Summary
Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.
Abstract
Çabalarımızı ifade şekillerinin ve hücre altı Yerelleştirme Drosophila RNA'ların genom-wide olarak belirlemek için ve dokular çeşitli, çok sayıda değişiklik ve iyileştirmeler bizim orijinal floresan için in situ olarak geliştirdiğimiz hibridizasyon (balık) protokolü. Performans ve maliyet etkinliği kolaylaştırmak için sonda nesil sinyal algılama, tüm adımlar exon 96-de microtiter plakaları kullanarak gerçekleştirilir. Digoxygenin (KAZMAK)-etiketli Antisens RNA probları cDNA klonlar veya genomik DNA şablon olarak kullanılarak üretilmektedir. Sonra doku fiksasyon ve permeabilization, sondalar faiz transkript melezleşmiştir ve sonra tespit edilen Anti-KAZMAK antikor bir arkaya kullanarak biotin, horseradish peroksidaz (HRP) Birleşik ve fluorescently Birleşik streptavidin Birleşik tyramide, hemen bitişik proteinler elektron yoğun bölgelere bağlar büyük ölçüde reaktif bir orta üreten HRP, huzurunda. Amplifikasyon ve yerelleştirme adımları her iki hücre ve hücre altı transkript yerelleştirme kolaylaştıran güçlü ve son derece lokalize sinyal üretirler. Sağlanan protokoller doku ve gelişim aşamalarında, çeşitli çok özel sinyalleri üretmek için optimize edilmiştir. Başvurular da aynı anda birden fazla Tutanaklar, veya transkript ve proteinler, algılama aynı anda izin daha fazla varyasyon için sağlanır.
Introduction
Yeni genom çapında RNA algılama yöntemleri RNA-seq gibi büyük ölçüde bizim bilgi ne zaman ve nerede genlerin ifade edilir ve ne1düzeyleri genişletmiştir. Ancak, bunlar nispeten yoksul zamansal ve mekansal çözünürlüğü sağlar. İn situ hibridizasyon RNA transkript görsel olarak sabit dokularda uyması gereken kayma dağılımını böylece hücresel ve hücre altı Yerelleştirme2bilgilerinizi ortaya çıkarmak sağlar. Floresan In situ hibridizasyon (balık) kullanarak sayfayı confocal ve ışık mikroskobu3gibi güçlü mikroskobu tekniklerin kullanılması verdiğinden daha fazla Uzaysal çözünürlük sağlar. Floresan işaretleri DAPI gibi hücre altı ilişkileri4kurmak için de kullanılabilir. Balık aynı zamanda birden çok RNA ve proteinler gözlem örtüşme hücre altı düzeyde net göstergeler ile aynı anda kolaylaştırır. Benzersiz reaktifler ve çift etiketleme için gereken adımları aşağıdaki başvuruları3,5' te bulunabilir.
Burada açıklanan yordamları 96-de microtiter plakaları cDNA şablon üretim (koloni PCR), RNA sonda üretim (T7, T3 veya SP6 polimeraz bağımlı axım transkripsiyon kullanarak), içinde in situ hibridizasyon, dahil olmak üzere tüm adımları için kullanmak ve Floresan sinyal geliştirme. Yeterli sayıda embriyo veya doku her eklenir tutarlılık ve değişkenlik değerlendirilmesi izin vermek için de 96-şey plaka. Her bir farklı sonda o zaman alır. Sonra sinyal geliştirme, embriyo ya da her şey dokulardan mikroskobik analizlerin yapıldığı için bireysel mikroskop slaytlarda dizilmiş.
Tyramide sinyal güçlendirme (TSA) kullanım sonda algılama için olağanüstü hücre altı çözünürlük 5,6,7,8ile sağlam sinyalleri üretir. RNA'ların hücre altı lokalizasyonu hemen hemen tüm RNA'ların 4,10,11ile gerçekleşmesi için görünür bir önemli yasal mekanizma 9 ' dur. Bu analizler da RNA-seq tarafından algılanmaz birçok transkript balık 8tarafından kolayca algılanır göstermiştir. RNA in situ hibridizasyon 96-şey plakaları için uyum analiz ilgi 96 genlerin büyük veri analizini mümkün hale (tabak daha ek izin verirseniz kullanılır) bir anda, sağlar. Plakayı daha küçük bölümler halinde keserek, yöntemi de kolayca sadece birkaç örnekleri için uyarlanmıştır. Gelen doğrulama doku türlerinin çoğu RNA dağıtımları çözümlenmesi için uygundur. Her ne kadar gösterilmez, non -Drosophila dokulara de uyarlanabilir.
Protocol
1. plazmid şablonlardan cDNA amplifikasyon PCR
Not: yüksek kaliteli plazmid kullanın veya DNA PCR tarafından oluşturulan şablonları için RNA sentezi sonda. Berkeley Drosophila Genom Projesi tarafından oluşturulan Drosophila Gene koleksiyonu (DGC) kitaplıkları sağlar kapsamı Drosophila genom bulundu çoğu kodlama genlerin (tablo 1a'ya bakınız). Bunlar aynı zamanda bir cDNA INSERT amplifikasyon evrensel astar kullanımına izin. Bu PCR Arttırımlar plazmid DNA'lar bakteriyel kültürlerde plazmid içeren lysates içinde mevcut üzerinde gerçekleşir. DNA ürünler daha sonra vitro transkripsiyon için şablonlar olarak antianlamlı RNA problar (bkz. tablo 1b) oluşturmak için kullanılır.
- Tasarım bir gen PCR tarafından ilgi belirli exon bölgenin yükseltmek için astar (e.g. genomik DNA dan), tercihen antianlamlı sonuna T7 polimeraz tanıma ücreti ile.
- Az 96 örnekleri ile deneyler için gereksiz kısımlarını 96-şey plakaları kesilmiş. Conta ile kuruyucu (malzemeleri görmek) teyp tüm incubations ve depolama için. Microcentrifuge tüpler kullandıysanız, birimler buna göre ayarlayın.
Not: 96-şey plakaları artan işlem hacmi, aynı zamanda maliyet tasarrufu için daha küçük birimler için çok kanallı Pipetler kullanılmasına izin.
| tablo 1a | ||||
vektör | Antibiyotik konsantrasyonu 1: 1000 çalışma |
Astar | RNA polimeraz için Antisens | RNA polimeraz. için duygusu |
| pFLC-ı | Amp | pBst_SK (-) _F/R | T3 | T7 |
| pBSt(-) | Amp | pBSt_SK(-) | T7 | T3 |
| pOT2 | Chlor | pOT2_F/R | SP6 | T7 |
| pOTB7 | Chlor | pOT2_F/R | T7 | SP6 |
| Tablo 1b | ||||
| Astar | sıra | |||
| pOT2_Forward | 5 '-AAT-GCA-GGT-TAA-CCT-GGC-TTA-TCG-3 ' | |||
| pOT2_Reverse | 5 '-AAC-GCG-GCT-ACA-ATT-AAT-ACA-TAA-CC-3 ' | |||
| pBst_SK (-) _Forward | 5 '-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-ATG-ATT-ACG-CC-3 ' | |||
| pBst_SK (-) _İçeri | 5 '-CGG-CCA-GTG-AAT-TGT-AAT-ACG-ACT-C-3 ' | |||
Tablo 1: A) genel DGC klon bilgi cDNA yükseltecek için plazmid ekler. B) dizileri DGC plazmid için evrensel astar.
- 250 büyümek µL plazmid içeren LB medya uygun antibiyotik seçimi (1: 1000 seyreltme 1000 X antibiyotik stokunun) ile iyi başına 240 µL ve orijinal 10 µL ekleyerek 96-şey kültür plakaları bakteriyel kültüründe Plazmid içeren bakteriler (Stoktan gliserol). Bant mühürleme ile mühür. 215 devir / dakikada 37 ° c gece (O/N) sallayarak
- Incubate.
Not: bakteriyel gliserol cDNA plazmid klon stok orijinal yerine yeni bir kopyasını alın. Bu bakteri öldürmek gibi özgün bakteriyel hisse senedi, refreeze değil.
PCR şablonları üretmek için - O/N bakteri kültürü 90 µL autoclaved GKD 2 O'deki her şey yeni bir 96-şey PCR plaka 10 µL oranında seyreltin. DNA thermocycler 95 ° C'de 5 min için denatüre. Hemen buz en az 5 dakika süreyle plaka yer
- Tablo 2 başına uygun evrensel primerler kullanılarak hazırlamak PCR reaksiyonları.
| reaktifler | 50 μl örnek reaksiyon | 96 karıştırın (112 x reaksiyon) | Final konsantrasyon |
| 2 X PCR polimeraz Mix | 25 μl | 2800 μl | 1 X |
| Primer_For (25 pmol/μl) | 0.5 μl | 5 6 μl | 0,25 pmol/μl |
| Primer_Rev (25 pmol/μl) | 0.5 μl | 56 μl | 0,25 pmol/μl |
| ddH2O | 22 μl | 2464 μl | < /tr > |
| Toplam | 48 μl | 5376 μl |
Tablo 2: PCR Master Mix.
- bir pipet aliquot 48 µL PCR ana Mix yeni 96-şey PCR plaka her kuyuya kullanarak. Her denatüre plazmid DNA şablonunun iyi başına 2 µL ekleyin.
Not: Kullanım 1 nanogram (ng) plazmid DNA için 1 picogram (pg) arasında. Aşırı DNA şablon azaltır PCR verim ve özgüllüğü. - 96-şey PCR makinesi göre Tablo 3 program ve amplifikasyon gerçekleştirmek.
Not: 72° C uzantısı sırasında PCR ürün boyutunu tarafından belirlenir (45 s için ≤ 2,0 kb, 1,5 dk için ≤ 3,0 kb, 3 dk için ≤ 4.0 kb ve 4.0-5.0 kb için 3,5 dk). Tavlama sıcaklığı (Tm) astar sırası tarafından belirlenir. Ne zaman bir astar eşit veya daha uzunsa 20 nt, Tm olarak hesaplanır:
Tm (° C) (4 X CG = sayısı) + (2 X sayısı AT) -4.
| adım | sıcaklık | zaman | Cycle(s) |
| İlk denatürasyon | 95 ° C | 3 dk | 1 döngüsü |
| amplifikasyon denatürasyon, tavlama ve uzantısı | 95 ° C | 45 sn | < td satır span = "3" > 30 devir|
| 54-58 ° C | 45 sn | ||
| 72 ° C | 45 sn-3,5 dk | ||
| Son uzantısı | 7 dk. | 72 ° C | 1 döngüsü |
| Depolama | 4 ° C | tutun |
Tablo 3: önerilen PCR programı.
- PCR ürünü yağış etanol (alkol) ve sodyum asetat (NaOAC) (bkz. Tablo 4).
Not: az 50 µL PCR reaksiyon birimdir, isterseniz 50 µL GKD 2 O. ile doldurun DNA çökelti, 45-60 dk 4 ° C. kullanım bir 8-kanal manifold pipet c de 2.250 x g, 96-şey plaka Tablo 4 ve mağaza örneklerinden O/N-20 ° c veya-80 °C.Centrifuge, 30 dk için bileşenleri karıştırmak için- arefully süpernatant kaldırın. Bir kez soğuk %70 160 µL ile yıkama alkol (RNase free) 2.250 x g 4 de 30 dk ° C.
Not: Çöktürülmüş DNA kuyu alt kısmında görülebilir. Daha kısa PCR ürünleri gerektirir daha uzun centrifugations. - Yavaşça tersine çevirin 96-şey plaka her kuyuda son damla sıvı kaldırmak için kağıt havlu üzerine (mümkün olduğunca). Hava Kuru DNA Pelet (RT) oda sıcaklığında 1 h için. 25 µL RNase free su zarlarını DNA resuspend.
Not: 1 h hava kuru tüm izini sürmek-in alkol buharlaşır için izin verir. Ancak, bir çok küçük hacimli bir sıvı (yaklaşık 1 µL) DNA Pelet tamamen kurumasını önlemek için her şey içinde kalmalıdır. 25 µL 50 µL PCR reaksiyon için kullanın. Tedavi DEPC su vitro transkripsiyon aşağıdaki adımlarda girişimi engellemek için bu aşamada kullanmayın.
- arefully süpernatant kaldırın. Bir kez soğuk %70 160 µL ile yıkama alkol (RNase free) 2.250 x g 4 de 30 dk ° C.
| bileşen | birim | bölümü |
| PCR | 50 μl | |
| %100 etanol | 125 μl | 2.5 X vol. PCR, |
| 3 M NaOAc (pH = 5,2, RNase free) | 5 μl | PCR vol. yüzde 10'u |
| Toplam | 180 μl |
Tablo 4: örnek bir 50 µL PCR tepki.
- kontrol boyutu ve verim PCR ürünlerinin resuspended DNA çözüm 5 µL % 1'özel jel 1 X TAE arabelleği çalıştırarak.
Not: 250-500 ng DNA şablonunun toplam 15 µL vitro transkripsiyon tepki için gereklidir. Örnekleri ile daha yüksek verimleri daha fazla seyreltilmiş. RNA verim de sıra ve DNA şablon uzunluğunu bağlıdır. Kazı-RNA T7 RNA polimeraz ile etiketleme için genel rehber 1 µg doğrusallaştırılmış şablondan KAZMAK etiketli RNA'ın yaklaşık 10 µg üretilir.
2. Vitro transkripsiyon antianlamlı probları oluşturmak için.
Not: RNase free çalışma çok önemlidir. Tüm reaktifler ve laboratuvar-ware RNase (sertifikalı Dnaz/RNase serbest plastik eşya gibi) ücretsiz olmalı.
| bileşen | hisse senedi toplama | hacmi | Nihai toplama |
| ATP | 100 mM | 7 μl | 10 mM |
| CTP | 100 mM | 7 μl | 10 mM |
| GTP | 100 mM | 7 ve # 956; l | 10 mM |
| UTP | 100 mM | 4,5 μl | 6.5 mM |
| Kazmak-11-UTP | 10 mM | 25 μl | 3.5 mM |
| RNase free su | < /td > | 19.5 μl | |
| Toplam | 70 μl |
Tablo 5: KAZMAK-NTP Mix hazırlık.
< tablo sınır = "1" fo:keep-together.within-sayfa "1" fo:keep =-ile-next.within-sayfa = "her zaman" >(112 x reaksiyon)
Tablo 6:2 X transkripsiyon Master Mix.
- Hazırla KAZMAK-NTP mix başı olarak tablo 5.
Not: A1 plaka sol üst köşesine öyle ki hatalardan kaçınmak için her zaman plaka hizalayın. - İçin her şey yeni bir 96-şey PCR plaka (sonda plaka) tablo 6'açıklanan bileşenleri ekleme. 7.5 µL PCR ürününün (DNA şablon) her şey karşılık gelen, bir çok kanallı pipet kullanarak ekleyin. Bant mühürleme ile plaka kapak.
Not: Transkripsiyon tepki eklendi PCR ürünü en uygun miktarda 0.5 ve 1 µg arasında olmalıdır. Jel Bands önemli ölçüde zayıf veya daha yoğun ise, DNA için tepki eklendi hacmi buna uygun şekilde düzeltilecektir. Tam miktarı kritik değil. - Kuluçkaya sonda plaka 37 ° C'de GKD 2 O, 125 µL 100 sentezlenmiş sonda 3.5-4 h. Mix 15 µL DEPC 35 µL ile tedavi için % alkol ve 3 M NaOAC 5 µL (pH = 5,2, RNase free). Saklamak için en az 30 dk santrifüj-80 ° C'de ve 1.10.2 ve 1.10.3 adımlarda açıklandığı gibi yıkayın. DEPC
- resuspend 25 zarlarını soruşturma µL tedavi GKD 2 O. çalıştırmak 5 µL üzerinde % 1'özel jel (çalışma süresi < 20 dk) bütünlüğü ve verim inceleyebilirsek ( Şekil 2) kontrol etmek için.
Not: Özel jel DEPC tedavi GKD 2 O ve TAE tampon ile yapılmalıdır. Jel Elektroforez cihazları için RNA atanan sadece çalışır. Düşük hızda çalışma süresi daha uzun Jel Elektroforez sırasında RNA bozulması için açabilir. - 100 µL hibridizasyon çözüm (Tablo 7) ve mağaza-80 ° gerekinceye kadar c ile sentezlenmiş sonda kalan 20 µL mix.
Not: bantları sağlam (bkz. Şekil 2 örnekler) ise sonda konsantrasyonu daha seyreltilmiş. Hibridizasyon RNase kontaminasyonu önlemek çok etkili çözümdür. Hemen hibridizasyon çözüm RNA yıkımı önlemek için resuspended sonda ekleyin. 0.2 µm filtreden süzülecek hibridizasyon çözümü vardır. Doku örnekleri için hibridizasyon çözümde deterjan konsantrasyonu % 0,3 son bir konsantrasyon Triton-X-100 ekleyerek artırmak.
| bileşen | birim | son konsantrasyonu |
| 11.85 ml | %23.7 | DEPC tedavi ddH2O |
| 20 X SSC | 12,5 ml | % 25 (5 X) |
| Formamide | 25 ml | % 50 |
| Heparin (50 mg/ml) | 0.1 ml | 0. %2 (0.1 mg/ml) |
| Somon sperm tek iplikçikli DNA | 0.5 ml | % 1.0 |
| Ara-20 | 0,05 ml | %0.1 |
| Toplam | 50.00 ml | % 100 |
3. drosophila yetiştirme ve embriyo, larva ve Ergin doku koleksiyonu.
Not: küçük ölçekli (şişe) ve kütle (kutu) yetiştirme sinek, 25 ° C. tutmak doğru yetişkin ve larva yoğunluk dayalı Mısır unu gıda üzerinde standart sinek laboratuvar protokolleri kullanır ve ek aktif Maya toz gıda sağlamak için yüzeyler.
Standart protokolleri takip- toplamak embriyo. Embriyo koleksiyonunun önemli adımlar şekil 3 ' te gösterilmiştir.
Not: devitillinized embriyo metanol içinde sonra durulama, sabit embriyo-20 ° C'de bir yıl süreyle saklanır. Embriyo permeabilization ve sonrası fiksasyon balık Protokolü'nün 1 gün gerçekleştirilir. - Hazırlama taze % 40 PFA hisse senedi çözüm.
DEPC 10 mL karıştırma tarafından % 40 paraformaldehyde (PFA)
- hazırla taze yapılmış stok çözüm tedavi GKD 2 O İngiltere'de yılın ve 2N KOH küçük heyecan bara içeren 20 mL cam mercek şişe içinde 70 µL 3.68 g için
Dikkat: PFA potansiyel akut ve kronik sağlık etkileri ile son derece zehirlidir. MSDS (malzeme güvenlik bilgi formları) okuyup göz, cilt ve solunum yolları için uygun koruma kullanma. - Bir duman Hood, ısı ve şişeyi 3-5 dk ısıtma yüzeyi 200 ° c üzerinde ise tamamen eriyene kadar karıştırın. PFA çözünmüş olarak İngiltere'de yılın hisse senedi çözüm ısı kaldırmak (değil aşırı ısınma).
- Çözünmüş % 40 PFA hisse senedi çözüm on Ice 5 min için serin ve filtre filtre ve 10 mL 0.2 µm şırıngayla.
- hazırla taze yapılmış stok çözüm tedavi GKD 2 O İngiltere'de yılın ve 2N KOH küçük heyecan bara içeren 20 mL cam mercek şişe içinde 70 µL 3.68 g için
- Üçüncü larva (L3) veya yetişkin doku fiksasyon, Şoklama ve permeabilization biçim
Not: Bu protokol bir gün içinde bitmiş olmalıdır. Doku içerir diseksiyon, fiksasyon, endojen HRP, permeabilization ve sonrası fiksasyon Şoklama.- Hazırla sabitleme Çözümleri (saptamak-ı ve düzeltme-II) göre Tablo 8.
Not: doku korunmuş olmalıdır hassas bir yapıya sahip Pikrik asit ek bir sabitleştirici kullanılır. Doku ultrastructure elektron mikroskobu (EM) korunmuş olmalıdır ne zaman iyi bir sabitleştirici değil.
Uyarı: Pikrik asit kararsız ve diğer malzemeler ile tepki ve patlayıcı bileşikler oluşturmak için yeteneğine sahiptir. Kullanın ve güvenlik kurallarına göre mağaza. - Yer larva veya soğuk 1 PBS X 10 mL ve 100 µL düzeltme içeren bir 50 mL plastik tüp yetişkin uçar-ben çözüm. Soğuk buz larva veya yetişkin sinek hareketliliği azaltmak 2 dk için.
- Kesme 2-3 mm açılış oluşturmak için 1 mL plastik ucu ucu kapalı. 10-30 larva transferi veya yetişkin 1 mL ucu ile bir Petri kabına (9 cm Çap) 1 X PBS sığ bir tabaka ile 50 mL tüp (Adım 3.3.2) uçar. PBTT biraz ekleme yüzey gerilimi düşürebilir. Dikkatle larva teşrih (ön üzerinden açın ve posterior anterior için dokulardan sıkmak) veya bir çifti bir diseksiyon kapsamı altında keskin Forseps ile ilgi yetişkin dokularda.
Not: Yaklaşık 200-300 larva veya yetişkin testislerde tanısal yaklaşım olabilir disseke ve deneyimli kişiler tarafından bir gün içinde sabit. - Transfer 1,5 mL tüp ve buz üzerinde mağaza içine (açılış 2 mm çapında oluşturmak için kesilmiş ucu ile) 200 µL pipet kurcalayarak kesmiştim. Kandan sonraki adıma ilerliyor önce 10-15 dk içinde her turu.
Not: yeterli malzemesi oluşturmak için gerektiği şekilde (içinde 2 h zaman penceresi) ek mermi devam. - 800 kurcalayarak düzeltme µL düzeltme-ben bir tezgah üst Mikser üzerinde 30 dk için çözüm. Bir kez 800 µL ile 1 X PBTT ve tüpler en fazla 30 dk nedeniyle 2.5 h. buz üzerinde tutmak durulama doku sınırlamak, yeterli doku toplanan kadar batch-wise yapılması gereken bu.
- Kafes kapağı içeren bir tek 15 mL plastik tüp içine tüm disseke ve sabit dokular havuz (bkz. şekil 4 tüp çizmek için). Kafes tüp kapağı ile aşırı sıvı Aspire edin. 3 X 5 dk her ile 10 mL 1 X PBTT yıkayın. Deterjan kaldırmak için 1 X PBS iki kez 10 mL ile yıkayın. Bu fazla sırada kabarcıkları önler.
Not: disseke doku tüpün dibine batar, adımları düzenli microtiter plakaları veya 0,5-1,5 yapılabilir mL microcentrifuge tüpler (300-800 µL birim başına tüp). - Endojen HRP aktivite ile 5 mL % 0,3 H 2 O 2 ' PBS RT. tekrar 15 dakika için de bir kez daha gidermek. Kapağı olmadan bu adımı sırasında açık tutun. Durulama iki kez 10 mL 1 X PBTT kullanarak. 1 X PBTT 10 mL ile 5 min için iki kez yıkayın.
- 10 mL % 80 aseton (-20 ° C, önceden soğutulmuş) kurcalayarak 10 dk. ters çevir'i-20 ° C'de tüp iki kez kuluçka döneminde permeabilize. Dokular suyla temasa 1 X PBTT 10 mL ile 10 min için iki kez yıkayın.
- Durulama 10 mL 5 ml PBTT artı 5 ml hibridizasyon karışımı ile çözümü (1:1). atma mix ve 10 ml hibridizasyon solüsyon ile değiştirin. Örnekleri-20 ° C de ihtiyaç kadar saklanabilir. En iyi sonuçlar için daha--dan a hafta için örnekleri depolamayın.
- Hazırla sabitleme Çözümleri (saptamak-ı ve düzeltme-II) göre Tablo 8.
| düzeltmek ben (10 ml) | bileşeni | düzeltmek II (10 ml) |
| % 40 PFA hisse senedi | 1 ml | 1 ml |
| PBTT | 8,99 ml | 9 ml |
| Pikrik asit çözüm | 10 μl | - |
4. in situ hibridizasyon
Not: protokol bu bölümünü en az 2 gün örnek hazırlık gerektirir, ön hibridizasyon Hibridizasyon alarak yer ve gün 1 ve yoklama algılamayı üzerinde 2. gün. Örnekleri sayısı nispeten yüksek, yabancı Eğer protokolü ile ya da bir gün mümkün değildir Eğer protokol ile 2 gün bölünmüş sonda algılama ve sinyal amplifikasyon adımlarla 3 gün içinde yapılmalıdır. Çok sayıda embriyo veya disseke doku örnekleri de işlemek için ek gün gerektirebilir. Disseke doku örnekleri için 1 X PBT 1 X PBTT her adımda, aksi belirtilmedikçe değiştirin. İlave deterjan beyin ve testis gibi birçok larva ve yetişkin dokulara nüfuz için gereklidir. Değil test, 1, ancak X PBTT embriyo için de kullanılabilir. 96-şey plakaları ve 1,5 mL tüpler için 800 µL için iyi 100 µL kullanın.
- Öncesi hibridizasyon ve hibridizasyon
Not: adımları 4.1.1-4.1.6.2 embriyo in situ hibridizasyon için vardır. Larva veya yetişkin doku in situ hybridizations için bu adımları atlayın.- (Metanol-20 ° C'de depolanan) sabit embriyolar için yeni bir 15 mL tüp kaldırmak 2 mL. İki kere metanol 7 min 10 mL ile için embriyo her makinaya yıkayın. WAsh 7 min 10 mL metanol ve 1 X PBTT (1:1) karışımı ile için embriyo. Suyla temasa 1 X PBTT 7 min 10 mL ile iki kez için embriyo yıkayın.
- 1:500 (20 mg/mL) hisse senedi çözümden sulandrarak bir ara İndinavir K çözüm (40 µL/mL) embriyo permeabilization için hazırlanın. -20 mağazada ° C. yapmak için son bir çalışma konsantrasyonu 2.667 ug/mL 1 X PBTT ara İndinavir K çözümde 1/15 sulandrarak tarafından çalışan bir İndinavir K çözüm.
- Permeabilize embriyo ile İndinavir K çözüm (embriyolar daha küçük sayılar için daha az kullanım) çalışma 10 mL. Kuluçkaya RT at tüp için kuluçka sırasında 4 kez tüp 13 dk. yavaşça tersine çevirin. Olmadan İndinavir K çözüm 1 h için buz örneklerinde kuluçkaya.
Not: Bu nispeten uzun bir kuluçka seyreltik İndinavir K ile tekrarlanarak üniforma permeabilization ve sonraki boyama sağlar. - Embriyo permeabilize iken, 2 mg/mL 1 X PBTT için toplam hacmi 30 mL içinde glisin çözüm 10 X stoktan (20 mg/mL) olun.
- Kaldır İndinavir K çözüm, 10 mL glisin çözeltisi (2 mg/mL) ile durulayın ve 2 dk her iki kez yıkayın. Durulama ile üç kez glisin kaldırmak için 1 X PBTT 10 mL.
- Sonrası embriyo fiksasyonu.
- 10 mL % 4'lük hazırlamak PFA (%40 1 mL PFA 9 ml PBTT, filtre 0,45 µm filtreden).
- % 4 örneklerinde kuluçkaya PBTT ile 20 dakika yıkama 3 X 2 dakika süreyle PFA. Denatüre hibridizasyon çözüm, hazırlamak için
- hibridizasyon çözüm 5 dakika kaynatın. Tam 96-şey plaka için 12 mL üç tüp kullanın. Serin buz hemen 5 dakika süreyle
- Durulama embriyo bir kez ile 10 mL 1 X PBTT: hibridizasyon çözümü (1:1). İki kez 5 mL hibridizasyon çözeltisi durulayın. Aliquot ~ 20 µL kuyu başına embriyo (30-40 embriyo) yerleşmiş veya doku içine buz 96-şey PCR tabağa sabit. Doku veya bir 8-kanal manifold pipet ( şekil 1 / video) kullanarak embriyo hibridizasyon çözüm kaldırma.
Not: Manifold pipet vardır bir ‘ dur ’ kuyu alt kısmında ve örnek çıkarma ipuçları engeller. Float dokuları kullanarak deneyler için sıvı dikkatlice 100 µL pipet ile en baştan çıkarmak.
- Ekle 100 µL denatüre hibridizasyon çözüm her şey için. Embriyo en az 2,5-3 h 56 ° c metal boncuk (malzeme ve şekil 1 bakınız) içeren bir kuru banyo Isıtma birimi kullanarak önceden melezlemek. Bir thermocycler için 5 dk 80 ° C. hemen serin 5 min için buz üzerinde kullanarak bir 96-şey PCR plaka
- denatüre 100 µL hazırlanmış, sonda. Öncesi hibridizasyon çözüm embriyo veya doku çıkarın. Denatüre gene özgü probları her örnek, kapak bant mühürleme ile ve 16-18 h O/N, altında kuru banyo birimini Isıtma metal boncuklar için 56 ° C'de melezlemek ekleyin
5. Algılama sonda
- öncesi 56 ° C Isıtma birimi çözümlerinde Tablo 9'sıcak. Probları plaka kaldırmak.
Not: Problar arasında yeniden kullanılabilir-80 ° c (asla mağaza herhangi bir RNA örnekleri-20 ° C'de) 2 - 3 kez depolanmış olsa. Hibridizasyon sonra çift iplikçikli RNA tek iplikçik RNA daha istikrarlı ve daha az RNase kirlenme tarafından neden bozulma maruz kalabilir.
Eğer kullanarak bir çok iyi plaka vakum filtrasyon sistemi dokular için (bkz: derleme ayrıntıları için video) probları toplamak için filtre plaka altında bir koleksiyon plaka dahil edilmelidir. Melezleşmiştir dokular bir 1.2 µm gözenek boyutu PVDF membranlar her kuyunun ile hibridizasyon için kullanılan normal 96-şey microtiter plaka transfer gerekir.
| adım | önceden çözüm (56 ° C) sıcak | zaman | Birim başına iyi |
| 1 | Hibridizasyon çözüm: PBTT (3:1) | 15 dk | 100 μl |
| 2 | Hibridizasyon çözüm: PBTT (3:1) | 15 dk | 100 μl |
| 3 | Hibridizasyon çözüm: PBTT (1:1) | 15 dk | 100 μl |
| 4 | Hibridizasyon çözüm: PBTT (1:3) | 15 dk | 100 μl | 5 | 5 dk | 100 μl | yıkar PBTT 3 |
Tablo 9: probları hibridizasyon sonra yıkama.
- normal plakalar, 56 Isıtma birim olarak başına tablo 9 yıkama örnekleri kullanıyorsanız
- ° C. manifold vakum sistemi kullanarak Eğer bankta vakum sistemi ile ısıtmalı çözümleri kullanır ve vakum tarafından çözümlerinden hemen aşağıda kaldırın. 1 X PBTT ile 3 yıkama sonra normal plaka üzerinden Isıtma kaldırılabilmesi için Gordon
- Hazırlama antikorlar.
- Hazırlamak 11 mL biotin Birleşik fare monoklonal Anti-KAZMAK antikor sulandrarak tarafından (1 mg/mL) stoktan birincil antikor çözeltisi (2,5 µg/mL) (bkz: malzeme listesi) PBTTB (1: 400) içinde. Eğer daha az örnekleri işleme, birimler buna göre ayarlayın.
- Hazırlamak 11 mL streptavidin-HRP çözeltisi (1 µg/mL) 1: 1000 streptavidin-HRP sulandrarak tarafından (1 mg/mL) stoktan (malzeme listesi bkz:) PBTTB içinde çekimlerine. Eğer daha az örnekleri kullanarak, birimleri buna göre ayarlayın.
- Engellemek embriyo veya PBTTB (1 X PBTT % 1 yağsız süt) kurcalayarak RT. adlı bir tezgah üst Mikser üzerinde 20 dk için
Not: Filtre PBTTB 96-iyi filtre Tabaklarda filtreleri tıkanmasını önlemek için kullanmadan önce filtre kağıdı (grade 3, 6 µm) kullanarak. PBTB, PBTTB yerine (PBTB ek % 0,3 ile Triton-X-100) tüm dokular için iletişim kuralı sırasında kullanılır. - Incubate embriyo veya tezgah üstü örnek karıştırıcı 2 h için antikor çözüm (100 µL/de) dokularda. Durulama iki kez 1 ile x PBTTB. 3 yıkama X 5 min ve 5 X 10 min için PBTTB ile. Embriyo veya streptavidin-HRP çözüm (100 µL/de) 1,5 saat bir tezgah üstü örnek Mikser kullanarak için kurcalayarak kuluçkaya. 2 yıkama X 5 min için PBTTB ile. Bu noktadan sonra örnekleri karanlıkta devam.
Not: Eğer doku süt tarafından üretilen opaklık nedeniyle kayıp tüm antikor yıkama sırasında yıkama (PBTT PBTTB yerine) süt olmadan deneyin. - DAPI çözüm sulandrarak 100 ile hazırlamak X DAPI PBTTB (1: 100).
- Incubate embriyo veya DAPI çözüm (100 µL/de) bir tezgah üstü örnek Mikser üzerinde 15 dakika kurcalayarak. 4 yıkama X 10 min için PBTT ile. 96-şey plaka ile örnekleri O/N 4 ° C'de depolayın veya sonraki adıma geçin.
Not: Burada yordamı duraklatılmış.
6. Tyramide antikor algılama (bkz şekil 5)
Not: burada ev yapımı siyanür 3-Birleşik tyramide, hangi içinde açıklanan protokolüne göre hazırlanan kullanılan 12 . Eğer birçok deney gerçekleştirmek veya pek çok örnekleri test, bu para önemli miktarda tasarruf ve etkili için ticari reaktifler (deneyim) karşılaştırılır. Daha az deneyler ve örnekler için piyasada bulunan siyanür 3-tyramide-ebilmek var olmak kullanılmış (malzemeleri görmek).
- Yıkama örnek tabaklar 3 X 5 min için 1 X PBTT.
- %0,006 H 2 O 2 PBTT (seyreltik %30 (w/w) H 2 O 2 hisse senedi 1: 5000) içeren hazırla tyramide harekete geçirmek arabellek (harekete geçirmek arabellek). < lBen > harekete geçirmek arabellek pilakalar durulayın.
- Hazırlama siyanür 3-tyramide çözüm 15 mL tüp içinde harekete geçirmek arabellekte sulandrarak tarafından.
- İçin embriyo, 1:80 seyreltme (siyanür 3-tyramide harekete geçirmek arabellek 11 ml 137 µL) kullanın. Larva dokular için 1:150 seyreltme (siyanür 3-tyramide harekete geçirmek arabellek 11 ml 73 µL) kullanın. Yetişkin testis için 1: 200 seyreltme (siyanür 3-tyramide harekete geçirmek arabellek 11 ml 55 µL) kullanın. Yetişkin yumurtalık için 1:300 seyreltme (siyanür 3-tyramide harekete geçirmek arabellek 11 ml 36 µL) kullanın.
- Kuluçkaya siyanür 3-tyramide çözümü için tezgah üstü örnek karıştırıcı 2 h ile örnekleri. Dört kez PBTT ile yıkayın. 6 yıkama X 10 min için PBTT ile. 3 X 5 min için deterjan kaldırmak için PBS ile yıkayın.
- Ekleyin 150 µL/iyi anti-fade in montaj medya. Örnekleri O/N 4 ° C'de dokular veya embriyo tüp altına lavabo izin vermek için devam edin. Örnekleri (altında dokular için kapsam anatomi) mikroskop slaytlar bağlama ve coverslip ile kaplayın. Coverslip şeffaf oje ile kenarlarını kapatın.
- Bir floresan mikroskop kullanarak görüntü.
Not: ilk önce bir fikir edinmek için negatif kontrol analiz ‘ belirsiz ’ arka plan.
Representative Results
Şekil 6 bu yordamı kullanarak elde edilen sonuçlar gösterilmektedir. En iyi 3 panelleri erken Drosophila embriyo (şekil 6, paneller A-C), gelecek 3 panelleri geç Drosophila embriyo sinyalleri ile farklı dokularda (amnioserosa, kas ve merkezi sinir sistemi, örnekler örnekler sırasıyla (şekil 6, panelleri D-F). Sonraki 3 INSTAR örneklerden larva dokuları (şekil 6, paneller G-J) vardır. Panelleri K ve L yetişkin gonads temsilcisi görüntüleri göster (yumurtalık ve testis, sırasıyla). Görüntüleri yüzlerce yükledi ve bizim aranabilir açıklamalı 'Floresan situ meyve sineği veritabanı' (bulaşıcı (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca)).
Şekil 1. Floresan situ hibridizasyon (balık) protokolü ve anahtar ekipmanlar taslağını. (A) PCR cDNA amplifikasyon. Gene özgü antianlamlı KAZMAK - oluşturmak için (B) vitro transkripsiyonu RNA probları bir 96-şey plaka (fotoğraf b'de gösterildiği plaka) etiketli. (C) ve (D): yetişkin (kadın: erkek oranı 2:1. 300-400 uçar/şişe) sinekler için 3-4 gün dostum izin verilir. Embriyo standart Mısır unu gıda 25 ° c gece bir koleksiyon için iyi havalandırılan bir plastik kutu aktarılır (Mısır unu gıda boyutlu bir kapta 1 L: 8 "X 8" X 3" LWH) veya yeni şişe uygun bir larva yoğunluğu tutmak. Dokusu toplamalarında aktif Maya toz gıda 24, 48 h (AEL) döşeme yumurta sonra üzerine serpilir. (E h): Floresan situ hibridizasyon deneyleri 3 gün üst üste gerçekleştirilen. Embriyo veya değil float dokular için 96-şey PCR plaka fotoğraf b 8-kanal aspiratör (fotoğraf c) ile gösterildiği gibi kullanın. Float, çoğu larva doku gibi dokularda bir filtre popolu tabak (d fotoğrafta) kullanın ve düşük basınç (e fotoğrafta) kullanarak bir manifold aspiratör ile altındaki sıvı çıkarın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. RNA sonda verim belirlenmesi. Yeni sentezlenen bir % 1'özel jel (5 µL/lane) gözlenen Antisens RNA sondalar. Verim (grup yoğunluğuna göre) kategorize edilebilir olarak 'düşük verim' Lanes 3 ve 10, Lanes 1, 4, 5, 6 ve 8 ' tipik verim' veya 'yüksek kapasiteli' Lanes 2, 7, 9, 11 ve 12. 'Tipik verimleri' ile örnekleri için 10-15 µL hibridizasyon çözüm her in situ deneme için 100 µL içinde seyreltilmiş inceleyebilirsek kullanın. 'Yüksek verimi' soruşturma 'tipik sonda' yoğunluğu göreli bant yoğunluğu göre ek hibridizasyon Çözümle örnekleriyle sulandırmak. Kabaca eşit son yoklama konsantrasyonları her şey var hedefliyoruz. Oku 'RNA probları', birine puan daha yüksek her Lane'de özgün DNA şablonu grubudur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Büyük adımlar için bir büyük ölçekli embriyo toplama ve fiksasyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Sıvı larva veya kayan dokulardan kaldırmak için ev yapımı tüp. Larva ve yetişkin mendil çözümde fiksasyon sırasında float. Bu basit araç ipucu olarak bir aspiratör bağlamak için bir adaptör 1 mL bahşiş tarafından takip, kesilmiş bir 200 µL tarafından tutulan bir naylon mesh oluşur. Sıvı herhangi bir doku kaybı olmadan güvenli bir şekilde kaldırabilirsiniz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. Tyramide sinyal amplifikasyon. (1) KAZMAK etiketli antianlamlı RNA sonda ile endojen duyu-RNA hybridizes. (2) kazı-UTP arasındaki birincil antikor biotin Birleşik IMMUNO-akrabalık bağı. (3) HRP streptavidin bağlar biotin Birleşik. (4) HRP kısa ömürlü siyanür 3-tyramide radikallerin oluşturmak için siyanür 3-tyramide ve hidrojen peroksit tepki tromboksan. (5) siyanür 3-tyramide radikallerin tirozin kalıntıları yakın proteinler olarak bağlayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6. Temsilcisi in situ hibridizasyon görüntüler. Her panel (camgöbeği içinde gösterilmiştir) farklı bir RNA ve hücre çekirdeği DAPI (kırmızı ile gösterilen) ile lekeli örneği gösterir. (A-C) Erken Drosophila embriyo örnekleri. (D, F) Geç Drosophila embriyo örnekleri. (G-J) 3 örnekleri biçim Drosophila larva dokuları (malphigian tübüllerin, midgut, Tükürük bezi ve kas sırasıyla). (K) Yetişkin yumurtalık. (L) Yetişkin testis. Her panel için sonda hybridizing gen adını görüntüler. Ölçek çubukları 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Açıklanan protokol sabit Drosophila embriyo veya doku çoğu RNA'ların tespiti için son derece hassas, tekrarlanabilir ve ekonomik bir yöntemdir. Her ne kadar daha geleneksel alkalin fosfataz yöntemi sonda algılama eskisinden biraz daha karmaşık, balık tarafından elde edilen çözünürlük çok daha büyük ve duyarlılık karşılaştırılabilir veya geliştirilmiş 7,8. Tamamını veya bir kısmını microtiter plakaları kullanarak, iletişim kurallarını genler ilgi büyük ölçekli veya sınırlı analizleri için kullanılabilir. Oluşturulan probları tüm algılayabilir veya sondalar özellikle tasarlanmıştır sürece birden fazla transkript splice oluşturur unutulmamalıdır (yani, tek ekzonlar). Probları makul başarı ile 200 nükleotit olabildiğince küçük test ettik rağmen daha küçük sondalar daha az etkili olma eğilimindedir ve daha az belirgin olabilir. Açıkça, bu protokol küçük intron, ekzonlar, tespiti için uygun değildir ya da mikroRNA'lar işlenir.
Sinyal gücünü artırmak için enzimatik bir adım bu yaklaşım kullanır, ancak sinyal yoğunluğu hedef gen ifadesinin ifade düzeyleri nispeten doğrusal ve geniş bir yelpazesi ile orantılı olarak düşünülür. Yüksek büyütme oranında sinyal puncta veya speckles olarak görülüyor hücre ve dokuların içinde. Nispeten nadir transkript için sadece birkaç küçük puncta görülür. Transkript bereket arttıkça, bunlar sayı ve boyutu büyür. Tek molekül olarak balık (smFISH) ile tek küçük puncta için tek RNA'ların da karşılık ve aynı zamanda kolayca görüntüleme ve Bilişim yazılım kullanarak sayısal. Karşılaştırmalar Yayınlanan görüntülerin smFISH biz küratörlüğünü görüntülerle aynı hedefler için kullanılarak elde her ne kadar bu-meli var olmak sınav daha titiz karşılaştırmalar tarafından genel, duyarlılık ve kararlılık-in iki yöntem nispeten benzer olduğunu göstermektedir. SmFISH çok daha yüksek masrafına göz önüne alındığında, burada sağlanan yöntem maliyetinin bir kısmını benzer sonuçlar verecektir. Ancak, Eğer amaç küçük transkript veya transkript farklı yerlerini tespit etmek, smFISH önerilir.
Bazı balık probları daha küçük boyutu nedeniyle, bu yöntem aynı zamanda büyük veya önemli engelleri delici doku daha iyi olabilir. Ancak, bizim kullanımı daha yüksek deterjan düzeyleri ve doku fiksasyon ve permeabilization tweaks bu sorunu çözmüş görünüyor. Son olarak, Drosophila dokular için geliştirilen rağmen burada açıklanan disseke dokular için yüksek deterjan arabellekleri da Drosophila embriyo yanı sıra diğer çoğu organizmalar ve dokular için çalışması gerekir.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.
Acknowledgments
Destek bu proje için finansman bir grant tarafından HMK Kanada kurumları, Sağlık (paspas 133473 vermek) araştırma tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
| 2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
| 50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
| 96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
| 96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
| Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
| Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
| Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
| AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
| AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
| AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
| Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
| BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
| Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
| Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
| DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
| Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
| Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
| Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
| Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
| Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
| Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
| Mesh - 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
| Mesh - 800 microns | SEFAR - Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
| Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
| Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
| Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
| Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
| PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
| Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
| Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
| PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
| Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
| Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
| Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
| RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
| Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
| RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
| Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
| Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
| Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
| SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
| Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
| Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
| Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
| T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
| T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
| Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
| Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
| Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
| TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | Preparation | ||
| DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
| 1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
| 1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
| 1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
| 1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |
References
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Hughes, S. C., Krause, H. M. Double labeling with fluorescence in situ hybridization in Drosophila whole-mount embryos. Biotechniques. 24, 530-532 (1998).
- Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Raap, A. K., et al. Ultra-sensitive FISH using peroxidase-mediated deposition of biotin- or fluorochrome tyramides. Human Mol Genet. 4, 529-534 (1995).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol Biol. 420, 289-302 (2008).
- Wilk, R., Murthy, S. U. M., Yan, H., Krause, H. M. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , Wiley Online Library. Vol. 9.3.1-9.3.24 1-9 (2010).
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA Localization in Animal Cells and Why It Matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Martin, K. C., Ephrussi, A. mRNA Localization: Gene Expression in the Spatial Dimension. Cell. , 719-730 (2009).
- Wilk, R., Hu, J., Blotsky, D., Krause, H. M. Diverse and pervasive subcellular distributions for both coding and long noncoding RNAs. Genes Dev. 30, 594-609 (2016).
- Zhou, X. L., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric kidney tubules. Dev Biol. 271, 322-338 (2004).
