Summary
Die beschriebenen RNA in Situ Hybridisierung Protokoll ermöglicht die Erkennung von RNA in ganze Drosophila Embryos oder seziert Gewebe. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und Tyramide Signalverstärkung, können Protokolle mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Durchsatz und bei relativ geringen Kosten erkannt werden.
Abstract
In unseren Bemühungen, die Muster des Ausdrucks und subzelluläre Lokalisation der Drosophila RNAs auf einer genomweiten Basis zu bestimmen und in einer Vielzahl von Geweben haben wir zahlreiche Änderungen und Verbesserungen zu unserer ursprünglichen fluoreszierende in-situ entwickelt Hybridisierung (FISH)-Protokoll. Um Durchsatz und Wirtschaftlichkeit zu erleichtern, werden alle Schritte, von der Sonde Generation zur Signalerfassung, mit Exon 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt. Digoxygenin (DIG)-gekennzeichneten Antisense RNA-Sonden entstehen mit cDNA Klonen oder genomischer DNA als Vorlage. Nach Gewebe Fixierung und Permeabilisierung Sonden sind hybridisiert, Abschriften von Interesse und dann erkannten mit einer Reihe von Anti-DIG-Antikörper konjugiert, Biotin, Streptavidin konjugiert, Meerrettich-Peroxidase (HRP) und Gewebekulturen konjugiert Tyramide, die in Anwesenheit von HRP, hochreaktive Intermediate produziert, das Elektron Dichte Regionen unmittelbar neben Proteine bindet. Verstärkung und Lokalisierung folgendermaßen erzeugen eine robust und stark lokalisierte Signal, die beide zellulärer und subzellulärer Transkript Lokalisierung erleichtert. Die Protokolle zur Verfügung gestellt wurden optimiert, um hochspezifische Signale in einer Vielzahl von Geweben und Entwicklungsstufen zu produzieren. Referenzen sind ebenfalls zusätzliche Variationen geboten, die es die simultane Detektion von mehreren Abschriften, oder Abschriften und Proteine, zur gleichen Zeit ermöglichen.
Introduction
Neue genomweiten RNA Nachweismethoden wie RNA-Seq haben unser Wissen wann und wo Gene exprimiert werden, und was1Ebenen stark ausgebaut. Allerdings bieten diese relativ geringe zeitlichen und räumlichen Auflösung. RNA in Situ Hybridisierung ermöglicht die räumliche Verteilung der Transkripte in festen Geweben, visuell beobachtet werden, so offenbart die Details von zellulärer und subzellulärer Lokalisierung2. Mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) können noch mehr räumlichen Auflösung, da es den Einsatz von leistungsfähigen Mikroskopiertechniken, wie konfokale und leichte Blatt Mikroskopie3erlaubt. Fluoreszierende Markierungen wie DAPI können auch verwendet werden, subzelluläre Beziehungen4herstellen. Fisch erleichtert auch die Beobachtung von mehreren RNAs und Proteine gleichzeitig mit klaren Angaben Überlappung auf der subzellulären Ebene. Einzigartige Reagenzien und für doppelte Kennzeichnung erforderlichen Schritte finden Sie in den folgenden Referenzen3,5.
Die hier beschriebenen Verfahren nutzen 96-Well-Mikrotiterplatten für alle Schritte, einschließlich cDNA Vorlage Produktion (Kolonie PCR), RNA-Sonde-Produktion (mit T7, T3 oder SP6 Polymerase-abhängige Run-off-Transkription), in Situ Hybridisierung und Fluoreszenzsignal Entwicklung. Ausreichende Zahl von Embryonen oder Gewebe werden hinzugefügt, um jedes gut von 96-Well-Platte Bewertung der Konsistenz und Variabilität zu ermöglichen. Jeder erhält also eine andere Sonde. Nach Signal Entwicklung sind auf einzelne Objektträger für die mikroskopische Analyse Embryonen oder Gewebe aus jedem Brunnen angeordnet.
Die Verwendung von Tyramide Signalverstärkung (TSA) für Sonde Erkennung produziert robuste Signale mit außergewöhnlichen subzelluläre Auflösung 5,6,7,8. Die subzelluläre Lokalisation des RNAs ist ein wichtiger Regulierungsmechanismus 9 , die angezeigt wird mit nahezu allen RNAs 4,10,11auftreten. Diese Analysen haben auch gezeigt, dass viele Transkripte, die nicht durch RNA-Seq erkannt werden durch Fisch 8leicht erkannt werden. Die Anpassung der RNA in Situ Hybridisierung, 96-Well Platten ermöglicht die Analyse von bis zu 96 Gene von Interesse zu einem Zeitpunkt (mehr, wenn zusätzliche Platten verwendet werden), die Analyse von großen Datenmengen ermöglicht. Durch Schneiden der Platten in kleinere Abschnitte, wird die Methode auch einfach nur ein paar Beispiele angepasst. Das Protokoll zur Verfügung gestellt eignet sich zur Analyse der RNA-Distributionen in den meisten Arten von Geweben. Obwohl nicht gezeigt, ist es an nicht-Drosophila Gewebe sowie anpassbar.
Protocol
1. PCR Verstärkung von cDNA-Vorlagen von Plasmiden
Hinweis: verwenden Sie qualitativ hochwertige Plasmid oder PCR erzeugten DNA-Templates für RNA-Sonde Synthese. Die Drosophila gen Sammlung (DGC) Bibliotheken generiert durch das Berkeley Drosophila Genome Project deckt die meisten kodierenden Gene in der Taufliege Genom gefunden (siehe Tabelle 1a). Diese ermöglichen auch den Einsatz von universal Primer für die Amplifikation des cDNA-Einsatz. Diese PCR-Verstärkungen erfolgen auf Plasmid DNA in die Lysates Plasmid-haltigen Bakterienkulturen vorhanden. Die DNA-Produkte dienen dann als Vorlagen für in-vitro- Transkription, um antisense RNA-Sonden zu generieren (siehe Tabelle 1 b).
- Design verstärken eine bestimmten Exon-Region eines Gens von Interesse durch PCR Zündkapseln (zB. aus genomischer DNA), vorzugsweise mit der T7 Polymerase Anerkennung Website am Ende antisense.
- Für Experimente mit weniger als 96 Proben, nicht benötigte Teile des 96-Well Platten abgeschnitten. Abdeckplatten mit Dichtung tape (siehe Materialien) für alle Inkubationen und Lagerung. Mikrozentrifugenröhrchen verwendet, Mengen entsprechend anpassen.
Hinweis: 96-Well Platten erlauben die Verwendung von Mehrkanal-Pipetten für erhöhten Durchsatz sowie kleinere Volumina für Kosteneinsparung.
| Tabelle 1a | ||||
Vektor | Antibiotika arbeiten Konzentration 1: 1000 |
Primer | RNA-Polymerase für Antisense | RNA-Polymerase. für Sinne |
| pFLC-ich | Amp | pBst_SK (-) _F/R | T3 | T7 |
| pBSt(-) | Amp | pBSt_SK(-) | T7 | T3 |
| pOT2 | Chlor | pOT2_F/R | SP6 | T7 |
| pOTB7 | Chlor | pOT2_F/R | T7 | SP6 |
| Tabelle 1 b | ||||
| Primer | Sequenz | |||
| pOT2_Forward | 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 ' | |||
| pOT2_Reverse | 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 ' | |||
| pBst_SK (-) _Forward | 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 ' | |||
| pBst_SK (-) _Reverse | 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 ' | |||
Tabelle 1: A) General DGC Klon Informationen zur Verstärkung cDNA fügt in Plasmiden. (B) Sequenzen von Universal Primer für DGC Plasmide.
- wachsen 250 µL Plasmid-haltigen Bakterienkultur in 96-Well-Kultur-Platten durch Zugabe von 240 µL LB Medien pro Bohrloch mit der richtigen Antibiotika-Auswahl (1: 1000 Verdünnung einer 1000 X Antibiotika Aktie) und 10 µL des Originals Plasmid-haltige Bakterien (aus einem Glycerin-bestand). Abdichtung mit Dichtband.
- Inkubation durch Schütteln bei 215 u/min bei 37 ° C über Nacht (O/N).
Hinweis: Stellen Sie eine neue Kopie des bakteriellen Glycerin cDNA Plasmid Klon Lager um das Original zu ersetzen. Nicht wieder einfrieren ursprünglichen bakteriellen bestand, wie dies die Bakterien töten kann. - , Die PCR-Vorlagen zu produzieren verdünnen 10 µL der O/N Bakterienkultur in 90 µL autoklaviert DdH 2 O in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-PCR-Platte. Denaturieren Sie die DNA für 5 min bei 95 ° C im Thermocycler. Platzieren Sie die Platte sofort auf Eis für mindestens 5 min.
- Bereiten PCR-Reaktionen mit entsprechenden universal Primer gem. Tabelle 2.
| Reagenzien | 50 μl Probe Reaktion | 96 gut mischen (112 X Reaktion) | Endkonzentration |
| 2 X PCR Polymerase Mix | 25 μl | 2800 µl | 1 X |
| Primer_For (25 Pmol/μl) | 0,5 μl | 5 6 μl | 0,25 Pmol/μl |
| Primer_Rev (25 Pmol/μl) | 0,5 μl | 56 μl | 0,25 Pmol/μl |
| ddH2O | 22 µl | 2464 μl | < /TR > |
| insgesamt | 48 μl | 5376 μl |
Tabelle 2: PCR Master Mix.
- mit einer Pipette, aliquoten 48 µL des PCR-master-Mix in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-PCR-Platte. Fügen Sie 2 µL jeder denaturierten Plasmid-DNA-Vorlage pro Bohrloch.
Hinweis: Verwendung zwischen 1 Picogram (Pg), 1 Nanogramm (ng) von Plasmid DNA. Übermäßige DNA Schablone reduziert PCR Ertrag und Spezifität. - 96-Well-PCR-Maschine gemäß Tabelle 3 zu programmieren und die Verstärkung führen.
Hinweis: Die Verlängerungszeit bei 72° C wird bestimmt durch die Größe des PCR Produktes (45 s für ≤ 2,0 kb, 1,5 min für ≤ 3,0 kb, 3 min für ≤ 4,0 kb und 3,5 min für 4.0-5.0 kb). Die Anlasstemperatur (Tm) richtet sich nach der Reihenfolge der Primer. Wenn eine Primer ist gleich oder länger als 20 nt, das Tm wird wie folgt berechnet:
Tm (° C) = (4 X Anzahl der CG) + (2 X Anzahl der AT)-4.
| Schritt | Temperatur | Zeit | Zyklen |
| Erste Denaturierung | 95 ° C | 3 min | 1 Zyklus |
| Verstärkung Denaturierung, Glühen und Erweiterung | 95 ° C | 45 sec | < td Zeile Span = "3" > 30 Zyklen|
| 54-58 ° C | 45 sec | ||
| 72 ° C | 45 sec-3,5 min | ||
| Letzte Verlängerung | 72 ° C | 7 min | 1 Zyklus |
| Lagerung | 4 ° C | halten |
Tabelle 3: PCR-Programm empfohlen.
- PCR Produkt Fällung mit Ethanol (EtOH) und Natrium Acetat (NaOAC) (siehe Tabelle 4).
Hinweis: Wenn die PCR Reaktionsvolumen weniger als 50 µL ist, füllen Sie zu 50 µL mit DdH 2 O.- , Überstürzen sich die DNA, mischen Sie den Komponenten aus Tabelle 4 und Store Proben O/N bei-20 ° C oder für 30 min bei-80 °C.Centrifuge 96-Well-Platte für 45-60 min bei 2.250 x g bei 4 ° C. Verwendung eines 8-Kanal vielfältigen Pipette auf carefully entfernen des Überstands. Waschen mit 160 µL von kaltem 70 % EtOH (RNase-freie) für 30 min bei 2.250 x g bei 4 ° c
Hinweis: Die ausgefällte DNA kann am unteren Brunnen eingesehen werden. Kürzere PCR-Produkte erfordern eine längere Centrifugations. - Sanft Invertieren der 96-Well-Platte auf einem Papiertuch entfernen Sie die letzten Tropfen der Flüssigkeit in jedes gut (soweit möglich). DNA-Pellet für 1 h bei Raumtemperatur (RT) der Luft trocknen lassen. Die ausgefällte DNA in 25 µL RNase freies Wasser Aufschwemmen.
Hinweis: Die 1 h Luft trocknen ermöglicht es alle Spuren von EtOH zu verdampfen. Ein sehr kleines Volumen der Flüssigkeit (ca. 1 µL) sollte jedoch in jedem Bohrloch zu verhindern, dass das DNA-Pellet vollständig trocknen bleiben. Verwenden Sie 25 µL für eine 50 µL-PCR-Reaktion. Kein Wasser verwenden, DEPC behandelt in diesem Stadium zur Vermeidung von Interferenzen mit in-vitro- Transkription in den folgenden Schritten.
- , Überstürzen sich die DNA, mischen Sie den Komponenten aus Tabelle 4 und Store Proben O/N bei-20 ° C oder für 30 min bei-80 °C.Centrifuge 96-Well-Platte für 45-60 min bei 2.250 x g bei 4 ° C. Verwendung eines 8-Kanal vielfältigen Pipette auf carefully entfernen des Überstands. Waschen mit 160 µL von kaltem 70 % EtOH (RNase-freie) für 30 min bei 2.250 x g bei 4 ° c
| Komponente | Volumen | Teil |
| PCR | 50 μl | |
| 100 % Ethanol | 125 μl | 2,5 X Bd. von PCR |
| 3 M NaOAc (pH = 5,2, RNase frei) | 5 µl | 10 % Vol. PCR |
| insgesamt | 180 μl |
Tabelle 4: Beispiel einer PCR-Reaktion von 50 µL.
- Überprüfen Sie die Größe und den Ertrag der PCR-Produkte von 5 µL der resuspendierte DNA-Lösung auf einem 1 % Agarose-Gel in 1 X TAE-Puffer läuft.
Hinweis: Insgesamt 250-500 ng DNA-Vorlage ist erforderlich für die 15 µL in Vitro Transkription Reaktion. Proben mit höheren Erträgen können weiter verdünnt werden. Die RNA-Ausbeute hängt auch von der Reihenfolge und Länge der DNA-Vorlage. Gemäß der allgemeinen Leitfaden für DIG-RNA Etikettierung mit T7-RNA-Polymerase, entsteht etwa 10 µg RNA DIG-Label von 1 µg linearisierten Vorlage.
2. In-vitro- Transkription antisense Sonden generieren.
Hinweis: Es ist entscheidend, in einer RNase-freie Umgebung arbeiten. Alle Reagenzien und Lab-Ware muss RNase frei (z. B. zertifizierte DNase/RNase-freie Kunststoff Ware).
| Komponente | Lager Konzentration | Volumen | Endkonzentration |
| ATP | 100 mM | 7 µl | 10 mM |
| CTP | 100 mM | 7 µl | 10 mM |
| GTP | 100 mM | 7 & # 956; l | 10 mM |
| UTP | 100 mM | 4,5 µl | 6,5 mM |
| Dig-11-UTP | 10 mM | 25 μl | 3,5 mM |
| RNase freies Wasser | < /td > | 19,5 μl | |
| Total | 70 μl |
Tabelle 5: DIG-NTP-Mix Vorbereitung.
< Tabelle Border = "1" Fo:keep-together.within-Seite = "1" Fo:keep-mit-next.within-Seite "immer" = >(112 X Reaktion)
Tabelle 6:2 X Transkription Master Mix.
- Vorbereitung der DIG-NTP Mischung gemäß Tabelle 5.
Hinweis: Um Fehler zu vermeiden, immer die Platte ausrichten, dass A1 in der oberen linken Ecke der Platte ist. - Add-Komponenten, die in Tabelle 6 in jede Vertiefung in eine neue 96-Well-PCR-Platte (Sonde Platte) beschrieben. 7.5 µL des PCR-Produktes (DNA Schablone) hinzu kommt jeweils entsprechend gut, mit einer Mehrkanal-Pipette. Die Abdeckplatte mit Dichtband.
Hinweis: Die optimale Menge des PCR Produktes pro Transkription Reaktion hinzugefügt sollte zwischen 0,5 und 1 µg liegen. Wenn Bands auf dem Gel deutlich schwächer oder stärker sind, kann das Volumen der DNA hinzugefügt, um die Reaktion entsprechend angepasst werden. Der genaue Betrag ist nicht entscheidend. - Die Sonde Platte bei 37 ° C inkubieren, 3,5-4 h Mix 15 µL synthetisierten Sonde mit 35 µL DEPC DdH 2 O, 125 µL 100 behandelt % EtOH und 5 µL 3 M NaOAC (pH = 5,2, RNase frei). Speichern bei-80 ° C für mindestens 30 Minuten Zentrifugieren und waschen wie 1.10.2 und 1.10.3 beschrieben.
- Aufschwemmen der ausgefällten Sonde in 25 µL DEPC behandelt DdH 2 O. laufen 5 µL auf einem 1 % Agarose-Gel (Laufzeit < 20 min), überprüfen die Integrität und den Ertrag der Sonde ( Abbildung 2).
Hinweis: Das Agarosegel mit DEPC behandelt DdH 2 O und TAE Puffer erfolgen. Gel-Elektrophorese-Apparatur für RNA zugewiesen werden sollen nur zu arbeiten. Längere Laufzeit bei niedriger Drehzahl Gel zu RNA-Abbau während der Elektrophorese führen kann. - Mischen Sie die restlichen 20 µL der synthetisierten Sonde mit 100 µL Hybridisierung Lösung (Tabelle 7) und Store bei-80 ° C bis benötigt.
Hinweis: Die Sonde Konzentration kann mehr verdünnt werden, wenn Bands sind besonders robust (siehe Abbildung 2 für Beispiele). Hybridisierung Lösung ist sehr effektiv bei der RNase-Kontamination zu verhindern. Fügen Sie Hybridisierung Lösung sofort die resuspendierte Sonde, RNA-Abbau zu vermeiden hinzu. Hybridisierung Lösung muss durch einen 0,2 µm-Filter gefiltert werden. Für Gewebeproben, erhöhen die Waschmittel Konzentration in der Hybridisierung Lösung durch Zugabe von Triton-X-100, eine Endkonzentration von 0,3 %.
| Komponente | Volumen | Endkonzentration |
| DEPC behandelt ddH2O | 11,85 ml | 23,7 % |
| 20 X SSC | 12,5 ml | 25 % (5 X) |
| Formamid | 25 ml | 50 % |
| Heparin (50 mg/ml) | 0,1 ml | 0. 2 % (0,1 mg/ml) |
| Lachs Sperma single stranded DNA | 0,5 ml | 1,0 % |
| Tween-20 | 0,05 ml | 0,1 % |
| Insgesamt | 50,00 ml | 100 % |
3. Drosophila Aufzucht und Embryo, Larven und Erwachsene Gewebe Sammlung.
Hinweis: für kleine Skala (Flaschen) und Masse (Boxen), Aufzucht fliegen, standard-Fly Lab Protokolle für Maismehl basierte Lebensmittel bei 25 ° c halten Sie richtige Larven und Erwachsenen Dichte verwenden und zusätzliche aktive Hefe Pulver auf Nahrung bieten Oberflächen.
- Sammeln Embryonen nach standard-Protokolle. Die wichtigsten Schritte des Embryos Kollektion sind in Abbildung 3 illustriert.
Hinweis: Nach dem Spülen Devitillinized Embryonen in Methanol, können die festen Embryonen bei-20 ° C bis zu einem Jahr aufbewahrt werden. Embryo Permeabilisierung und Post-Fixierung erfolgt am 1. Tag des Protokolls Fisch. - Bereiten frische 40 % PFA-Stammlösung.
- Bereiten Sie einen frisch zubereiteten Stammlösung von 40 % Paraformaldehyd (PFA) durch das Mischen von 10 mL DEPC behandelt DdH 2 O bis 3,68 g PFA und 70 µL 2N KOH in einer 20 mL Glas funkeln Durchstechflasche enthält eine kleine Aufregung bar.
Achtung: PFA ist hochgiftig mit möglichen akuten und chronischen gesundheitlichen Auswirkungen. MSDS (Material Safety Data Sheets) zu lesen und mit angemessenen Schutz für Augen, Haut und Atemwege. - In einer Dampfhaube erhitzen und rühren das Fläschchen für 3-5 min auf einer Heizplatte bei 200 ° C, bis die PFA vollständig aufgelöst ist. Die PFA-Stammlösung vom Herd nehmen, sobald die PFA aufgelöst ist (nicht zu heiß).
- Der gelösten 40 % PFA-Stammlösung für 5 min auf Eis abgekühlt und Filtern mit einer 0,2 µm-Filter und 10 mL Spritze.
- Bereiten Sie einen frisch zubereiteten Stammlösung von 40 % Paraformaldehyd (PFA) durch das Mischen von 10 mL DEPC behandelt DdH 2 O bis 3,68 g PFA und 70 µL 2N KOH in einer 20 mL Glas funkeln Durchstechflasche enthält eine kleine Aufregung bar.
- Dritte instar Larven (L3) oder Erwachsene Gewebe Fixierung, abschrecken und Permeabilisierung
Hinweis: dieses Protokoll sollte an einem Tag fertig sein. Freuen Sie sich auf Gewebe Dissektion, Fixierung, abschrecken der endogenen HRP, Permeabilisierung und Post-Fixierung.- Prepare Befestigungslösungen (Fix-ich und Fix-II) gemäß Tabelle 8.
Hinweis: Pikrinsäure dient als eine zusätzliche Fixiermittel Wenn Gewebe hat eine feine Struktur, die bewahrt werden müssen. Es ist keine gute Fixiermittel, wenn Gewebe Ultrastruktur für Elektronenmikroskopie (EM) beibehalten werden muss.
Warnung: Pikrinsäure ist instabil und hat die Fähigkeit, mit anderen Materialien reagieren und explosive Verbindungen zu schaffen. Verwenden und lagern nach Sicherheitsrichtlinien. - Ort-Larven oder Erwachsenen fliegen in ein 50 mL-Kunststoff-Rohr mit 10 mL kalten 1 X PBS und 100 µL der Fix-ich Lösung. Entspannen auf dem Eis für 2 min, Larven oder Erwachsenen fliegen Motilität zu reduzieren.
- Schnitt aus der Spitze von einer 1 mL Kunststoffspitze erstelle ich eine 2-3 mm Öffnung. Transfer von 10-30 Larven oder Erwachsenen fliegt mit 1 mL Spitze in eine Petrischale (9 cm Durchmesser) mit einer flachen Schicht 1 X PBS von 50 mL-Tube (Schritt 3.3.2). Zugabe von ein wenig PBTT kann die Oberflächenspannung verringern. Sorgfältig zu sezieren Larven (geöffnet von anterior und Gewebe vom hinteren zum vorderen drücken) oder adulten Geweben von Interesse mit einer scharfen Zange sezierenden Rahmen.
Hinweis: Ca. 200-300 Larven oder Erwachsenen Hoden können werden seziert und fixiert an einem Tag durch erfahrene Personen. - Transfer Gewebe mit einer 200 µL Pipette (mit der Spitze abgeschnitten erstelle ich einen Durchmesser von 2 mm Öffnung) in einer 1,5 mL-Tube und speichern auf dem Eis zerlegt. Füllen Sie jede Runde der Dissektion innerhalb von 10-15 min bevor mit dem nächsten Schritt voran.
Hinweis: Fahren Sie mit weiteren Runden (innerhalb eines Zeitfensters von 2 h) wie erforderlich, um ausreichend Material zu erzeugen. - Fix-Gewebe mit 800 µL Fix-ich Lösung für 30 min auf einer Bank Top-Mixer. Spülen-Gewebe mit 800 µL 1 X PBTT und Rohre für maximal 2,5 h. aufgrund der 30 min auf Eis halten zu begrenzen, das muss chargenweise durchgeführt werden, bis ausreichend Gewebe gesammelt wurden.
- Pool allen sezierte und feste Geweben in einer einzigen 15 mL Plastikrohr mit Netz im Deckel (siehe Abbildung 4-Tube-Design). Aspirieren Sie überschüssige Flüssigkeit durch das Netz in den Schlauch Deckel. Waschen Sie 3 X 5 min jeweils mit 10 mL 1 X PBTT. Spülen Sie zweimal mit 10 mL 1 X PBS, Reinigungsmittel zu entfernen. Dies verhindert, dass überschüssige Luftblasen in dem nächsten Schritt fort.
Hinweis: Wenn seziert Gewebe an der Unterseite des Rohres zu versenken, Schritte können durchgeführt werden, in regelmäßigen Mikrotiter-Platten oder 0,5-1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (300-800 µL Volumen pro Röhre). - Stillen endogenen HRP-Aktivität mit 5 mL 0,3 % H 2 O 2 mit PBS-Puffer für 15 min bei RT. Wiederholen Sie noch einmal. Halten Sie den Deckel offen während dieses Schritts ohne sich zu vermischen. Zweimal mit 10 mL 1 X PBTT spülen. Waschen zweimal für 5 min mit 10 mL 1 X PBTT.
- Permeabilize Gewebe mit 10 mL 80 % Aceton (-20 ° C, vorab gekühlt) bei-20 ° C für 10 min. invertieren die Röhre zweimal während der Inkubationszeit. Waschen zweimal für 10 min mit 10 mL 1 X PBTT Gewebe zu rehydrieren.
- Spülen mit 10 mL Mischung aus 5 ml PBTT plus 5 ml Hybridisierung Lösung (1:1). Mischung zu verwerfen und mit 10 ml-Hybridisierung-Lösung zu ersetzen. Proben können bei-20 ° C bis benötigt gelagert werden. Für optimale Ergebnisse speichern Sie keine Proben mehr als eine Woche.
- Prepare Befestigungslösungen (Fix-ich und Fix-II) gemäß Tabelle 8.
| Komponente | Fix ich (10 ml) | Fix II (10 ml) |
| 40 % PFA Lager | 1 ml | 1 ml |
| PBTT | 8,99 ml | 9 ml |
| Pikrinsäure Lösung | 10 μl | – |
4. in Situ Hybridisierung
Hinweis: dieser Teil des Protokolls erfordert ein Minimum von 2 Tagen mit Probenvorbereitung, Pre-Hybridisierung und Hybridisierung unter Ort am Tag 1 und Sonde Erkennung der Tag 2. Wenn die Anzahl der Proben ist relativ hoch, wenn nicht vertraut mit dem Protokoll oder ein ganzer Tag nicht möglich ist, sollte das Protokoll in 3 Tagen mit den Schritten der Sonde Erkennung und Signal-Verstärkung aufgeteilt in 2 Tagen durchgeführt werden. Große Anzahl von Embryonen oder seziert Gewebeproben erfordern auch zusätzliche Tage in Anspruch. Ersetzen Sie 1 X PBT seziert Gewebeproben mit 1 X PBTT in allen Schritten, sofern nicht anders angegeben. Zusätzliche Reinigungsmittel ist erforderlich für die Penetration von viele Larven und adulten Geweben, wie Gehirn und Hoden. Obwohl nicht getestet, 1 kann X PBTT auch für Embryonen verwendet werden. Verwenden Sie 100 µL pro Bohrloch für 96-Well Platten und 800 µL für 1,5 mL Röhrchen.
- Pre-Hybridisierung und Hybridisierung
Hinweis: Schritte 4.1.1-4.1.6.2 sind für die Embryos in Situ Hybridisierung. Überspringen Sie für Larven oder Erwachsenen Gewebe in Situ Hybridisierungen diese Schritte.- Entfernen 2 mL feste Embryonen (gespeichert in Methanol bei-20 ° C), eine neue 15 mL Tube. Waschen Sie Embryonen zweimal für 7 min. mit 10 mL Methanol in jedem Waschgang. WASH Embryonen für 7 min. mit 10 mL Mischung aus Methanol und 1 X PBTT (1:1). Waschen Sie Embryonen zweimal für 7 min. mit 10 mL 1 X PBTT rehydrieren.
- Embryo Permeabilisierung Vorbereitung eine fortgeschrittene Proteinase K-Lösung (40 µL/mL) durch eine Verdünnung von 1: 500 von Stammlösung (20 mg/mL). Bei-20 ° c machen eine funktionierende Proteinase K-Lösung durch Verdünnung der Mittelstufe Proteinase K-Lösung 1/15 in 1 X PBTT für eine funktionierende Endkonzentration von 2.667 Ug/mL.
- Permeabilize Embryonen mit 10 mL Proteinase K-Lösung (verwenden Sie weniger für eine kleinere Anzahl von Embryonen) zu arbeiten. Inkubieren Sie das Rohr bei RT, für 13 min. sanft invertieren das Rohr 4 Mal während der Inkubation. Inkubieren Sie die Proben in Proteinase K-Lösung auf Eis für 1 h ohne Vermischung.
Hinweis: Diese relativ langen Inkubationszeit mit verdünnter Proteinase K sorgt für reproduzierbar einheitliche Permeabilisierung und nachfolgenden Färbung. - Während permeabilize Embryonen, machen eine 2 mg/mL Glycin Lösung ab 10 X Lager (20 mg/mL) in 1 X PBTT für ein Gesamtvolumen von 30 mL.
- Entfernen Proteinase K-Lösung, mit 10 mL der Glycin-Lösung (2 mg/mL) spülen und waschen zweimal für 2 min. Spülen Sie dreimal mit 10 mL 1 X PBTT das Glycin entfernen.
- Post-Fixierung der Embryonen.
- Bereiten 10 mL 4 % PFA (1 mL 40 % PFA in 9 mL PBTT, gefiltert durch 0,45 µm-Filter).
- Inkubieren Sie die Proben bei 4 % PFA für 20 min. Waschen 3 X 2 min. lang mit PBTT.
- , Denaturierte Hybridisierung Lösung vorzubereiten, die Hybridisierung Lösung für 5 min kochen. Verwenden Sie für einen volle 96-Well-Platte drei Tuben von 12 mL. Cool auf dem Eis sofort für 5 min.
- Spülen Embryonen einmal mit 10 mL 1 X PBTT: Hybridisierung Lösung (1:1). Zweimal mit 5 mL der Hybridisierung Lösung abspülen. Aliquoten ~ 20 µL pro Bohrloch von Embryonen (30-40 Embryonen) abgerechnet oder festen Gewebe in eine 96-Well-PCR-Platte auf dem Eis. Entfernen Sie Hybridisierung Lösung aus Geweben oder Embryonen mit einer 8-Kanal vielfältigen Pipette ( Abb. 1 / video).
Hinweis: Die vielfältigen Pipette hat eine ‘ nicht mehr ’, die verhindert, dass die Spitzen auf den Boden der Näpfchen und entfernen Beispiels. Für Experimente mit Gewebe, die schweben, Flüssigkeit vorsichtig mit einer 100 µL Pipette entfernen, von oben.
- Hinzufügen 100 µL der denaturierten Hybridisierung Lösung in jede Vertiefung. Pre-hybridisieren Embryonen für ein Minimum von 2,5-3 h bei 56 ° C mit einem Trockenbad Heizung Gerät mit Metall-Perlen (siehe Materialien und Abb. 1).
- Denaturieren 100 µL der vorbereiteten Sonde in einer 96-Well-PCR-Platte mit einem Thermocycler für 5 min bei 80 ° C. sofort Cool für 5 min auf Eis. Pre-Hybridisierung Lösung von Embryonen oder Gewebe zu entfernen. Fügen Sie denaturierte Gen-spezifischen Sonden zu jeder Probe mit Dichtband abdecken und hybridisieren bei 56 ° C für 16-18 h O/N unter Metallperlen in trockenen Bad Heizung Einheit
5. Sonde Erkennung
- Vorwärmen der Lösungen in Tabelle 9 in der Heizeinheit 56 ° C. Sonden aus der Platte entfernen.
Hinweis: Sonden wiederverwendet werden zwischen 2 - 3 Mal wenn bei-80 ° C (nie speichern alle RNA-bei-20 ° C Proben) gelagert. Nach der Hybridisierung, die doppelte stranded RNA ist stabiler als Einzelstrang-RNA, und ist weniger anfällig gegen Beeinträchtigung durch RNase Kontamination.
Wenn einem ein Multi-well-Platte Vakuumfiltration System für Gewebe, eine Sammlung Platte unter die Filterplatte, die Sonden zu sammeln (siehe Video Montage Details) aufgenommen werden sollten. Hybridisierten Gewebe müssen von den regelmäßigen 96-Well Mikrotiterplatte verwendet für die Hybridisierung mit 1,2 µm Pore Größe PVDF-Membranen auf der Unterseite jedes gut übertragen werden.
| Step | vorgewärmt Lösung (56 ° C) | Zeit | Volumen pro Well |
| 1 | Hybridisierung Lösung: PBTT (3:1) | 15 min. | 100 μl |
| 2 | Hybridisierung Lösung: PBTT (3:1) | 15 min. | 100 μl |
| 3 | Hybridisierung Lösung: PBTT (1:1) | 15 min. | 100 μl |
| 4 | Hybridisierung Lösung: PBTT (1:3) | 15 min | 100 μl | 5 | PBTT 3 wäscht | 5 min | 100 μl |
Tabelle 9: Waschen Sonden nach Hybridisierung.
- bei normalen Platten, waschen Proben gemäß Tabelle 9 in einer Feuerungsanlage bei 56 ° C. wenn mit vielfältigen Vakuumsystem, beheizten Lösungen mit Vakuumsystem auf Bank und Lösungen sofort von unten durch Vakuum zu entfernen. Nach dem 3. Waschen mit 1 X PBTT, kann die normale Platte von der Heizung entfernt werden Einheit
- Vorbereiten Antikörper.
- Bereiten 11 mL Primärantikörper Lösung (2,5 µg/mL) ab Lager (1 mg/mL) durch Verdünnung Biotin konjugiert Maus monoklonalen Anti-DIG-Antikörper (siehe Materialliste) in PBTTB (1: 400). Wenn weniger Proben bearbeitet, Mengen entsprechend anpassen.
- Bereiten 11 mL Streptavidin-HRP-Lösung (1 µg/mL) ab Lager (1 mg/mL) durch eine Verdünnung von 1: 1000 Streptavidin-HRP konjugieren (siehe Materialliste) in PBTTB. Wenn weniger Proben verwenden, Mengen entsprechend anpassen.
- Blockieren Embryonen oder Gewebe mit PBTTB (1 % Magermilch in 1 X PBTT) für 20 min auf eine Bank Top Mixer bei RT
Hinweis: Filter PBTTB mit Filterpapier (Klasse 3, 6 µm) vor der Verwendung auf 96-Well-Filterplatten, um die Filter verstopfen zu vermeiden. Anstelle von PBTB, PBTTB (PBTB mit zusätzlichen 0,3 % Triton X 100) wird für alle Gewebe während des Protokolls verwendet. - Inkubieren Embryonen oder Gewebe in Antikörperlösung (100 µL/Well) für 2 h auf Benchtop-Probe-Mixer. Spülen Sie zweimal mit 1 X PBTTB. Waschen Sie 3 X für 5 min und 5 X für 10 min mit PBTTB. Inkubieren Sie Embryonen oder Gewebe mit Streptavidin-HRP-Lösung (100 µL/Well) für 1,5 h mit einem Benchtop-Probe-Mixer. Waschen Sie 2 X 5 min. lang mit PBTTB. Halten Sie Proben in der Dunkelheit ab diesem Zeitpunkt auf.
Hinweis: während alle Antikörper wäscht, wenn Gewebe durch die Deckkraft, produziert von der Milch verloren geht, versuchen Waschen ohne Milch (PBTT statt PBTTB). - Bereiten eine DAPI-Lösung durch Verdünnung 100 X DAPI in PBTTB (1: 100).
- Inkubieren Embryonen oder Gewebe mit DAPI-Lösung (100 µL/Well) für 15 min auf einem Benchtop-Probe-Mixer. Waschen Sie 4 X 10 min mit PBTT. Die 96-Well-Platte mit O/N Proben bei 4 ° C zu speichern oder mit dem nächsten Schritt fortfahren.
Hinweis: Das Verfahren kann hier angehalten.
6. Antikörpernachweis mit Tyramide (siehe Abbildung 5)
Hinweis: hier hausgemachte Cyanin 3 konjugiert Tyramide verwendet wurde, die wurde nach dem Protokoll beschrieben vorbereitet 12 . Wenn viele Experimente durchführen oder viele Proben, das spart viel Geld und ist effektiv im Vergleich zu kommerziellen Reagenzien (aus Erfahrung). Für weniger Experimente und Proben, im Handel erhältlichen Cyanin 3-Tyramide verwendet werden (siehe Material).
- Wash Probe Platten 3 X 5 min mit 1 X PBTT.
- Bereiten Tyramide Aktivierung Puffer (Aktivierung Puffer) mit 0,006 % H 2 O 2 in PBTT (verdünnte 30 % (w/w) H 2 O 2 Lager 1: 5.000). < lich > die Platten mit der Aktivierung Puffer spülen.
- Vorbereiten Cyanin 3-Tyramide-Lösung durch Verdünnung in Aktivierung Puffer in einer 15 mL Tube.
- Für Embryonen, verwenden die Verdünnung 1: 80 (137 µL Cyanin 3-Tyramide in 11 mL Aktivierung Puffer). Verwenden Sie für Larven Gewebe Verdünnung 1: 150 (73 µL Cyanin 3-Tyramide in 11 mL Aktivierung Puffer). Verwenden Sie für Erwachsene Hoden Verdünnung 1: 200 (55 µL Cyanin 3-Tyramide in 11 mL Aktivierung Puffer). Für Erwachsene Eierstöcke verwenden Verdünnung 1: 300 (36 µL Cyanin 3-Tyramide in 11 mL Aktivierung Puffer).
- Inkubieren Sie Proben mit Cyanin-3-Tyramide-Lösung für 2 h auf Benchtop-Probe-Mixer. Spülen Sie viermal mit PBTT. Waschen 6 X 10 min mit PBTT. Waschen 3 X 5 min. mit PBS, das Reinigungsmittel zu entfernen.
- Hinzufügen 150 µL/Well des Anti-Fade Montage Medien. Halten Sie Proben O/N bei 4 ° C zu Geweben oder Embryonen auf dem Boden des Röhrchens sinken lassen. Proben auf Objektträger (unter sezieren Spielraum für Gewebe) montieren und mit Deckglas abdecken. Die Schnittflächen an das Deckglas mit transparenten Nagellack versiegeln.
- Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Hinweis: analysieren Negativkontrolle zunächst um eine Vorstellung von ‘ unspezifische ’ Hintergrund.
Representative Results
Abbildung 6 zeigt Beispiele für Ergebnisse, die mit diesem Verfahren. Die Top 3 Tafeln zeigen Beispiele der frühen Drosophila Embryos (Abbildung 6, Paneele A-C), die nächsten 3 Platten Beispiele der späten Drosophila Embryos mit Signalen in verschiedenen Geweben (Amnioserosa, Muskeln und des Zentralnervensystems, zeigen bzw. (Abbildung 6, Platten D-F). Als nächstes sind Beispiele aus 3. Instar Larven Gewebe (Abbildung 6, Paneele G-J). Platten, K und L zeigen repräsentative Bilder von Erwachsenen Gonaden (Eierstöcke und Hoden, beziehungsweise). Hunderte von Bildern wurden hochgeladen und kommentiert in unsere durchsuchbare "Fluoreszenz in Situ -Fruchtfliege-Datenbank" (FlyFISH (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
Abbildung 1. Gliederung der Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) Protokoll und Schlüssel Ausrüstung. (A) PCR-Amplifikation der cDNA. (B) In-vitro- Transkription, Gen-spezifischen antisense DIG - generieren beschriftet RNA-Sonden in einer 96-Well-Platte (Foto von der Platte in b gezeigt). (C) und (D): Erwachsene (weiblich: männlich Verhältnis 2:1. 300-400 fliegen/Flasche) fliegen dürfen für 3-4 Tage zu Paaren. Embryonen aus einer Nacht Sammlung auf standard Maismehl Essen bei 25 ° C sind an einer gut belüfteten Kunststoff-Box übertragen (1 L Maismehl Essen in einem Container Größe: 8 "X 8" X 3" LWH) oder zu neuen Flaschen halten eine ordnungsgemäße Larven Dichte. Für Gewebe Sammlung sollte aktive Hefe Pulver auf das Essen in 24, 48 h nach der Eiablage (AEL) gestreut werden. (E bis H): Fluoreszenz in Situ Hybridisierung Experimente durchgeführt über 3 aufeinander folgenden Tagen. Verwenden Sie für Embryonen oder Geweben, die nicht schwimmen eine 96-Well-PCR-Platte wie in Foto b mit 8-Kanal-Sauger (Foto c) gezeigt. Verwenden Sie für Gewebe, die schweben, wie die meisten Larven Gewebe einen Filter-Talsohle Teller (Foto d) und entfernen Sie Flüssigkeit von unten mit einem vielfältigen Absauganlage mit niedrigem Druck (Foto e). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Bestimmung der RNA-Sonde Ausbeute. Neu synthetisiert Antisense RNA-Sonden auf einem 1 % Agarose-Gel (5 µL/Bahn) beobachtet. Die Rendite kann (basierend auf der Intensität der Band) kategorisiert werden als "niedrige Rendite" in Bahnen 3 und 10, "typische Rendite" in Gassen 1, 4, 5, 6 und 8 oder "high-Yield" in Bahnen 2, 7, 9, 11 und 12. Verwenden Sie für Proben mit einem "typischen Renditen" 10-15 µL der Sonde in 100 µL für jedes Experiment in Situ Hybridisierung Lösung verdünnt. Proben mit hohen Erträgen der Sonde mit zusätzlichen Hybridisierung Lösung entsprechend der Band Intensität im Vergleich zu einer "typischen Probe" Intensität zu verdünnen. Sollen Sie etwa gleich letzte Sonde Konzentrationen in jede Vertiefung. Der Pfeil zeigt auf eine der "RNA-Sonden", ist das höhere Band auf jeder Bahn die ursprüngliche DNA-Vorlage. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Wichtige Schritte für eine groß angelegte Embryo Sammlung und Fixierung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Hausgemachte Rohr zum Entfernen von Flüssigkeit aus den Larven oder schwimmenden Geweben. Einige Larven und adulten Geweben schweben in Lösung während der Fixierung. Dieses einfache Werkzeug besteht aus einem Nylon-Gewebe im Besitz einer 200 µL Schneiden Spitze, gefolgt von einer 1 mL-Tipp als einen Adapter zum Verbinden mit einer Absauganlage. Flüssigkeit kann sicher entfernt werden, ohne dass jedes Gewebe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Tyramide Signalverstärkung. (1) DIG-markierten antisense RNA-Sonde hybridisiert mit endogenen Sinn RNA. (2) Immuno-Affinität Bindung zwischen Biotin konjugiert Primärantikörper und DIG-UTP. (3) HRP konjugiert Streptavidin bindet Biotin. (4) HRP katalysiert die Cyanin 3-Tyramide und Wasserstoffperoxid Reaktion um kurzlebige Cyanin-3-Tyramide-radikale bilden. (5) Cyanin-3-Tyramide-radikalen binden an Tyrosin Rückstände auf nahe gelegenen Proteine. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6. Vertreter in Situ Hybridisierung Bilder. Jedes Panel zeigt ein Beispiel für eine unterschiedliche RNA (siehe Cyan) und Kerne gebeizt mit DAPI (rot dargestellt). (A-C) Beispiele der frühen Drosophila Embryos. (D, F) Beispiele der späten Drosophila Embryos. (G-J) Beispiele für 3. instar Drosophila Larven Gewebe (Malphigian Tubuli, Mitteldarm, Speicheldrüse und Muskel beziehungsweise). (K) Erwachsenen Eierstock. (L) Erwachsenen Hoden. Jedes Panel zeigt den Namen der das Gen, dem die Sonde zu züchten ist. Skalieren von Balken = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Das beschriebene Protokoll sieht eine reproduzierbare, hochsensiblen und wirtschaftliche Methode zur Detektion von den meisten RNAs in festen Drosophila Embryos oder Gewebe. Obwohl etwas komplizierter, als die mehr traditionell alkalische Phosphatase Methode der Sonde Erkennung verwendet, die Auflösung durch die Fische ist weit größer und die Empfindlichkeit ist vergleichbar oder verbesserte 7,8. Durch die Verwendung von ganzen oder teilweisen Mikrotiter-Platten, können die Protokolle für groß angelegte oder begrenzte Analysen von Genen von Interesse verwendet werden. Es sei darauf hingewiesen, dass die Sonden generiert möglicherweise alle erkennen oder mehrere Transkript Spleiß bildet, es sei denn, Sonden mehr speziell (z.B. einzelne Exons). Obwohl wir Sonden so klein wie 200 Nukleotide mit einigem Erfolg getestet haben, kleinere Sonden tendenziell weniger wirksam und möglicherweise weniger spezifisch. Klar, dieses Protokoll eignet sich nicht für die Erkennung von kleinen Introns, Exons, oder Micro-RNAs verarbeitet.
Obwohl dieser Ansatz einen enzymatischen Schritt verwendet, um die Stärke der Signale zu steigern, erscheint Signalintensität proportional zur Ziel-gen-Expression in einer relativ linear und breite Strecke der Ausdruck Niveaus. Bei höherer Vergrößerung, das Signal wird als Puncta oder Flecken innerhalb von Zellen und Geweben. Für relativ selten Transkripte sind nur ein paar winzige Puncta gesehen. Mit zunehmender Transkript Fülle wachsen diese in Anzahl und Größe. Wie bei einzelnen Moleküls Fisch (SmFISH), einzelne kleine Puncta kann auch einzelne RNAs entsprechen und sollte auch leicht quantifiziert werden mittels Bildgebung und Informatik Software. Vergleiche der veröffentlichten Bilder, die die SmFISH mit Bildern, die wir kuratiert haben die gleichen Ziele vorschlagen, dass die insgesamt, Empfindlichkeit und Auflösung der beiden Methoden relativ ähnlich sind, obwohl dies durch eine strengere Vergleiche getestet werden sollte. Angesichts der viel höheren Kosten des SmFISH, sollte die Methode, die hier zur Verfügung gestellten ähnliche Ergebnisse zu einem Bruchteil der Kosten geben. Jedoch, wenn das Ziel ist es, kleine Abschriften oder Teile von Transkripten zu erkennen, empfiehlt sich SmFISH.
Aufgrund der geringeren Größe des einige Fisch-Sonden kann diese Methode auch eindringende Gewebe besser sein, die groß sind oder haben erhebliche Hindernisse. Jedoch unsere Nutzung der höheren Waschmittel und Gewebe Fixierung und Permeabilisierung zwickt scheinen dieses Problem gelöst haben. Schließlich sollte obwohl für Drosophila Gewebe entwickelt, die hohe Waschmittel Puffer für seziert Gewebe hier beschrieben auch für Drosophila Embryonen sowie die meisten anderen Organismen und Gewebe arbeiten.
Disclosures
Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Finanzielle Unterstützung für dieses Projekt wurde durch einen Zuschuss HMK von Canadian Institutes of Health Research zur Verfügung gestellt (MOP 133473 gewähren).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
| 2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
| 50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
| 96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
| 96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
| Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
| Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
| Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
| AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
| AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
| AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
| Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
| BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
| Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
| Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
| DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
| Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
| Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
| Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
| Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
| Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
| Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
| Mesh - 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
| Mesh - 800 microns | SEFAR - Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
| Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
| Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
| Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
| Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
| PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
| Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
| Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
| PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
| Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
| Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
| Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
| RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
| Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
| RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
| Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
| Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
| Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
| Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
| Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
| Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
| Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
| Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
| Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
| TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | Preparation | ||
| DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
| 1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
| 1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
| 1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
| 1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
- Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Raap, A. K., et al. Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides. Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).
- Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).
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- Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension. Cell. , 719-730 (2009).
- Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs. Genes Dev. 30, 594-609 (2016).
- Zhou, X. L., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules. Dev Biol. 271, 322-338 (2004).
