com os outros.
Figura 1 : Titulação de laser de potência de entrada. Para determinar a potência do laser a ser usado para futuros experimentos, PtK2 células expressando estàvel EGFP-53BP1 e TRF2-YFP foram submetidas a laser microirradiation com poderes de entrada que variam entre 20 mW e 155 mW utilizando a 800 nm NIR do laser/invertido epi-fluorescência sistema de microscópio. EGFP-53BP1 recrutamento foi monitorado por 15 min pós irradiação (p.i.), enquanto as células TRF2-YFP foram seguidas por 6min p.i. Os números acima das barras representam o número de células que se mostrou positivo recrutamento de EGFP-53BP1 ou TRF2-YFP para os sites de danos sobre o número total de células testadas. Esta figura foi modificada de Saquilabon Cruz32. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Indução de danos complexo e robusto DDR sinalização por laser de potência entrada alto. (A) High-entrada-poder do laser microirradiation induz danos complexos, incluindo quebras (SSBs e DSBs), reticulação e dano base. CPD, XRCC1 (SSB e DSB reparar), NTH1 DNA glycosylase (BER) e CtIP (alternativa NHEJ e HR) são mostrados (apenas GFP-NTH1 é uma imagem de célula viva e o resto são observados após a mancha da imunofluorescência). Medições de intensidade de fluorescência quantitativa do recrutamento local danos foram feitas como indicado no protocolo secção 7 e constam os boxplots. O número total de células (n) testado pode ser visto sob cada proteína quantificada. p-valor < 0,05. (B) em cima (à esquerda): PAR robusto e PARP1 sinais em locais de dano alto poder de entrada. Superior (direito): depleção de siRNA PARP1 é suficiente para abolir o PAR sinal32,44. Fundo: Curso de análise de tempo de γH2AX em células com alto (baixo) e baixo (em cima) entrada danos poder conforme indicado. Barras de escala = 10 µm. Esta figura foi modificada de Saquilabon Cruz32. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Ativação diferencial de sinalização DDR afeta 53BP1 recrutamento para danificar sites. Parte superior (A): PtK2 células estàvel expressando EGFP-53BP11220-1711 foram microirradiated com baixa (15%) e alta (25%) potência de entrada (branco e amarelo pontas de seta, respectivamente) no mesmo núcleo usando o sistema de microscópio confocal/NIR nm 780. Esta foi realizada na presença de DMSO, PARP inibidor (Pi), ou a combinação de ATM, DNA-PK e inibidores da PARP (Ai + Di + Pi), conforme indicado. Imagem latente da viver-pilha de EGFP-53BP11220-1711 foi capturado em 30 min após a indução de ORL. As células foram então fixo e manchadas com um anticorpo específicas para γH2AX como um marcador de ORL. Alterações da intensidade de fluorescência da EGFP-53BP11220-1711 em locais de dano são mostradas à direita com p-valores (valores são: DMSO, ± 0,03 0,02; PI, 0,34 ± 0,19; Ai + Di + Pi, 0,98 ± 0.23). Parte inferior: O efeito do tratamento de Pi e Ai + Di na localização de MDC1 com alto poder de entrada danos como indicado. Barra de escala é de 10 µm. Direita: Alterações de sinais de fluorescência de MDC1 a alta potência entrada danificar sites na presença de DMSO, Pi ou Ai + Di com p-valores (valores são: DMSO, 0,07 ± 0,10; PI, ± 0.05 0.07; Ai + diga, 0,86 ± 0,26). Barra de escala = 10 µm. N = 10 para cada medida de intensidade. (B) o efeito da valorização do PAR sinais por Paulo Pereira tratamento ao recrutamento 53BP1 endógenos para locais de baixo poder de entrada de dano. Direita: Boxplots representando a análise quantitativa de recrutamento 53BP1 endógenos (detectado pela mancha da imunofluorescência) com laser de potência entrada baixo (60 mW no 800 nm NIR do laser/invertido epi-fluorescência microscópio sistema) em 15 min pós irradiação na presença de DMSO ou Paulo Pereira conforme indicado. Esquerda: PAR e 53BP1 imunofluorescência fotos de células danificadas nas mesmas condições com DMSO ou Paulo Pereira tratamento de coloração. Para o tratamento de DMSO, 100% das células examinadas (N = 25) exibiu recrutamento robusto 53BP1 (à direita). Em contraste, 20/25 mostrou nenhum recrutamento 53BP1 na presença de Paulo Pereira (canto inferior direito) e 5 células mostrou recrutamento fraco. Barra de escala = 10 µm. Esta figura foi modificada de Saquilabon Cruz32. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As vantagens do uso do laser microirradiation para pesquisa DDR são:
1. é viável para induzir diferentes tipos e quantidades de DNA danos de quebras simples ao complexo dano do ADN, e para detectar fatores diferentes reparo no DNA danificar sites ajustando os parâmetros de irradiação do laser. Também é possível causar danos várias vezes no mesmo núcleo celular a fim de avaliar os efeitos de trans (conforme Figura 3).
2. importante, eventos acontecendo em danos locais e os eventos secundários que ocorrem em outros lugares no núcleo podem ser facilmente distinguidos.
3. é possível realizar medições em tempo real de alta resolução da dinâmica de proteína fluorescente etiquetado em resposta a danos em um nível de célula única, incluindo, mas não limitado a: Förster ressonância energia transferência (FRET), (imagem de tempo de vida de fluorescência FLIM), função de correlação par (pCF), etc., para capturar DDR em células vivas.
4. Combinando com tratamento de RNA de interferência ou inibidor, é relativamente simples para testar a exigência do montante fator em um pequeno número de células.
5. também deve ser observado que o NIR (ou verde) radiação laser não exige pre-sensibilização do DNA com análogos de nucleotídeos ou corantes intercalante de DNA, evitando assim indesejáveis efeitos colaterais na embalagem de cromatina. Isto está em contraste com o sistema de laser UV que requer sensibilização em dose baixa e provoca aberrante DDR em dose alta39,,49,61.
Passos críticos dentro do protocolo e modificação e resolução de problemas
É importante que as células estão em condições saudáveis quando as análises DDR são realizadas a fim de minimizar o artefato e variações experimentais. Células transfectadas DNA ou siRNA geralmente são mais sensíveis ou facilmente separada quando crescer na lamela em grade. Ajuda a manter as células para tempos mais curtos no reagente de transfeccao, enquanto o transfeccao funciona e mais uma células transfectada para o prato de lamela quadriculado em comparação com as células untransfected de sementes. Isto é necessário para atingir confluências de célula comparável para os experimentos.
Tem sido relatado que o bloco de timidina leva ao aumento dos níveis de γH2AX em células sincronizado62, que pode afetar a DDR e distorcer os resultados. Além disso, o sinal de γH2AX de linha de base foi mostrado para ser mais elevado na fase S e G2/M, mesmo sem qualquer dano exógena63,64. No entanto, não observamos qualquer sinal de γH2AX significativa no nucleoplasma que iria afetar ou interferir com a resposta de γH2AX específico em sites induzida por laser de danos nas células sincronizados na fase G2/S por uma dupla de timidina bloco51.
A fim de obter resultados consistentes, é necessário verificar periodicamente os parâmetros de saída do sistema do laser (a cada 2 a 4 semanas) e o alinhamento óptico (a cada 2 meses). Ao longo do tempo, componentes do sistema do laser podem precisar de ser re-alinhados, lente objetiva pode ser danificado e precisa ser substituída e a estabilidade da potência total pode mudar. A chave é para avaliar a presença de danos (reticulação (CPD e/ou 6-4PP) e dano base (8-oxoG)), marcador de proteínas (por exemplo, glycosylases DNA, Rad51, cohesin e Ku) e modificação PAR descrito neste protocolo para determinar a dosagem e complexidade do DNA danos induzidos pelo sistema de microscópio do laser usado.
Limitações da técnica
Microirradiation do laser tem limitações. Danos no DNA induzidos por feixe de laser é altamente clusterizado em uma área no núcleo em comparação com ocorrência natural danos que podem estar espalhados por todo o núcleo. Isso pode mudar como danos sinalização é propagada na cromatina vizinha ou no núcleo. Desde que um número relativamente baixo de células pode ser irradiado de uma só vez, não podem ser facilmente executados ensaios bioquímicos população-based (por exemplo, Western blot, purificação de proteínas complexas, imunoprecipitação da cromatina (ChIP)). Dependência de proteínas fluorescente etiquetadas (com sobre a expressão das proteínas recombinantes exógenas ou até mesmo com aqueles expressos endogenamente usando inserção marca CRISPR-mediada) para imagem dinâmica faz com que os estudos vulnerável à proteína induzida por fusão artefatos. A natureza única de dano induzido por laser e potenciais efeitos diferente de tagged proteínas, portanto, precisam ser avaliadas por comparação com os resultados usando o DNA convencional danificar métodos (IR, produto químico agentes nocivos) e com o endógeno proteínas não marcas (embora às vezes não é possível realizar experiências paralelas completas).
Importância no que diz respeito a métodos existentes
O uso de endonucleases sequência-específicos tais como eu-SceI, Fialho, AsiSI e eu-PpoI fornece uma estratégia alternativa para induzir DSBs site-specific (DSBs estritamente simples). Recrutamento de fator ou modificações que podem ser analisadas pelo site-specific ou todo o genoma ChIP análise65,,66,67,68,69. Indução relativamente síncrona de DSBs pode ser alcançada por marcação a endonuclease com um receptor de hormônio esteroide e um sinal de degradação (degron) para rápida translocação nuclear e degradação, respectivamente65,66 , 67 , 68 , 69. uma deve levar em consideração, no entanto, que a eficiência da expressão endonuclease e acessibilidade do local de destino, e o estado de reparação em curso pode ser variável em células diferentes e em locais de destino diferente. Essas heterogeneidades vão ser em média em análise o ChIP populacional, que pode distorcer os resultados. Microirradiation do laser, por outro lado, oferece a maior resolução temporal possível (milissegundos), bem como a resolução espacial (submicrometer) da dinâmica de resposta de dano, que pode ser analisada a nível de célula única. Densidade de dano alto, no entanto, pode influenciar o resultado. Ambas as estratégias podem ser sensíveis aos artefatos causados pela acessibilidade de anticorpo e/ou marcação de peptídeo. Portanto, é importante compreender os prós e contras de ambas as estratégias, o que potencialmente podem ser usados para complementar um ao outro.
Aplicações futuras
Com o rápido avanço da imagem latente de fluorescência e técnicas de dinâmica, versatilidade de sistemas laser para induzir diferentes quantidades e tipos de dano de DNA em locais específicos e estágio do ciclo celular fornece uma valiosa oportunidade de interrogar o celular e respostas moleculares de DNA danos com alta resolução spatiotemporal nível uma única célula. Será possível, por exemplo, para destrinchar danos site-specific e núcleo e célula toda a DDR sinal de transdução com milissegundo-resolução (por exemplo, detectar interações moleculares ou modificações que ocorrem exclusivamente em sites de danos, examinar mudanças dinâmicas da estrutura da cromatina em tempo real, ou observar a difusão em tempo real do dano sinalização de locais de danos para o núcleo de todo). Também é possível acompanhar a mesma cela durante um longo período de tempo necessário para examinar os efeitos dos danos do DNA no destino da célula. Vislumbramos que os métodos de microirradiation do laser, se usado corretamente, continuará a contribuir significativamente para o avanço do campo de reparação do DNA.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o Dr. Akira Yasui na Universidade de Tohoku, Japão para o plasmídeo de expressão de GFP-NTH1 e Dr. Eros Lazzerini Denchi no Scripps Research Institute, La Jolla, Califórnia para o TRF2-YFP e EGFP-53BP11220-1711 plasmídeo de expressão. Este trabalho foi financiado pelo escritório da força aérea de investigação científica (FA9550-04-1-0101) e o Instituto de Laser Beckman Foundation Inc. (para M.W.B), a Ford Foundation Fellowship da Academia Nacional de Ciências (para B.A.S) e NSF MCB-1615701 e CRCC CRR-17-426665 (para K. Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 | Coherent Inc. | Mira 900 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200M | |
| 63X/1.4 NA objective | Zeiss | APOCHROMAT Ph3 | |
| Compact Rotation Stage | Newport Corp | PR50PP | |
| Temperature Controller | Warner | TC-344B | |
| Heating System | Ibidi | 10918 | |
| Gas Incubation System | Ibidi | 11920 | |
| Laser Power and Energy Meter (RoHS) | Coherent | FieldMaxII-TOP | |
| ORCA-R2 Digital CCD Camera | Hamamatsu | C10600 | |
| LSM 510 META Laser Scanning Microscopes | Carl Zeiss | ||
| 100X/1.3 NA Zeiss Plan APO | Carl Zeiss | ||
| 35mm Gridded Dishes | MatTek | P35G-1.5-14-CGRD-D | |
| PtK2 kidney epithelial cells | ATCC | CCL 56 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| DMEM | Life Technologies | 11885-092 | |
| CO2-Independent Medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| Advanced MEM | Life Technologies | 12492-013 | supplemented with L-Glutamine, 4% FBS |
| penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | 15140122 | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25030081 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Thymidine | SIGMA | T9250 | |
| serum free media (Opti-MEM I Reduced Serum Media) | Fisher Scientific | 11058021 | |
| Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) | Kamiya Biomedical Company | MC-062 | |
| Anti-XRCC1 (mouse ) | Gene Tex Inc | GTX72311 | |
| Anti-53BP1 (rabbit) | Santa Cruz Biotech | sc-22760 | |
| Anti-CtIP (rabbit) | Abcam | ab70163 | |
| Anti-PAR polymers (mouse) | Enzo Life Sciences | BML-SA216-0100 | |
| Anti-PAR (rabbit) | Trevigen | 4336-BPC-100 | |
| Anti-TRF2 (mouse) | Novus Biological | NB100-56506 | |
| Anti 6-4PP (mouse) | Kamiya Biomedical | ||
| Anti-Rad21 (Rabbit) (for cohesin detection) | generated in Yokomori (KY) lab | ||
| Anti-Rad51 (Rabbit) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8349 | |
| Anti-Ku70 (mouse) | Novus Biologicals | NB100-102 | |
| 8-oxiguanine | Trevigen, Inc. | ||
| Anti-PARP1 (Rabbit) | generated in KY lab | ref 43 | |
| Anti-hCAPG (Rabbit) (for condensin detection) | generated in KY lab | ref 42 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Inc | 711-165-152 | |
| Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | |
| HiPerFect siRNA Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| GFP-SMC1 stable cell line | generated in KY lab | ref 49 | |
| GFP-NEIL2 stable cell line | generated in KY lab | ref 54 | |
| GFP-NTH1 stable cell line | generated in KY lab | ref 32 | |
| GFP-SMC1 plasmid | generated in KY lab | ||
| GFP-Ku plasmid | generated in KY lab | ||
| Anti-MDC1 (rabbit) | Novus Biologicals | NB100–395 | |
| Anti-gH2AX (rabbit) | Millipore | 07–164 | |
| EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
| TRF2-YFP PtK2 stable cell line | generated in Berns lab | ref 32 | |
| DMSO | Sigma | D2650-100ML | |
| PARG inhibitor | Trevigen | 4680-096-03 | |
| DNA–PKcs inhibitor NU7026 | Sigma | N1537 | |
| ATM inhibitor KU55933 | Calbiochem | 118500 | |
| Olaparib | Apexbio Technology | A4154 | |
| Paraformaldehyde | ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS | 100503-916 (EA) | |
| Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 | Bio-Rad | SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC | image analysis program |
| Excel | microsoft | spreadsheet program | |
| Triton X100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium | Fisher Scientific | 14200166 | dilute to 1X |
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