Summary
דג זברה היא דוגמנית החיות פופולרי לחקור מנגנונים של ניוון רשתית/התחדשות גולגולת. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזירוז מקומי פגיעה שיבוש הרשתית החיצונית עם נזק מינימלי הרשתית הפנימי. לאחר מכן, אנחנו מפקחים ויוו המורפולוגיה הרשתית ואת התגובה עכשיו, דונלד מילר ברחבי התחדשות ברשתית.
Abstract
הבדל מרתק בין teleost לבין היונקים הוא הפוטנציאל לכל החיים של הרשתית teleost נוירוג'נסיס ברשתית, חידוש לאחר נזק חמור. חוקרים של מסלולים התחדשות של דג זברה עשוי להביא תובנות חדשות לפיתוח אסטרטגיות חדשניות לטיפול במחלות ניווניות ברשתית אצל יונקים. במסמך זה, התמקדנו אינדוקציה של פגיעה נקודתית אל הרשתית החיצונית בדג זברה למבוגרים באמצעות 532 ננומטר דיודת לייזר. פגיעה מקומי מאפשר לחקור תהליכים ביולוגיים המתרחשים במהלך ניוון הרשתית והתחדשות ישירות על האזור של נזק. באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית פולשני (אוקטובר), היינו מסוגלים להגדיר את המיקום של רגנרציה עוקבות אזור וצג פגום ויוו. אכן, OCT דימות מייצרת תמונות ברזולוציה גבוהה, חתך הרוחב של הרשתית דג זברה, מתן מידע אשר זמינים בעבר רק באמצעות ניתוחים היסטולוגית. על מנת לאשר את הנתונים בזמן אמת OCT, בוצעו מקטעים היסטולוגית, התגובה הרגנרציה לאחר אינדוקציה הפגיעה ברשתית נחקר על ידי אימונוהיסטוכימיה.
Introduction
החזון הוא כנראה תחושת החיוניות ביותר של האדם, ליקוי שלה יש השפעה סוציו-אקונומי גבוה. בעולם המתועש, מחלות ניווניות של הרשתית חשבון עבור הרוב המכריע של אובדן ראייה ועיוורון בקרב אוכלוסיית הבוגרים1. רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) הוא הגורם תורשתית השכיחה ביותר לעיוורון בקרב אנשים בין הגילאים 20-60, להשפיע על 1.5 מיליון אנשים ברחבי העולם2,3. זה משפחה הטרוגנית של הפרעות רשתית תורשתיות מאופיין על ידי אובדן הדרגתי של photoreceptors (PRs) ואחריו ניוון של אפיתל הפיגמנט ברשתית, לאחר מכן, gliosis ובניה של נוירונים הפנימית4. הקורס של המחלה יכולה להיות מוסברת על ידי אובדן מצטבר שני סוגי יחסי ציבור תא, מתחיל בדרך כלל עם מוטות, אשר אחראים על חזון אכרומטי אור עמום, קונוסים, המהווה מרכיב חיוני עבור צבע חזון, חדות הראייה5. פגם גנטי יחיד מספיקה לגרום RP. עד כה יותר מ-130 מוטציות בגנים מעל 45 קושרו עם מחלת6. זה מוביל פנוטיפים מחלות בדרגות שונות, היא אחת הסיבות לכך ריפוי גנטי שאינו להכליל ובכך גישה טיפולית מסובכים. לכן, יש צורך דחוף לפתח גישות טיפוליות כללי חדש לטיפול degenerations רשתית במסנוור מחלות.
ניוון הרשתית לעתים קרובות כרוך אובדן יחסי ציבור; לכן, מוות של תאים PR הוא סימן היכר של התהליכים ניווניות הרשתית7. זה כבר הוכח כי מוות של תאים יחסי ציבור מעוררת מולר עכשיו, דונלד תא (MC) הפעלת והתפשטות8. MCs, הסוג של תא גליה הגדולות ב הרשתית חוליות, נחשבו בעבר להיות לא יותר מאשר "דבק" בין הנוירונים ברשתית. בשנים האחרונות, מחקרים רבים הראו כי MCs לפעול כתמיכה יותר מבני גרידא9. בין הפונקציות השונות, MCs להשתתף גם נוירוג'נסיס ותיקון10. אכן, בתגובה גורמים diffusible של הרשתית המתנוונת, MCs להגדיל באופן משמעותי ביטוי חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP). לכן, GFAP תוויות יכול לשמש כסמן להפעלה MC כתגובה משני פגיעה ברשתית, ניוון11.
לאחרונה, פיתחנו עיבוד הרומן של פגיעה נקודתית באמצעות לייזר לזירוז ניוון רשתית בדג זברה (רזבורה rerio). פגיעה נקודתית יש יתרון ללימוד תהליכים ביולוגיים מסוימים כגון ההעברה של תאים לתוך האתר פצוע ותזמון מדויק של האירועים המתקיימים במהלך התחדשות ברשתית12. יתר על כן, דג זברה הפך חשוב במחקר חזותי בגלל הדמיון בין מערכת הראייה שלה וגם של בעלי החוליות. תכונות היסטולוגית מורפולוגיים ברוטו של האדם ושל teleost retinae להציג כמה הבדלים. בהתאם, retinae האדם, דג זברה מכילים את אותן הכיתות תא מרכזי שאורגן אותו דפוס בשכבות, איפה אור חישה photoreceptors לכבוש את השכבה החיצונית ביותר, בעוד הנוירונים ברשתית הקרנה, תאי גנגליון, שוכנים לנגדו שכבת עצביים, מקורב על העדשה. את interneurons ברשתית, אמקרין, הפרעה דו קוטבית, תאים אופקיים, להתאים בין קולט אור, גנגליון תא שכבות13. יתר על כן, הרשתית דג זברה הוא נשלט-חרוט, ולכן קרוב יותר הרשתית האנושית מאשר, למשל, הרשתית מכרסמים למד באופן אינטנסיבי. הבדל מרתק בין teleost לבין היונקים הוא נוירוג'נסיס מתמיד דגים רשתית, חידוש ברשתית לאחר נזק. דג זברה, MCs יכול dedifferentiate, לתווך התחדשות רשתית נפצעו14,15. עוף, MCs יש יכולת גם להזין מחדש את מחזור התא, dedifferentiate. בעקבות פגיעה ברשתית בדגים הבוגרים, MCs לאמץ מאפיינים מסוימים של קדמון, תאי גזע, להגר ברשתית הרקמה הפגועה, לייצר נוירונים חדשים16. ג'ין ביטוי פרופיל של MCs יונקים חשף דמיון לא צפוי אבות ברשתית, וגדל ראיות על הפוטנציאל neurogenic מהותי של MCs עוף, מכרסם, רשתית העין האנושית אפילו17. ובכל זאת, למה התגובה משובי ציפורים, יונקים מושווה נמוך עם תגובת חזקים ב דגים הוא לא הבנתם. לכן, הבנת מנגנוני תיקון אנדוגני דג זברה יכול להציע אסטרטגיות עבור התחדשות ברשתית מגרה יונקים ובבני אדם. העסקת מנגנון תיקון אנדוגני של MCs כמכשיר טיפולי לטיפול של חולים עם ניוון הרשתית תהיה השפעה יוצאת דופן בחברה שלנו.
במסמך זה, אנו מספקים את השלבים הנחוצים להפיכת להעסיק את המודל ניוון/התחדשות במחקר אופטלמולוגיות. אנחנו התמקדנו קודם גרימת נזק מוקד ברשתית neurosensory, ואז על ההדמיה של אירועים פיתוח אתר הפציעה, ו סוף סוף להמחיש במעורבות MCs סמוכים. פרוטוקול כללי קל יחסית לבצע ופותח מגוון רחב של אפשרויות להערכת הרשתית לאחר מכן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויים דבקה ההצהרה עבור שימוש של בעלי החיים לרפואת עיניים ומחקר החזון של האגודה לחקר רפואת עיניים (ארוו) וחזון ולכבד את תקנות הקשורות מרשויות השלטון-
1. חיות
- לשמור על TgBAC (gfap:gfap-GFP) זן (אלב) 167 דג זברה בגילאי 6-9 חודשים בתנאים סטנדרטיים במים עם טמפרטורת 26.5 ° C עד 18/כהה מחזור 18 14/10 h.
- עקוב אחר ההנחיות טיפול בבעלי חיים של המוסדות המעורבים לניסויים בבעלי חיים לאחר אישור על ידי הרשויות הממשלתיות.
2. הרדמה מערכתית הפיך
- להכין הפתרון מניות של אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate מלח (tricaine) על ידי המסת 400 מ ג של אבקת tricaine ב mL 97.9 מיכל מים ו- 2.1 מ של 1 מ' של טריס buffered תמיסת מלח (TBS). התאם ל pH 7.0 מ' 1 טריס (pH 9), חנות-4 מעלות צלזיוס עד חודש אחד כהה.
הערה: Tricaine צריך להיות מוכן בתוך המים כמו תנאי המחייה הטבעי של החיה, רצוי להשתמש המים במיכל המקורי. - לדלל את הפתרון מניות 1:25 בתוך מיכל המים ולהשתמש מיד.
- למקם את דג זברה 10 ס מ פטרי המכילות 50 מ של הרדמה פתרון עד שהם הופכים משותק אינם מגיבים לגירויים חיצוניים (כ 2-5 דקות, תלוי משקל וגיל).
- להעביר כל דג בעבודת יד בעל פין סיליקון בהזמנה אישית עבור טיפול לייזר ( איור 1 א').
זהירות! הדג יכול להישאר anesthetized מחוץ למיכל עבור עד 10 דקות בלבד- - להיפוך הרדמה לאחר טיפול ו/או הדמיה, למקם את דג זברה במיכל המכיל המים במיכל.
- כדי לתמוך השחזור, ליצור זרם של המים במיכל טריים מעל הגג על ידי העברת את דג זברה הלוך ושוב בתוך המים.
3. לייזר פגיעה נקודתית על הרשתית
הערה: א 532 ננומטר דיודת לייזר משמש כדי ליצור מוקד נזק האור על הרשתית של דג זברה. הסידור ניסיוני של הלייזר מאפשר הקמת פגיעה ברשתית מוקד לשחזור של דג זברה בוגרת.
- להגדיר את הפלט עוצמת הלייזר: 70 mW; קוטר אווירי: 50 מיקרומטר; משך פעימה: גב' 100
זהירות! השימוש של אור לייזר דורש הגנה אישית המתאימה וסימון של האזור. - להחיל 1-2 טיפות של 2% hydroxypropylmethylcellulose topically בעיניים לפני הטיפול ולהשתמש 2.0 מ מ הפונדוס לייזר העדשה למקד את קרן הלייזר-מכוון על הרשתית-
זהירות! hydroxypropylmethylcellulose טיפות צמיגה, עלול לגרום לבעיות נשימה, אם זה ממשיך הזימים. - מקום ארבעה כתמים בלייזר סביב עצב הראייה בצד השמאל העין ולהשתמש העין נכון, לא מטופל כמו בקרה פנימית-
4. אין ויוו הדמיה של המורפולוגיה רשתית
- ביום 0, להמחיש הרשתית דג זברה ישירות לאחר אינדוקציה לייזר בלי להחיות אותם מן ההרדמה. נקודות פעם כל אחרות, מעסיקים הרדמה כללית (ראה סעיף 2: הרדמה מערכתית הפיך). מניחים את דג זברה קיבוע על בעל פין סיליקון בהזמנה אישית ( איור 1 B, B.1).
- כדי לקבל תמונות אופטימלית, חתך עדשות מגע הידרוג זמינים מסחרית כדי להתאים את עין דג זברה (Ø = 5.2 מ מ, r = 2.70 מ מ, עובי מרכז = 0.4 מ מ) על-ידי אגרוף חור. למלא את השטח קעורה של העדשה methylcellulose ומניחים אותו על פני הקרנית.
- לצייד את המערכת OCT עם עדשה מנורה ללא מגע שסע 78D.
- למקד את התמונה אינפרא-אדום (IR) ב- IR + מצב OCT ( איור 2 א) כדי להמחיש את הפונדוס של העין ולקחת IR תמונות על ידי לחיצה " ידרשו " לחצן ( איור 2B) כדי להתאים לשפה כתמים על הרשתית באמצעות המערכת לייזר ' תוכנה s. מצב
- Visualize מקטע תלת מימדי של השכבות ברשתית IR + OCT ולקחת את התמונות על ידי לחיצה " ידרשו " לחצן ( איור 2B). לצפות את חומרת פגיעה בשכבה הגרעינית החיצונית (גרת) (ר' סעיף 3: לייזר פגיעה נקודתית על הרשתית) בתמונות האלה.
- להיפוך הרדמה לאחר טיפול ו/או הדמיה של מקם את דג זברה במיכל המכיל המים במיכל.
- כדי לתמוך השחזור, ליצור זרם של המים במיכל טריים מעל הגג על ידי העברת את דג זברה הלוך ושוב בתוך המים.
- לבצע דומה ויוו הדמיה של מורפולוגיה רשתית על יום 1, 3, 7, 14 ושבוע 6-
5. Hematoxylin & אאוזין (H & E) Staining
- המתת חסד דג זברה על ידי צלילה אל תוך קר (4 ° C) פתרון הרדמה על קרח לפחות 10 דקות, enucleate העיניים מיד על ידי אמצעי מלקחיים קטנים מעוקלים.
- לתקן את העיניים כל ב- 4% paraformaldehyde (PFA) בתוך buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 ° C עבור 20 h, ואז מייבשים את הדגימות בסדרה אלכוהול מדורגת (קסילן 100% למשך 5 דקות פעמיים, אתנול 100% למשך 5 דקות פעמיים, אתנול 96% למשך 3 דקות פעמיים, אתנול 70% 3 mi n פעם אחת).
זהירות! מחברים יכול להיות מעצבן העיניים, האף, המסלול בדרכי הנשימה העליונות. כדורגלן הוא חומר מסרטן ידוע אנושי, סיכון הרבייה חשד. - להטביע את הדגימות פרפין, לחתוך קטעים 5 מיקרומטר ברמה של ראש עצב הראייה, לטעון אותם בשקופיות זכוכית-
- כתם הסעיפים deparaffinized 0.1% חומצה hematoxylin פתרון עבור 5 דקות וטבול את השקופיות פעמיים במים מזוקקים לאחר טובלים את השקופיות בתמהיל חומצה הידרוכלורית (2 מ ל 25% מזוקקים HCl ב 250 מ ל מים) ו אמוניה לערבב (2 מ ל 25% אמוניה ב 250 מ ל מים מזוקקים). כתם הסעיפים עם אאוזין גרם תמיסה מימית 0.5% למשך 3 דקות לאחר התפתחות hematoxylin צביעת על-ידי מי ברז במשך לפחות 10 דקות
- הר השקופיות מיובש שרף אקרילי הרכבה בינונית ולבחון את השקופיות במיקרוסקופ אור.
6. אימונוהיסטוכימיה עבור ההפעלה MC
- לחמם הסעיפים deparaffinized במאגר אנטיגן אחזור (טריס-EDTA + דטרגנט ללא יונית 0.05%, pH 9.0) למשך 3 דקות של דוד אידוי מזון המתאים או במיקרוגל למשך 10-15 דקות ולשטוף שלוש פעמים עם TBS עבור 5 מינימום לכל.
- מעגל הסעיפים עם סיליקון עט ולהוסיף 100 µL חסימת פתרון (TBS + סרום נורמלי עז 10% + 1% אלבומין שור, pH 7.6) בטמפרטורת החדר במשך ה 1
- הכתם עם נוגדנים polyclonal של הארנב אנטי-גליה חלבון חומצי fibrillary (GFAP) ועם נוגדנים חד שבטיים של העכבר המעביר אנטי-גלוטמין (אלף), שניהם לדילול 1:200 (40 µL עבור דגימה). דגירה השקופית בתוך תא humidified ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. תשטוף שלוש פעמים עם TBS + 0.1% 20 Tween למשך 5 דקות כל אחד.
- סיום ויזואליזציה עם המתאים נוגדנים משניים. פרוטוקול זה משמש ארנב נגד עז IgG H & L ירוקה נוגדנים משניים עבור GFAP ועכבר נגד עז IgG H & L אדום בהיר עבור GS, שניהם לדילול שבערך בטמפרטורת החדר במשך ה 1
- הר השקופיות הרכבה בינונית המכיל דאפי ולבחון את השקופיות תחת המיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OCT בזמן אמת: על מנת לנתח את התפקיד של MCs תיקון ברשתית, השתמשנו מודל פגיעת לייזר גרימת אזור מוגדרים היטב היטב של פגיעה ברשתית דג זברה. האתר של נזק צולמה על-ידי OCT ויוו בפעם הראשונה (יום 0) בתוך 60 דקות לאחר הפגיעה (איור 3). כדי לפצות על המערכת האופטית של העין דגים, עדשות מגע מחוייט הונח על הקרנית. מיד לאחר טיפול לייזר, אות hyper-רעיוני ' מאטום לשקוף ' מקומי הרשתית החיצונית (חיצים). זה המורחבת של האפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) השכבה החיצונית plexiform (OPL). אות דומה היה גם לזיהוי ביום 1. לאחר יום 3, את האות ' מאטום לשקוף ' הפך מאורגן יותר, צפופה. זה היה באופן עקבי ראיתי בשכבה החיצונית גרעינית (גרת) הארכת לשכבה קולט אור. בעקבות בשבוע הראשון (יום 7), חלה ירידה משמעותית בגודל ממוצעת הנגע, רק אות hyper-רעיוני קטן זוהה. החל מן היום ה-14 עד נקודת הזמן האחרון נחקר (שבוע 6), המקומות לייזר היו כבר לא גלוי תמונות IR ו- OCT.
הערכה היסטולוגית של הרשתית ניוון/התחדשות: על מנת לחקור במידה ואת קינטיקה של ניוון רשתית/התחדשות, H & E מכתים הועסק בנקודות זמן שונות לאחר נזק אינדוקציה (יום 0, 1, 3, 7, 14 ו שבוע 6) (איור 4). שלוש עיניים של שלושה דגים נערכו ניסויים. עם זאת, אין ניתוח סטטיסטי בוצעה כמו המטרה של כתב יד זה היא להדגים את השיטה. שינויים עדינים בשכבה הגרעינית הפנימית (להיכנס) גרת ניתן לראות לייזר לתגובה מיידית (למשל, בצקת קלה ב- גרת) ומרחב המערכת מופחתת ב- להיכנס בתוך 60 דקות לאחר הטיפול בלייזר. ניוון עקבו במשך 6 שבועות לאחר אינדוקציה הפגיעה לייזר. שינויים מורפולוגיות נצפו באופן עקבי לאחר יום 1 עם הארגון של PRs ועם צורה חלל את גרת, במרחב subretinal. אכן, היה הפסד של גרעינים בתוך גרת באזור הנזק בין ימים 1 ו- 7. אובדן PR המקסימלי נמצאה ביום 3. החל מ- 14 ימים עד 6 שבועות, הרשתית החיצונית מחדש ביססו מורפולוגיה תקינה שלו.
גליה מעורבות במהלך רשתית ניוון/התחדשות: כדי להעריך MC הפעלה בנקודות זמן שונות (יום 0, 3, 14) בעקבות אינדוקציה של ניוון רשתית, ביצענו ניתוח immunohistochemical עבור הסמנים תא גליה GS ו GFAP (איור 5). שוב נערכו ניסויים שלוש עיניים של שלושה דגים ללא אנליזה כמותית. GS ממלא תפקיד חשוב בשליטה על הרמה של גלוטמט חוץ-תאית, ונחשב לבוא לידי ביטוי באופן בלעדי MC וראשה שלה19,של תהליכים20. GFAP הוא upregulated במהלך ההזדקנות, כאשר הרשתית פגום או לחוץ. זה הוא מקומי ב- MC הסוף-הרגליים ומעבד21. הביטוי GFAP חלש נמצאה גם בחלק הפנימי של הרשתית שציווית בקרת labelling תא גליה סוגים אחרים, למשל, האסטרוציטים. Autofluorescence המקטעים החיצוני יחסי ציבור גם סיפק אות ב גרת אבל זה יכול להיות. האות GFAP היה upregulated-יום 3 לאחר פציעה. ובכך, ביצע ניתוחים יום 3 לאחר הטיפול בלייזר הראה GFAP-חיוביות MCs רק בתוך האתר פציעה גרת של הרשתית. מיום 14, ההתחדשות הושלם ברובו, האות GFAP היה downregulated לרמה בסיסית באזור הנזק. בניגוד GFAP שאין כל שינוי ניכר ברמת הביטוי GS. עם זאת, אולי היתה downregulation המותאמות לשפות אחרות של GS באתר של הפגיעה.
איור 1: הכנה אינדוקציה של הפגיעה לייזר של דג זברה הרשתית ובעקבות ניתוח OCT. (א) הסדר של מערכת לייזר לפני הטיפול. דג זברה (A.1) דגש על סיליקון מחזיק pin עם עדשות מגע הפונדוס במקום רק לפני היישום של קרן הלייזר. (ב) סידור המערכת OCT לפני הדמיה. דג זברה (B.1) הממוקמים לפני 78D שסע המנורה עדשה לפני הגילוי של האתרים נזק על-ידי באוקטובר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הגדרת לרכישת תמונות IR ו OCT. (א) מסך של חלון התוכנה במהלך דימות. מצבי IR ו- OCT מתוארים. (ב) סקירה של הפאנל המשמש כדי לרכוש את התמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: IR (משמאל) ותמונות (מימין) OCT של האתרים פצוע, שציווית של הרשתית נמצאים באותה עין בזמן שונה הנקודות (יום 0, 1, 3, 7, 14 ושבוע 6) לאחר לייזר המושרה ניוון הרשתית. של תמונות IR, הקופסה הירוקה מציינת החלק של הרשתית יש להיות מנותח, הקו הירוק מראה את המיקום של תמונות OCT על הרשתית. חיצים מציינים אתרי נקודות לייזר מזוהה כמו אותות hyper-רעיוני בבר באוקטובר סולם = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: H & E מכתימה את הפצועים ואת את contralateral שציווית עין דג זברה בזמן שונה הנקודות (יום 0, 1, 3, 7, 14 ושבוע 6) לאחר לייזר המושרה ניוון הרשתית. GC, גנגליון שכבת תאים; להיכנס, השכבה הפנימית גרעינית; גרת, השכבה החיצונית גרעינית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: Immunohistochemical זיהוי של הפעלת MC- GFAP (ירוק) ו- GS (אדום) צביעת ברשתית דג זברה פצועים וקורבנות שציווית בזמן שונה הנקודות (יום 0, 3, 14) לאחר לייזר המושרה ניוון הרשתית. האות ירוק ב גרת נובע autofluorescence של "או" יחסי ציבורuter מקטעים. גרעין התא מוכתמים דאפי (כחול). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התחדשות/ניוון הרשתית דג זברה נחקר על ידי גישות שונות כגון מוות תא בתיווך cytotoxin22, פגיעה מכנית23פציעה תרמי24. אנחנו מועסקים 532 ננומטר דיודת לייזר לפגיעה ברשתית דג זברה. ובכך, המודל שלנו מציע מספר יתרונות. למשל, במהירות יצרנו אזור מוגדר היטב של פגיעה מקומית הרשתית החיצונית, במיוחד ברובד PRs. יתר על כן, ניתן לשנות את הגדרת ניסיוני לייצר אזורים גדולים של נזק ללמוד תהליכים ביולוגיים אחרים, לדוגמה, על-ידי פגיעה ממברנה של ברוך לזירוז neovascularization כורוידאלית. יש נזק מינימלי, העיתוי של התגובה הרגנרציה יכולה להיות מאופנן בדיוק, reproducibly.
כדי לבצע את השינויים פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר לאורך זמן, אנחנו מועסקים המערכת היידלברג Spectralis, התוכנה Explorer העין היידלברג. לפיכך, הדמיה הפונדוס IR נמצאה להיות שימושי במיוחד דג זברה. בניגוד הפונדוס autofluorescence (AF), אשר מציג ניגודיות נמוכה בין נקודת לייזר וסביבתה, האתרים פגום הם יותר קל להתאים לשפה על-ידי הדמיה IR. זה מאפשר לנו לזהות שינויים וכדי לפקח התחדשות ויוו, אשר לא יהיה אפשרי עם מצב AF. כפי שדווחה בעבר25, OCT ניתן לעקוב אחר תהליכים ניווניים משובי ברשתית דג זברה. במודל שלנו, פגיעה ברשתית לייזר זוהה כלהקה hyper-רעיוני ב גרת (איור 3), בדומה מה שדווח יונקים26. במהלך התחדשות, האות hyper-רעיוני ירד עד שנעלם לגמרי ביום 14.
הדימויים OCT היו בקורלציה עם שינויים מורפולוגיים בתוך נגעים לייזר (איור 4). האות hyper-רעיוני מפוזר ב OCT תמונות (יום 0) מייצג את השינויים לייזר שלאחר ראיתי את להיכנס של דג זברה מורדמים בתוך שעה לאחר הטיפול בלייזר. האות hyper-רעיוני עדין ומתווים היטב זוהה ביום 3 מקביל היווצרות חלל ב- גרת בשל אובדן רוד. החל מיום 14 OCT שני ניתוחים היסטולוגית לאשר כי הרשתית החיצונית מחדש הוקמו מורפולוגיה תקינה שלו.
במחקר הנוכחי, אנחנו גם להעריך את התגובה MC במהלך התחדשות ברשתית (איור 5). קבוצות רבות כבר חקרו את ההפעלה של תאי גליה, במיוחד של MCs, בתור מענה משובי הראשונית נזק. ליתר דיוק, הם הציעו כי הפעלת MC pathophysiological עשוי לגרום MCs לאמץ את מאפייני תא גזע, המספקת מקור אנדוגני של תפקוד התא הסוגים החדשים ניתן לשלב אזורים פגועים של הרשתית27. כצפוי, מצאנו כי פגיעה ברשתית לייזר מגורה MC ההפעלה כפי שצוין על ידי קולטנים upregulation של GFAP. אכן, ביטוי GFAP מוגברת זוהה להפליא-3 ימים לאחר פציעה, היה מוגבל לאזור נזק. החל מן היום ה-14, ההתחדשות הושלם ברובו, האות GFAP היה downregulated לרמה בסיסית באזור הנזק. לפיכך, הראו כי MCs לשחק תפקיד פעיל רה-ארגון רשתית, ועל פוטנציאל התחדשות, בעקבות פגיעה.
לסיכום, המודל לייזר המושרה ברשתית ניוון/התחדשות הוא כלי רב-תכליתי לייצר נזק מהיר ולא מוקד הרשתית דג זברה, התחדשות הבאים, ניתן לאבחן על ידי הדמיה לא פולשנית OCT. בנוסף, הצלחנו להראות כי ניוון הרשתית לייזר מלווה MC הפעלה, כי gliosis שהתפתח מתהפך על התחדשות. עם זאת, חקירה מפורטת של סוגי תאים מעורב (למשל, מיקרוגלייה, מקרופאגים) ושל משעולים צריך להתבצע. שינויים קריטיים עשוי להיות נחוץ, במיוחד לחיות מעקב אחר MCs כדי להבין טוב יותר את אופן פעולתן בעת תהליך הרגנרציה (למשל, העברה מהמיקום המקורי שלהם ב- להיכנס לתוך הרשתית החיצונית, במיוחד ברובד PRs) . ובידול שלהם כלפי ציבור תאים לחלופין, פרדיגמות נזק קל יכול לשמש כדי לגרום הפסד נרחבת ועקבית של רוד והן חרוט PRs28. עם זאת, היתרון של המודל המתואר הוא אזור הפציעה מוגדרים יותר שבה אחד יכול ללמוד המקומי אינטראקציות בין photoreceptors המתנוונת MCs מופעל.
באופן כללי, אנו מאמינים כי המודל יעזור להבין טוב יותר תהליכים ניווניים משובי ברשתית חושית, עשוי לאפשר ההשוואה של פיתוחים אלה עם מערכת יונקים. זה יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעה של מערכת החיסון המולדת ואפקטים של חומרים neuroactive. בעתיד, אחד יוכל להשתמש תוצאות אלה כדי לשנות את מערכת הראייה האנושית המתנוונת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים מרטין Zinkernagel, MD, PhD, מרים Reisenhofer, PhD לקלט המדעי שלה להקים את הדגם ואת Federica Bisignani לסיוע טכני מעולה שלה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
