Summary
Mangel på verktøy for å måle materialegenskaper og tensional parametere i vivo forhindrer validering sine roller under utvikling. Vi ansatt atomic force mikroskopi (AFM) og hydrogenion sporing å kvantifisere mekaniske funksjoner intakt sebrafisk embryoet eggeplomme cellen under epiboly. Disse metodene er pålitelig og allment gjeldende unngå påtrengende intervensjoner.
Abstract
Klargjørende faktorer som direkte spatio-temporale organisasjonen utvikling vev er en av de viktigste formålene i studiet av utvikling. Ulike påstander hevder å ha vært viktige bidrag til forståelsen av mekanisk egenskapene til celler og vev i organisasjonen spatiotemporal i ulike utviklingsmessige og Morfogenetiske prosesser. Men på grunn av mangel på pålitelig og tilgjengelig verktøy til å måle materialegenskaper og tensional parametere i vivo, har validere disse hypotesene vært vanskelig. Her presenterer vi metoder ansette atomic force mikroskopi (AFM) og partikkel sporing med sikte på å kvantifisere mekaniske egenskaper for intakt sebrafisk embryoet eggeplomme cellen under epiboly. Epiboly er en tidlig bevarte utviklingsprosess som studien er tilrettelagt av gjennomsiktigheten til fosteret. Disse metodene er enkle å implementere, pålitelig og allment gjeldende siden de overvinne påtrengende tiltak som kan påvirke vev mekanikk. En enkel strategi ble brukt for montering av prøver, AFM opptak og hydrogenion injeksjoner og sporing. Denne tilnærmingen gjør disse metodene lett tilpasses andre utviklingsmessige ganger eller organismer.
Introduction
De fysiske prinsippene biomekaniske kontroll av Morfogenetiske prosesser er hovedsakelig udefinert. Mens biomekaniske studier på molekylære og mobilnettet nivå samler betydelig fart, er utforskningen av biomekaniske parametere på vev/organisme nivå på sin barndom. Etter regresjon1 eller Video tvinge mikroskopi2 tillate forskere å skille mellom aktive og passive styrker, mens laser mikrokirurgi3eller mindre påtrengende atomic force mikroskopi (AFM) avstand celler4 eller i vivo 5 eller hydrogenion microrheology6 tillate påvente av en vev mekaniske egenskaper og svar.
AFM er en tredimensjonal topografiske teknikk med høy atomic oppløsning løse overflateruhet og overholdelse fra nedbøyning cantilever tips ved kontakt med probed overflaten7. Ulike metoder ansette AFM er utviklet for å undersøke overflate egenskaper, inkludert måle friksjon, vedheft styrker og viskoelastiske egenskaper av ulike materialer. AFM har nylig dukket opp som et kraftig verktøy for å hente informasjon i biologiske prøver mekaniske egenskaper. Spesielt kan AFM ikke-invasively trekke komplekse skjær modulus fra enkeltceller ved å bruke oscillasjon innrykk med mikro tips knyttet til en cantilever kjent bøying konstant8. Dermed kan vi antyde resulterende styrker. Likevel, AFM er ikke unikt og ulike metoder kan trekke reologiske data og mekaniske egenskaper fra individuelle celler (f.eks brønnene aspirasjon9, magnetiske kronglete cytometri (MTC)10eller uniaxial strekk testing11).
Likevel, bruk av disse ny metoder til komplekse Morfogenetiske prosesser er ikke enkel. De viktigste utfordringene når de mekaniske egenskapene av embryonale vev er små (µm mm), myk (i 102 - 104 Pa-serien) og visco-elastisk (gi opphav til tidsavhengige fenomener) natur av materielle12. Det er derfor viktig å tilpasse metoder brukt for fastsettelse av mekaniske egenskaper (stivhet, viskositet, vedheft) til det konkrete tilfellet av embryo og utvikle organismer. To viktige spørsmål må tas i betraktning når du analyserer reologiske tilnærminger å studere utviklingen: unngå påtrengende forstyrrelser og gi lett tilgjengelighet. I dette scenariet utstilling brønnene aspirasjon, MTC og strekk testing begrensninger. I det første tilfellet, kan høy deformasjon som en celle lider endre sine fysiologiske og mekaniske egenskaper9. I det andre tilfellet kan måtte fast følge eksperimentelle vevet til et substrat for å sikre at stress brukt deformere cytoskeleton lokalt også introdusere effekter på cellene aktiveringsstatus og derfor i sine mekaniske funksjoner10 . Siste, uniaxial strekk tilnærminger er begrenset av geometrien i utvikle organismer og tilgjengelighet11.
AFM synes å være bedre egnet for studiet av utviklingsprosesser som det tillater studiet av biologiske prøver direkte i sitt naturlige miljø uten noen tungvint eksempel forberedelser. Videre som av embryonale vev er generelt vanskelig, gir den reduserte størrelsen på AFM sonder en høy grad av allsidighet med ingen begrensning i valg av typen medium (vandig eller ikke-vandig), eksempel temperatur eller kjemisk sammensetning av prøven. AFM er allsidig nok til å brukes på store domener og tid skalaer og har vært ansatt hente materialegenskaper vev i forskjellige utviklingsstadier eller fysiologiske forhold. Hele opprinnelige vev som arteriene13 eller bein14 har studert fra en topografiske synspunkt og i noen tilfeller, som sclera, mekaniske egenskaper har også vært hentet15. Topografi har blitt utforsket i live embryoer tillater visualisering av, for eksempel celle omorganisering under morphogenesis i Xenopus16. Siste, omfattende utvalg forberedelse protokollene er utviklet for å fastslå mekanisk parametere under forskjellige utviklingsprosesser. Nanoindentation kart generert på innfødt unfixed vev seksjoner for chick embryonale fordøyelseskanalen11; klebende og mekaniske egenskaper hentet for enkelte ektoderm, mesoderm og endoderm stamfar celler isolert fra gastrulating sebrafisk embryo4; stivhet målinger utført for epiblast og primitive stripe på explants avian embryo17; og et distinkt mønster av stivhet forløpninger direkte definert i embryonale hjernen Xenopus5.
Betydelig kvalitative spranget for å søke AFM utforske embryonale utviklingen kommer nærmer enkelt tilgjengelig Morfogenetiske prosesser. Sebrafisk epiboly er en viktig og konservert hendelse, der ulike vev koordinere med begrenset sfærisk plass til direkte utvidelse av blastoderm i noen timer. Ved utbruddet av sebrafisk epiboly (sfærisk scenen) dekker en overfladisk lag av celler, omsluttende laget (EVL), en semi sfærisk cap blastomeres sentrert på dyr stangen av embryoet sitter på en massiv eggeplomme syncytial celle. Epiboly består av kortikale grønne ward utvidelse av EVL, dype cellene (DCene) i blastoderm, og den ytre lag av syncytial eggeplomme cellen (E-YSL) rundt eggeplomme. Epiboly slutter med nedleggelsen av EVL og DCs vegetal pole18,19,20. Hvordan og hvor styrker genereres under epiboly og hvordan de er globalt kombinert er ennå ikke klart1,21.
Her beskrive vi i detalj hvordan søke AFM å antyde passiv mekanisk vev egenskaper under epiboly progresjon i sebrafisk eggeplomme celle i vivo. Gjør ansatt vi liten mikrosfærer knyttet til AFM utkragning som sonder. Dette gjør at henting av presise lokal informasjon i ikke-uniform eggeplomme celleoverflaten og å studere tensional graderinger og deres dynamics over tid. Alternative AFM tilnærminger som de bruker kile utkragning22, vil ikke gjengi lokale data som er nøyaktig nok. Kile teknikken, som krever svært forsiktig manipulasjon ferdigheter å lime en kile større enn størrelsen på utvalget på slutten av hengende, er ikke godt egnet for undersøkelser embryo (~ 2-fold større enn lengden på hengende) mekanikk.
Modellering og karakterisere viskoelastiske egenskapene til celler på kvalitativ og kvantitativ måter gir en bedre forståelse av deres biomekanikk. Fra en biomekaniske synspunkt er det viktig å forstå epiboly, og ikke bare krever kunnskap om kortikale spenning målinger og dynamikk, som kan trekkes ut ved AFM; Dermed er det behov for informasjon om egenskapene Biofysiske av vev. Hvis du vil trekke ut denne informasjonen, en rekke celle Reologi teknikker er utviklet gjennom årene for å karakterisere ulike celletyper under ulike fysiologiske forhold23. De inkluderer AFM, MTC og optisk pinsett (OT). Disse metodene, men har vist seg utilstrekkelig for Mesoskopisk analyser på omfanget av embryo eller organer. Som et alternativ, har vi lykkes tilpasset hydrogenion sporing microrheology6 for i vivo reologiske målinger. Denne teknikken analyserer Brownian forskyvningene personlige partikler og utleder lokale micromechanical egenskaper.
Sammen AFM og hydrogenion microrheology at definisjonen av kortikale tensional dynamics og interne mekaniske egenskaper av plommen under epiboly. Denne informasjonen støtter fullt en modell der Anisotrop stress utvikler av forskjellene i deformasjon svar på EVL og den eggeplomme cytoplasmatiske lag (YCL) til isotropic actomyosin sammentrekning av E-YSL cortex er avgjørende for retningsbestemt netto bevegelsen av EVL og epiboly progresjon1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokollen trinnene beskrevet nedenfor følger retningslinjene for dyr omsorg i våre institusjoner.
1. sebrafisk kultur
- Rase og vedlikeholde voksen sebrafisk under standard betingelser.
Merk: AB og TL vill type embryo ble brukt for denne studien. - Samle embryoer og dyrke dem på 28,5 ° C i E3 embryoet middels24. Scenen dem ifølge morfologi som beskrevet tidligere19.
2. atomic Force mikroskopi
- Manuelt dechorionate iscenesatt sebrafisk embryo (i ulike aldre etter personlige interesser). Fjern chorions med to tynne og skarp tang (se Tabell for materiale).
- Grip plasmocitara med en tang og gjør en tåre det med andre tang. Holder plasmocitara i en region motsatt av tåre, trykk fosteret forsiktig gjennom åpningen.
- Utføre dechorionation under en dissecting stereomicroscope med en justerbar rekke forstørrelsen mellom 8 X og 50 X.
- Montere embryoene for AFM
- Forberede en løsning av 2% agarose i fosteret medium og fylle en 35 mm Petriskål med dette. La det stivne. Gjøre små hull av 1,5 mm diameter (to ganger størrelsen embryoet) og ca 350 µm dybde (halv embryoet størrelsen) med tynne tang i agarose seng.
- Plasser embryoene i pokes i agarose laget og sikre de er på plass ved å spre rundt en løsning på 0,5% lav smelter agarose i fosteret medium. Hell denne løsningen rundt bare embryoene til sikre dem i hullene.
- Før lavt Smeltepunkt agarose stivner ved romtemperatur, rotere embryo slik at regionen rundt å bli undersøkt av AFM vil møte oppover (figur 1A).
- Undersøke embryoene av AFM
- Finn og bilde embryo i Petriskål ansette en 20 X målsetting i en invertert Atomic Force mikroskop (se Tabell for materiale25) ved romtemperatur (23-24 ° C).
Merk: Embryoene er holdt i live midt i fosteret medium og festet til agarose seng. - Sonde eggeplomme celleoverflaten av støpt embryo ansette sfærisk polystyren perler på 4,5 µm i diameter knyttet til en cantilever med en nominell våren konstant av 0,01 N/m. Sett topp-til-topp amplituden til cantilever oscillasjonen til 5 µm og dens frekvens 1 Hz.
- Samle inn data for hver region skal testes i ulike stillinger og i flere embryoer, som en rutine, for data snitt.
Merk: Et godt utgangspunkt er å undersøke fem posisjoner ligger i midten og på hjørnene av en 10 µm x 10 µm firkant ved å kontrollere cantilever posisjon med XY piezo-aktuatorer AFM mikroskopet. Bildebehandling og datainnsamling tok rundt 20 min per fosteret. Registrere data i ulike regioner av embryoet eggeplomme celleoverflaten, kan f.eks, vegetal pole eller regioner nær EVL celler margin (figur 1B og 1 C), bare gjøres ved å bruke forskjellige prøver orientert annerledes.
- Finn og bilde embryo i Petriskål ansette en 20 X målsetting i en invertert Atomic Force mikroskop (se Tabell for materiale25) ved romtemperatur (23-24 ° C).
- Beregne styrker
- Måle den loddrette forvrengningen AFM hengende (z) med belastninger måle sensorer koblet til piezo-aktuatorer og dens nedbøyning (d) bruker en kvadrant photodiode av optisk spaken metoden med mikroskopet kontroll programvare (se Tabell for materiale 25).
- Bruke skråningen av en d-z kurve fra data samlet inn fra en nakne region av et glass dekkglassvæske for å kalibrere sammenhengen mellom photodiode signalet og cantilever nedbøyning (d).
Merk: Den målte loddrette forvrengningen tilsvarer cantilever nedbøyning og skråningen representerer nedbøyning følsomheten optisk spaken26. - Antyde cantilever våren konstant (k) fra de termiske fluktuasjoner som tidligere beskrevet27.
- Beregne innrykkingen av prøven (h) som:
h = (z - zc) -(d - dav) (1)
Merk: Her zc er posisjonen til kontaktpunktet og dav er forskyvningen av photodiode. - Beregne (F) på hengende som:
F = k · d (2)
- Beregne spenningen i cortex i væske-ballongen modell som består av et elastisk lag kortikale spenning Tc omslutter en tyktflytende væske. I denne modellen for små innrykk (i forhold til størrelsen av embryoet), øker makt proporsjonalt4,28 som:
F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
Merk: Her Rb er radius av perle og Re er radius av fosteret. For sebrafisk embryoet, radius av embryoet (400 µm) er to størrelsesordener større enn perle (2,25 µm), kan dette bli rundet som:
F = 4π Tc h (4)- Beregne spenning kraft-innrykket (F-h) kurver for hver embryoet eggeplomme celle region for fem forskjellige punkt målinger.
- Beregne Tc for hver F-h kurven av ikke-lineær minste kvadrater montering. For statistisk analyse, kortikale spenningen Tc beregnet må være gjennomsnitt fra ulike F-h kurver.
- Måle viskoelastiske egenskapene (Reologi) på cortex ved å bruke lave amplituden (100 nm) multifrequency svingninger under AFM består av sinusformet bølger av forskjellige frekvenser25.
- Beregne en effektiv komplekse modulus g*(ƒ) i frekvens domene fra kraft innrykk kurvene som:
g * (f) = [F(f) / h(f)]- ledige og opptatte tidspunkt (5)
her er den imaginære enheten og F(f) og h(f) er til frekvens (f) spectra og innrykk. b er korrigering for viskøse dra på hengende utdraget fra the svingninger anvendt på overflaten. - Egen g*(ƒ) i reelle og imaginære delene som:
g * (Ƒ) = g' (f) + ig'' (f) (6)
EM > g'(f) er elastisk modulus og er et mål av elastisk lagret og gjenopprettet per syklus av oscillation. g'' (f) er tyktflytende modulus som står for utsvevende energi. - Beregner tap tangens, som gir en indeks på solid-lignende (< 1) eller væske-lignende (> 1) atferd av materialet, som:
g'' (f) / g' (f) (7)
Merk: Med denne målingen, er det mulig å trekke parametere som angir hvordan tyktflytende og hvordan elastisk er probed materiale. Selv om b er litt avhengig av avstanden fra slutten av hengende på overflaten, gitt svært lav verdiene g´´ utstilt av eggeplomme celle (se figur 2D nedenfor), små variasjoner i b har en ubetydelig effekt i De målinger29.
- Beregne en effektiv komplekse modulus g*(ƒ) i frekvens domene fra kraft innrykk kurvene som:
3. partikkel sporing Microrheology
-
Utføre partikkel microinjection i eggeplomme cellen
- Dikte tilpasset microneedles bruker vannrett brønnene avtrekker og kapillær Borosilikatglass (se Tabell for materiale).
- Forberede microneedles som har en ytre diameter 1.00 mm, en diameter på 0.58 mm og en lengde på 10 cm med avtrekker innstillinger: Press: 500; Varme: 510; Trekke: 65; Hastighet: 25; Tid: 50.
- Forberede en injeksjon Petriskål plate ved å opprette rett innrykk baner i en 1% agarose i fosteret middels seng sysselsetter egendefinert laget former (se Tabell for materiale).
- Snu formene opp ned og plassere dem på flytende agarose gel og fjerne formene når gel har styrket. Pipetter embryoene inn i sporene laget av mold i agarose under en dissecting stereomicroscope på 1,2 X forstørrelse.
Merk: Bredde og design av muggsopp aktivere embryoene til selv.
- Snu formene opp ned og plassere dem på flytende agarose gel og fjerne formene når gel har styrket. Pipetter embryoene inn i sporene laget av mold i agarose under en dissecting stereomicroscope på 1,2 X forstørrelse.
- Før injeksjon, nesten helt fjerne mediet for å lette injeksjon (overflatespenningen hindrer embryoet/plasmocitara fra stikker til nålen når du fjerner det etter injeksjon).
- Microinject fluorescerende nanopartikler (radius en = 100 nm, se Tabellen for materiale) fortynnet i vann (1:1, 000) i den grønne delen av fosteret eggeplomme cellen (figur 3A).
- Juster brønnene med presisjon micromanipulators og injisere perler med en automatisk microinjector med tid og press (se Tabell for materiale). Angi trykket mellom 10 og 20 psi.
- Før injisere perle oppløsningen, kalibrerer volumet å injisere (0,5 nL) ved å måle dråpestørrelse levert av microinjector med en 1 x 0,01 mm scenen mikrometer (se Tabell for materiale).
- Ansette en forstørrelse på 1.6 X i den dissecting stereomicroscope å visualisere embryoene under injeksjoner, som utføres ved romtemperatur.
- Dikte tilpasset microneedles bruker vannrett brønnene avtrekker og kapillær Borosilikatglass (se Tabell for materiale).
-
Vurdere viskoelastiske atferden til eggeplomme ved termiske fluktuasjoner
- Dechorionate de microinjected embryoene som i trinn 2.1 og bygge dem inn i en 0,5% lav smelter poeng agarose i fosteret middels løsning på 30 ° C. Etterpå, overføre dem til glass bunnplater (se Tabell for materiale) og orientere og presse dem mot dekkglassvæske når agarose er fremdeles flytende.
Merk: Når agarose stivner ved romtemperatur, the embryo er klar til å avbildes. - Plass embryoene montert i glass bunnplater på scenen av AC confocal invertert mikroskop 2t etter microinjection. Ta bilder av nanopartikler for 26 s på en samplingsfrekvens på 25 Hz med en 63 X målsetting i romtemperatur i en invertert AC confocal mikroskop ansette standard kommersielle mikroskop programvaren (pikselstørrelsen = 166 nm, bilder tatt hver 40 ms).
- Beregne posisjonen av partikler centroids og definere sine baner over tid med TrackMate plugg av åpen kildekode ImageJ programvare (figur 3B).
- Beregne todimensjonal Mean Square forskyvning (MSD) i hver partikkel med skreddersydd programvare6,30 som:
< Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2> (8)
Merk: Her t er tiden og tidsforsinkelsen. I en ren tyktflytende væske øker MSD omvendt med viskositet (ν) etter Stokes-Einstein relasjonen:
< Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa, (9)
der er absolutt temperaturen.
- Dechorionate de microinjected embryoene som i trinn 2.1 og bygge dem inn i en 0,5% lav smelter poeng agarose i fosteret middels løsning på 30 ° C. Etterpå, overføre dem til glass bunnplater (se Tabell for materiale) og orientere og presse dem mot dekkglassvæske når agarose er fremdeles flytende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kortikale spenning målinger
For hver måling poeng, fem kurver i force-forskyvning (F-z) ble kjøpt av AFM av gradvis hengende ved 1 Hz med en topp-til-peak amplitude på 5 µm (hastighet = 10 µm/s) opp til en maksimal innrykk på ~ 2 µm. Denne fremgangsmåten tok mindre enn 20 min og var ikke påvirket av epiboly progresjon. Hver eksperimentelle tilstand ble testet i minst 5 embryoer.
Force-forskyvning kurvene registrert på fosteret eggeplomme cellen, tvert imot til de tilsvarende den myke rundt agarose, utstillingen en proporsjonal lineær sammenheng (R2 > 0.999) (figur 2A). Vi utførte flere sett med kontroll F-z kurver på 3 µm/s og 30 µm/s og forkastet en potensiell avhengighet kortikale spenning Tc hastigheten hengende. Tc økte bare med 13% (p < 0,01, t-test) når hastigheten ble redusert fra 10 til 3 µm/s og ikke viser noen betydelig endring når økte fra 10 til 30 µm/s.
Force-innrykk (F-h) kurver spilt inn på en cantilever hastighet av 10 µm/s eggeplomme cellen var nesten lineære og utstyrt med en flytende balloon modell (figur 2B)1. Dette passer tillatt beregningen av de absolutte verdiene av mener overflatespenning (pN/µm) på forskjellige epiboly stadier og ulike posisjoner i forhold til EVL forkant (identifisert under lyset) (tabell 1).
Reologi på cortex
Forskjellene mellom innrykk og retraksjon av kraft-forskyvning (F-z) kurver (figur 2C) angir viskoelastiske oppførsel av embryoet eggeplomme celle cortex. Lav amplituden (100 nm) multifrequency oscillation målinger gir informasjon for å beregne den effektive komplekse modulus g*(ƒ) eggeplomme celleoverflaten og elastisk og tyktflytende komponentene (se protokollen ovenfor).
Cortex Reologi i sebrafisk embryoet eggeplomme cellen er dominert av en solid-lignende oppførsel med tyktflytende modulus 5 ganger lavere enn den elastiske modulus1. Dette er ikke ofte avhengige, enten for elastiske (ANOVA, p = 0.123), eller for viskøse modulus (ANOVA, p = 0.719) (figur 2D).
Reologi av eggeplomme
Viskositeten av eggeplomme ble beregnet ved å sette formelen (5) i MSD dataene fra hydrogenion sporing (se figur 4A-B). MSD termisk svingninger av fluorescerende nanopartikler innebygd i eggeplomme utstillinger en proporsjonal avhengighet av tidsforsinkelsen τ, samsvarer med atferden til en newtonsk væske. Den effektive skjær viskositeten av eggeplomme, hvilke er omvendt relatert til bulk diffusjon koeffisientene til nanopartikler, var 129 mPa·s.
Figur 1: AFM sebrafisk eggeplomme celler i vivo. (A) Diagram som beskriver settet opp ansatt for å undersøke sebrafisk eggeplomme celle cortex av AFM. Dechorionated embryo i ulike aldre var halvveis inn hull opprettet tilpassede agarose blokker, roteres i en bestemt retning og forseglet i kantene med lavt Smeltepunkt agarose. Eggeplomme cellene ble undersøkt med sfærisk polystyren perler knyttet til en cantilever (rød). (B) undersøkt Embryo på 50% epiboly halvparten innebygd i agarose med en cantilever (USANN røde) på vegetal Polen. (C) et tilsvarende embryo som i B, analysert på eggeplomme cellen i et område nær EVL celler margen. Skalere barer = 100 µm (B og C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Sebrafisk embryoet eggeplomme celle kortikale spenningen og Reologi. (A) Force [nedbøyning (d)]-forskyvning (z) kurver innhentet for en representant embryo som cantilever spissen nærmer seg og kontakter prøven [agarose overflaten (kontroll) i blått] og eggeplomme celleoverflaten i rødt. (B) tvinge innrykk (F-h) kurver (n = 3 embryo, 3 mål per embryoet i en avstand på 10 µm fra hverandre. Hver måling representerer gjennomsnittet av 5 kurver) med en flytende balloon modell (fra referanse1). Merk lineær økning i nedbøyning ved kontakt med embryoet eggeplomme celleoverflaten. Den stiplede svarte linjen viser montering modellen (som kortikale spenningen utledes). (C) tilnærming (rød) og retraksjon (lilla) force-forskyvning kurver for en representant fosteret. Buet rødt og lilla piler peker til timelige regimet for innsamling av data. Dobbeltpil understreker forskjellen mellom det nærmer seg og trekke nedbøyning verdier peker til viskoelastiske tegnet på cortex. (D) Viscoelasticity av eggeplomme celle cortex (n = 5 embryo). Effektiv komplekse modulus (g *) Hentet fra multifrequency svingninger AFM målinger (fra 1). Røde symboler representerer elastisk modulus (g'), og blå symboler definere tyktflytende modulus (g″), henholdsvis. Mener standardfeil (SE) vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Partikkel sporing microrheology. (A) fluorescerende nanopartikler som injiseres i eggeplomme cellen av sebrafisk embryo på 50% epiboly. (B) forskyvninger ble sporet for individuelle nanopartikler tilfeldig fordelt i eggeplomme (til venstre). Gang løpet av typiske baner av nanopartikler (centroids) som er innebygd i eggeplomme (2 eksempler) utstilling tilfeldig turer som er karakteristisk for viskøse spredning. Skala bar = 100 µm (A); 1 µm (B, venstre); 200 nm (B, høyre). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Microrheology av sebrafisk embryoet eggeplomme. (A) MSDs av personlige nanopartikler (n = 99) viser en ca lineær avhengighet med tidsforsinkelsen. (B) mener ± standardfeil MSDs av nanopartikler og viskositet av eggeplomme. Ensemble gjennomsnitt MSDs (gjennomsnitt - rød linje ± SE) av hydrogenion befolkningen utstillinger hovedsakelig tyktflytende karakter. Lineær skråningen av forholdet gjenspeiler diffusive egenskapene til nanopartikler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Spenning (pN/mm) gjennomsnittlig ± SE | % av Epiboly | |||
| 40-50 | 60-70 | 80-90 | ||
| Avstand til EVL marg | 20 μm (E-YSL) | - | 60 ± 7 | - |
| 40 μm (YCL) | 67 ± 11 | 72 ± 5 | 110 ± 7 | |
| Vegetal Pole | - | 75 ± 3 | - | |
| n = 3 embryo (5 innrykk på hver) for hver betingelse | ||||
Tabell 1: Spatio-Temporal spenningen distribusjon på celleoverflaten eggeplomme under Epiboly.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi at materielle egenskapene og noen biomekaniske parametere sebrafisk eggeplomme cellen under epiboly kan lett estimeres ved AFM og nanopartikler microrheology.
Mens AFM har vært ansatt hente reologiske funksjoner i celler og vev i fysiologiske forhold4,5,25,28, utviklet her vi en protokoll for bruk AFM på intakt utvikling embryo som vi ansatt for å teste eggeplomme celleoverflaten av sebrafisk fosteret under epiboly.
For våre AFM målinger, ble retningen på embryoene sikret ved halv bygge dem inn i lav smeltende agarose. Likevel, agarose innebygging ikke påvirke AFM målinger. Stivhet av agarose ble målt ved sondering overflaten med en sfærisk tips. Vi fant en ung modulus (E) av 4,2 0,2 Pa for gel omrisset kraft-innrykk kurver med Hertz kontakt modell av en kule rykke flate av en elastisk kroppen. Gitt at E 3g', agarose var 50-fold mykere enn eggeplomme celle cortex (figur 2D). Derfor vurderer sin begrenset tykkelse og veldig lav stivhet, AFM målinger registrert på fosteret synes å være svært pålitelig.
Det er viktig å merke seg at henting absolutte verdier for kortikale spenning fra AFM data krever forsiktig på om mekaniske modellen passer. Ved sebrafisk eggeplomme cellen, med sin unike komposisjon med et ytre piskehale som henger-rik cytoplasmatiske lag omfatter en svært tyktflytende eggeplomme masse, vi omgå problemet ansette en væske-ballongen modell som består av en elastisk cortex omsluttende en tyktflytende væske. Denne modellen har tidligere blitt brukt til å beregne kortikale spenningen av leukocytter med brønnene aspirasjon28, sfærisk progenitor celler fra gastrulating sebrafisk embryo rykket inn med sfærisk AFM tips4og HeLa celler AFM bruke klemt fast utkragning22.
Vi anslo kortikale spenningen av eggeplomme cellen ved å rykke overflaten med en kommersielt tilgjengelig små sfæriske tips. Denne liten sonde tillot oss å måle direkte regionale forskjeller i kortikale spenning. Som beskrevet ovenfor, tolkes kraft-innrykk data i en minimal væske-ballongen modell (Eq. 2). Force kurver registrert på overflaten av gels og celler med en sfærisk tips øke med innrykk som en makt-lov med en 3/2 eksponent. Derimot fant vi en proporsjonal kraft-innrykk relasjon godt utstyrt med Eq. 2 (figur 2B). Den lille avhengigheten av Tc cantilever hastighet og lav g'' /g' forholdet (figur 2D) angir at cortex mekanikk er dominert av en elastisk atferd.
Eggeplomme mekanikk var uavhengig undersøkt med microparticle Reologi. Lineær økning av MSD observert tydelig reflekterer en ren tyktflytende atferd. Det bør bemerkes at viskositeten av polymer løsninger er avhengig av størrelsen på sonde31. Derfor verdien av eggeplomme viskositet vi målt med en sonde 100 nm i radius kan noe forskjellig fra molekylær (f.eksfluoresce depolarization) eller makroskopisk mål. Til sammen gir disse resultatene sterk støtte til tilstrekkeligheten av væske-ballongen modellen og robusthet av kortikale spenning og eggeplomme viskositetsmålinger.
Vi grunn at denne tilnærmingen kan lett utvides for å måle blastoderm mekanikk i de samme embryoene eller til andre utviklingsmessige tidspunkt i sebrafisk og senere til andre organismer. Denne tilnærmingen bare avhenger engineering riktig montering prosedyrer (se referanse32) forenkle tilgang AFM sonder til riktige steder til rett tid. Kontinuerlig bevegelse de fleste celler og vev under utvikling bør likevel tas i betraktning i alle programmer til andre utviklingsmessige modeller. Cellen bevegelser vil gjøre bruk av disse metodene mye mer utfordrende.
I noen tilfeller ville AFM i vivo være ubrukelig hvis problemer ikke kan løses. Både i utvikling embryo og voksne er cellene hovedsakelig utilgjengelig. Derfor, for å teste Biofysiske egenskaper i situ, er viktig å ansette metoder ikke krever direkte kontakt. Hydrogenion sporing microrheology oppfyller disse kravene6. Denne teknikken er basert på analyse med høy romlig og tidsmessige oppløsning på Brownian forskyvningene personlige partikler. Lokale micromechanical egenskapene til viskoelastiske væske som omgir disse nanopartikler er en direkte gjenspeiling av omfanget og tidsforsinkelsen-avhengighet av deres MSDs. Denne tilnærmingen er allerede brukt til å utvikle organismer og har bidratt til å bestemme tankeren karakter av C. elegans embryoet cytoplasma30. Vi avdekket at en sebrafisk eggeplomme viser tilsvarende eiendommer med C. elegans embryoer, selv om dens viskositet er to størrelsesordener lavere. En lineær tid avhengighet av MSD med tilsvarende verdier av eggeplomme viskositet til de av sebrafisk eggeplomme har nylig rapportert Drosophila33.
Selv om vi ikke utforske denne muligheten oss, har injisert ubestrøket og belagt nanopartikler nylig vært ansatt som mål optisk pinsett i sebrafisk Larvene34. Ikke-invasive micromanipulation inne en hele-organisme kan gi ikke bare direkte innsikt inn i cellen interaksjoner men inn mekaniske egenskaper og aktiviteter ikke tilgjengelige ved hjelp av eksisterende tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Amayra Hernández-Vega og Philippe Alexandre Pouille for deltakelse i definere grunnlaget for disse protokollene. Vi takker også molekylær Imaging plattformen fra IBMB-PCB, Xavier Esteban og medlemmer av laboratoriet for kontinuerlig støtte. Programmet konsolidert grupper av Generalitat de Catalunya og DGI og consolidar tilskudd fra departementet for økonomi og Competitivity i Spania EMB og DN støttet dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | - | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | - | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 | Measuring injection volume |
References
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).
- Grill, S. W. Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis. Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).
- Koser, D. E., et al. Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain. Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).
- Wirtz, D. Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications. Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).
- de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).
- Roca-Cusachs, P., et al. Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy. Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).
- Evans, E., Yeung, A. Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration. Biophys J. 56, 151-160 (1989).
- Fabry, B., et al. Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914 (2003).
- Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Dev Biol. 401, 165-174 (2015).
- Chevalier, N. R., et al. Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues. Methods. 94, 120-128 (2016).
- Reichlin, T., et al. Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy. J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).
- Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation. J Biomech. 31, 21 (1998).
- Grant, C. A., et al. Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy. J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).
- Efremov, Y. M., et al. Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos. Micron. 42, 840-852 (2011).
- Henkels, J., et al. Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis. Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).
- Solnica-Krezel, L. Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion? Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).
- Kimmel, C. B., et al.
- Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms. Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).
- Campinho, P., et al. Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly. Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).
- Fischer-Friedrich, E., et al. Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells. Sci Rep. 4, 6213 (2014).
- Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: principles, practices, and prospects. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
- Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).
- Jorba, I., et al. Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy. J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).
- Lomakina, E. B., et al. Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation. Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).
- Alcaraz, J., et al. Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever. Langmuir. 18, 716-721 (2002).
- Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos. Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).
- Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).
- Soroldoni, D., et al. Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation. Science. 345, 222-225 (2014).
- He, B., et al. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508, 392-396 (2014).
- Johansen, P. L., et al. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974 (2016).
