Summary
Mitophagy、クリア破損しているミトコンドリアのプロセスはミトコンドリアの恒常性と健康維持のため必要です。この記事は最新の mitophagy のいくつかに、ひと細胞、線虫マウスの検出方法を示します。
Abstract
ミトコンドリアは細胞の強豪であり、ATP の形で細胞のエネルギーを作り出します。ミトコンドリアは、生物学的老化、代謝性疾患、早期老化症候群とアルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD) などの神経変性疾患を含む疾患のさまざまな貢献しています。ミトコンドリアの健康維持は、ミトコンドリア生合成と mitophagy を介して機能不全のミトコンドリアの効率的な通関に依存します。動物モデルで特にオートファジー/mitophagy を正確に検出するための実験方法は、開発に挑戦されています。Mitophagy の分子機構の理解に向けての最近の進歩は、新しい mitophagy 検出技術の開発を可能にしました。ヒトの細胞、線虫mitophagy を監視するいくつかの汎用性の高いテクニックをご紹介 (例えばローゼラと DCT 1/LGG-1 系統)、およびマウス (mt 桂馬)。クロス種の評価を含む、これらの mitophagy 検出手法の組み合わせが mitophagy 測定の精度の向上し、健康および病気の mitophagy の役割の理解に 。
Introduction
Mitophagy は、ミトコンドリアのメンテナンスは欠かせません。ミトコンドリアは複数の細胞シグナル伝達経路が交差して普遍的な細胞内小器官カルシウム恒常性1,2,3、 、細胞の代謝、細胞のエネルギー生産を担当4. ミトコンドリア絶えず、活性酸素種 (ROS) やミトコンドリア毒性など内因性と外因性の源からの課題,「高齢者」および機能不全のミトコンドリアの生成に 。傷害ミトコンドリアの蓄積は有害な活性酸素の量を増加させながら ATP 生産効率を低下させる、広告、代謝性疾患など加齢に伴う疾患にリンクされていると PD1,5,6.誘導ミトコンドリア細胞機能障害を防ぐためには、細胞に必要な特に認識してミトコンドリアを損傷し効率的に細胞プロセスを削除するはミトコンドリア オートファジー (mitophagy) と呼ばれます。これは mitophagy の健康の重要性を実証し、病気が mitophagy を検出する正確かつ効率的な方法の必要性を示していますの in vitroとin vivoの両方。
Mitophagy は、多くのタンパク質やタンパク質複合体5,7、8を含む複数段階のプロセスです。簡単に言えば、破損したミトコンドリアがまず認識および9,10膜、小胞体、ゴルジ複合体、核、またはミトコンドリア自体から起きることができる二重機能を担った phagophore によって包まれています。球状 phagophore を延長し、最終的にミトコンドリア ミトコンドリア オートファゴソーム (mitophagosome) を構成する内部のシールします。Mitophagosome、劣化、破損したミトコンドリアは劣化とリサイクル7、8autolysosome の形成のリソソームと融合しています。Mitophagy にも関与する主要なオートファジー蛋白質を含める: オートファジー関連 7 (atg 7生) と Beclin1 (開始)、Microtubule-Associated 蛋白質 1A 1B 光チェーン 3 (LC3 II) ( C. elegans で LGG-1) と p62 (phagophore のコンポーネント) とリソソーム膜糖タンパク質 2 (LAMP2)6,7。また、mitophagy、PTEN による推定のキナーゼ 1 (ピンク 1)、Parkin1、核ドット蛋白質 52 kDa (NDP52)、BCL2 の相互作用蛋白質 3 のような (炎の使い手ニクス/BNIP3L) (DCT 1線虫)、緑内障などにユニークないくつかの重要な蛋白質があります。他の人の間で5,6,11。
オートファジーのレベルの変化を検出する共通の方法は LC3-II/LC3 I または II/LC3 アクチンの比です。ただし、この方法は非特異的、この比率の増加は、増加の開始またはリソソーム12mitophagosome の障害の融合を反映可能性があります。(例えばLC3) のオートファジーのマーカーおよびミトコンドリア蛋白質 (例えばTranslocase の外側ミトコンドリア膜 20 (TOMM20、プロテアソームによって低下する可能性があります)) 間の共存を評価する別の方法です。ただし、合計 mitophagy レベルの変化を示すだけことができます、手順を区別できないどの閉塞で発生します。これは並列 mitophagosomes の蓄積を引き起こすライソゾーム阻害剤 (例えばE64d + ペプスタチン A EP と呼ばれる) を使用して明らかにすることができます。ベースラインで mitophagosomes の数と次の EP と治療 mitophagosomes の数の違いは、mitophagy を示すことができます。これらの制限は、新規 mitophagy 検出技術の開発を求めています。人間の病気の広いスペクトルの mitophagy の増加の関連性の観点から研究者の役に立つかもしれないいくつかの堅牢な mitophagy 検出手法を提案する.我々 は両方の in vitroとin vivoのテクニックをカバーし、mitophagy の変更を確認する複数のテクニックを組み合わせることをお勧めします。
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Protocol
動物 (雌雄マウス) 生まれ、NIH 動物ケアおよび使用委員会の承認や、認定の動物実験施設で飼育されました。安楽死方法はすべての国および教育機関の規制と一致する必要があります。
1. ひと細胞における Mitophagy の検出
- Mt 桂馬プラスミドを使用して mitophagy の検出
注: mt-桂馬として簡略化、ミトコンドリア ターゲット信号に溶ける桂馬蛋白質は mitophagy 発見体内に有用証明しました。mt 桂馬は、レシオ メトリック pH 感受性蛍光タンパク質蛍光グリーン (励起 458 nm) 塩基性・中性の条件下で、酸性条件下で赤色蛍光 (励起 561 nm) を表わす。健康的なミトコンドリアは塩基性・中性の条件 (pH 7 8) で繁栄し、mt 桂馬をトランスフェクトしたとき緑の蛍光性によって示されます。ミトコンドリアは、mitophagy を受けるし、酸性リソソームと融合、pH 低下 4.5 と mt 桂馬を含むミトコンドリアを表わす赤い蛍光性6,13,14。重要なは、mt 桂馬はリソソームタンパク、長い期間にわたって mitophagy の評価を有効にすることに強いです。6 ウェル プレート下のプロトコルです。- 1 日目: ひと初代細胞 (例えば、線維芽細胞) または不死化ひと細胞 (例えば、Hela 細胞または U2OS のセル) のいずれかを使用します。種子約 0.3 1 × 106 6 ウェル プレートで (次の日に 70% の confluency に到達する細胞を許可するセルの成長率) によって細胞/ウェル。完全な細胞培養培地で細胞を維持 (10% ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 培 FBS、および 1% 混合ペニシリン ストレプトマイシン溶液)、37 ° C で細胞文化のインキュベーターで孵化させなさいと (20% O25 %co2).6 ウェル プレートで 1 mL 完全な細胞培養培地/ウェルを追加します。
注: このステージ6で遺伝子過剰発現/ノックダウンや薬物治療を行うことができます。 - 2 日目: ミックス6 mt 桂馬プラスミッドの DNA と DNA トランスフェクション試薬 (6 ウェル プレートの 1 つの井戸の混合物)。
- 製造元のプロトコルに従って無血清培地の 150 μ L の DNA トランスフェクション試薬 15 μ L を希釈します。
- 2-5 μ g mt 桂馬プラスミド DNA の無血清培地の 150 μ L で希釈します。
- 希薄 DNA トランスフェクション試薬、10 の渦に希薄 mt 桂馬プラスミドを追加 s、室温で 10 分間インキュベートし、。
注: DNA トランスフェクション条件の最適化によってプレート サイズ必要があります (詳細についてはメーカーのプロトコルを参照してください)。 - 細胞に滴下 DNA/トランスフェクション試薬の混合物を追加し、ソリューションが完全に混合するまで軽く 5-10 s 用の皿を振る。
- 3 日目: DNA トランスフェクション試薬を含む媒体を新鮮な完全な細胞培養培地 (1 mL/ウェル) に置き換えることによって、メディアを変更します。
- 4 日目: 共焦点の顕微鏡検査6を使用してセルをイメージします。イメージングの 2 つのチャネルを使用して: グリーン チャンネル (励起 458 nm、発光 570 695 nm) 通常ミトコンドリアと mitophagy を受けている赤のチャネル (励起 561 nm、発光 570 695 nm) ミトコンドリアを視覚化する視覚化するため。ランダム イメージの各ウェルに 100-200 セルの合計をカバーする 40 倍の倍率で 20 の領域。
- データ解析を実行します。「Mitophagy 指数」を計算する (mitophagy を受けているミトコンドリアの割合)、赤と緑の両方のチャネルに蛍光性量を定量化する画像解析ソフトを使用して: 赤 + 緑の蛍光レッド蛍光の比を取ると100 で乗算6。
注: トランスフェクションする代替方法は、mt 桂馬安定発現 HeLa 細胞ライン14を使用してあります。以来、HeLa 細胞は、パーキンを表現しない、パーキン、安定パーキン依存 mitophagy 細胞を研究に表されます。
- 1 日目: ひと初代細胞 (例えば、線維芽細胞) または不死化ひと細胞 (例えば、Hela 細胞または U2OS のセル) のいずれかを使用します。種子約 0.3 1 × 106 6 ウェル プレートで (次の日に 70% の confluency に到達する細胞を許可するセルの成長率) によって細胞/ウェル。完全な細胞培養培地で細胞を維持 (10% ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 培 FBS、および 1% 混合ペニシリン ストレプトマイシン溶液)、37 ° C で細胞文化のインキュベーターで孵化させなさいと (20% O25 %co2).6 ウェル プレートで 1 mL 完全な細胞培養培地/ウェルを追加します。
- シトクロム C 酸化酵素サブユニット II (COXII) と LAMP2 の間の共存を使用して mitophagy の検出
注: COXII はミトコンドリアのゲノムでエンコードされた内膜タンパク質です。Mitophagy インデックス COXII COXII の総額の割合として表される LAMP2 と結果の比に等しくなります。- シード HeLa 細胞 (または 1.1.1 の手順に記載されている興味の他のセル) セルに 4 もチェンバー スライド (1 5 × 104セル 1 mL 完全な細胞培養培地/ウェル) 文化 (20% O2, 5% CO2) 37 ° C でインキュベーター一晩。
- 10 mM カルボニルの 3.0 μ L (フッ素系低分子) - 4 - phenylhydrazone (FCCP) をシアン化物し、3 h の携帯文化のインキュベーター (ステップ 1.2.1) で孵化を追加します。
注: mitophagy に影響を与える他の薬を使用する可能性があります。 - 風邪よく/1 mL で 2 回細胞を洗い、培養培地 1 mL ピペットを使用してを削除 (0-4 ° C) 1 × PBS。ソリューション次の洗濯の前に 10-30 秒間座ってみましょう。各ウェルに 1x PBS で 0.5 mL 3.7% パラホルムアルデヒド (PFA) を追加し、セルを修正する氷の上 10 分間インキュベートします。
注意: PFA は毒素です。PFA を使用する場合は、ヒューム フードで働いてください。 - 1 mL ピペットを使用して PFA 液を捨て、二度と寒い 1 セルを洗浄して X PBS (1 mL/よく聞かせて座って 10 ソリューション次の洗濯の前に s)、1 ml/0.25% 洗剤 (1 × PBS) で 10 分間氷の上のセルを permeabilize と。
- 優しく冷たい 1 × PBS と破棄で 2 回細胞を洗い、permeabilizing バッファーを破棄 (解決策は 10 間座ってみましょう洗浄の間 s)。1 ml/FB 1 × PBS の一夜 4 ° C で 5% の細胞をブロックします。水分の損失を防ぐためにチャンバーをカバーします。
- 0.5 - 1 の COXII 抗体 (マウス、希釈 1: 250) と 5 %fbs、氷の上の店と 1 × PBS の LAMP2 抗体 (ウサギ、希釈 1:20-1:50) の混合抗体溶液 0.5 mL/ウェルを準備 h。
- 部屋が寒いから 4 よくチェンバー スライドを取り出し、1 mL ピペットでブロッキング液を破棄します。水洗いして 1 mL で 2 回/冷たい 1 × PBS と破棄の細胞 (解決策は 10 間座ってみましょう s 洗浄の間)、その後 0.5 mL を追加/よく混合抗体溶液の。37 ° C 低速でシェーカーで 1 時間インキュベートします。
- 1 mL ピペットを使用して最初の抗体溶液を破棄し優しく 3 回 1 mL/冷 1x PBS のセルを洗浄し、破棄します。ソリューションが 10 のために座ってみましょう次の洗濯の前に s。1: 250 5% 希釈で (例えば、波長 568 nm の赤色けい光たんぱく質 (RFP) LAMP2; のためにヤギ抗家兎とヤギ抗マウス COXII の緑色蛍光タンパク質 (GFP) の波長 488 nm) の蛍光の二次抗体の 1 mL/井戸を追加します。1x PBS で政府短期証券。アルミ箔 4 よくチェンバー スライドをカバーし、37 ° C 低速でシェーカーで 1 時間インキュベートします。
- 1 mL ピペットで 2 番目の抗体溶液を破棄します。6 回 1 mL/冷 1x PBS のセルを優しく洗います。ソリューション次の洗濯の前に 1 分間座ってみましょう。
- DAPI でメディアを antifade マウントの 50 μ L/ウェルの細胞をマウントし、カバー スリップを追加します。
- 倍率と浸漬オイル x 66 と共焦点顕微鏡下で細胞をイメージ (タイルをスキャン/モザイクを使ってソフトウェアを用いたセルの数を拡大すること)。同じ設定などすべてイメージング プロセス (詳細についてを参照してくださいソフトウェア指示)15, デジタル オフセット デジタルゲイン チャネル露光時間などを使用します。
- 100 の少なくとも 20 のランダムな画像を定量的に解析するソフトウェア細胞15共局在解析を使用します。「閉じたベジエ」関数を使用して、個々 のセル全体を選択。RFP、加重または非加重、mitophagy 細胞レベルでの分析を決定するために GFP のピアソンの共存の係数を比較します。分析全体の共局在解析ソフトウェアの水平および垂直方向の十字の値を維持します。これらの十字線を正確に設定するには、セルの 2 つの余分なセットを準備し、1 つの COXII および他の LAMP2 ラベルを付けます。次に、各チャネル15のピクセル分布上直接照準を設定 (詳細についてはソフトウェアの指示を参照してください)。
- Mitophagy スクリーニング測定をイメージング高スループット
注: 大規模化合物ライブラリーから mitophagy を誘発するまたは mitophagy を阻害する化合物の高速画面を実行する技術的に要求しています。オートファゴソームとミトコンドリアの共局在に基づく画像処理技術は mitophagy16をスクリーニングのより単純なまだ非常に重要な選択肢です。- 1 日目: シード 96 ウェル プレートでの細胞 (例えば、5,000 セル/100 mL 細胞培養媒体/ウェルで線維芽細胞主) (ステップ 1.1.1 を参照)。
- 2 日目: 指定されたインキュベーション時間の FCCP や関心の他の化合物と 2 日目からセルを扱う (1.2.2 の手順を参照してください)。
- 次の手順 1.2.2-1.2.9 COXII の一次抗体を使用して (マウス、5% 希釈 1: 250 FB 1 × PBS の) と LC3B (ウサギ、1: 100-5% 希釈 1: 200 1x PBS で FBS)。また、COXII と LAMP2 の一次抗体を使用することがあります。
- 蛍光リーダー16を使用してセルをイメージします。ランダムに配置されたフィールドと最小 500 細胞/ウェルの画像を収集します。
- セルのカスタマイズされた分析プロトコル16を使用してデータを分析します。
2.線虫の Mitophagy の検出
注:線虫は個体レベルでの mitophagy を試金するためのプラットフォームを提供します。2 系統は mitophagy の監視に使用することができます: (1) ミトコンドリア標的ローゼラ (mtRosella) または (2) mitophagy 受容体 DCT 1 LGG 1 融合 Discosoma sp. 赤色けい光たんぱく質 (下流)5, autophagosomal マーカーと一緒に GFP 融合17。
- ローゼラ バイオ センサーを用いた監視 Mitophagy
注: ローゼラは pH に依存しない下流 pH 感受性 GFP バリアントに融合を組み合わせた分子バイオ センサーです。ローゼラ バイオ センサーでは、pH の違い酸性リソソーム (pH 〜 4.5) と他の細胞コンパートメントを活用します。このバイオ センサーは正常に酵母と HCT116、HEK293、hela 細胞の18,19など、いくつかの哺乳類の細胞ラインで mitophagy を監視するために使用されています。我々 はこの汎用性の高いデュアル蛍光レポーターを適応し、生成トランスジェニックc. の elegans線虫体壁筋細胞のミトコンドリア標的ローゼラ (mtRosella) を表現します。Mitophagy 誘導は、mtRosella 蛍光の減らされた GFP/した DsRed 比率で示されます。- 1 日目:エシェリヒア属大腸菌(OP50) 解剖顕微鏡5を使用して、シード線虫成長メディア (NGM) プレート体壁筋細胞のミトコンドリア標的ローゼラ (mtRosella) を表現するワームの L4 幼虫を選択します。少なくとも 3 つの 3.5 cm プレートに 10-20 ワーム/プレートを配置します。基準温度 20 ° C5の線虫を孵化させなさい。
注: は、L4 幼虫20、および 1 つの場所から別の21にワームを転送するために使用を選択する方法の識別を含むワームの解剖学のリファレンスを参照してください。 - 5 日目: 15 20 L4 遺伝子組換え幼虫を選択することによって線虫の同期し、新鮮に転送する OP50 シード NGM プレート。実験条件ごとの少なくとも 5 つのプレートを使用します。
- 7 日目: は、興味やポジティブ コントロールの mitophagy に影響を与える薬を車両のプレートを準備します。
- 細菌エシェリヒア属大腸菌(OP50) mitophagy 誘導物質が細菌によって代謝されていないことを確認する紫外線の 222 μ/cm2 (輝度) 15 分 NGM プレートを公開することによって種を殺します。プレートは、2,000 J/m2を公開する必要があります。
注: 秒必要な露出 = 2,000/((intensity in µW/cm2) * 100)。 - 興味の化合をシード NGM プレートの最上部に追加します。ネガティブ コントロールとして複合車両 (溶媒をジメチルスルホキシド (DMSO) などの化合物を溶解するために使用) の相当額を車両のプレートに追加します。Mitophagy 誘導、ミトコンドリア毒性物質の肯定的な制御のパラコート (最終濃度が 8 mM) が使用されました。DdH2O 治療グループの寒天プレート上の 190 μ L で 8 M パラコート株式の 10 μ L を含むソリューションに追加します。車両グループの DMSO の ddH2O 寒天プレート上に 190 μ 10 μ L を含むソリューションを追加します。
注: パラコート作業ソリューション保管で 1 ヶ月 4 ° C で - 薬までプレートを軽く旋回または車両全体の表面をコートします。ワームを転送する前に、少なくとも 1 時間室温で閉じた蓋を乾燥するプレートを許可します。
注意: 薬板は、それが固化する前に、液体 NGM に薬を追加することによっても用意できます。
- 細菌エシェリヒア属大腸菌(OP50) mitophagy 誘導物質が細菌によって代謝されていないことを確認する紫外線の 222 μ/cm2 (輝度) 15 分 NGM プレートを公開することによって種を殺します。プレートは、2,000 J/m2を公開する必要があります。
- 7 日目: 2 日古い大人のトランスジェニック動物パラコート、興味、または車両 (DMSO) の化合を含んでいる版 2.1.2 手順で準備の 10-20 を転送します。2 日間の 20 ° C でトランスジェニック動物を孵化させなさい。
- 9 日目: 準備 2% アガロース パッド (補足資料を参照してください)。20 mM 中のレバミゾールの M9 パッドごとに、1 つの液滴 (10 μ L) を追加します。M9 レバミゾール ドロップでそれらを配置することによって画像のトランスジェニック動物を固定化します。ゆっくり上に観察を配置します。
- 落射蛍光顕微鏡に接続されているカメラを使用して単一のトランスジェニック動物をキャプチャします。全体遺伝子組換え線虫体壁筋細胞 10 X 倍率5で mtRosella を表現する蛍光画像を取得します。収集した画像を保存します。
- ImageJ ソフトウェアで取得した画像を処理します。腸組織の自家蛍光を避けるためにワームのヘッドに位置する体壁筋細胞を分析します。それぞれの動物の頭部のみ各蛍光画像の平均ピクセル強度値と合計領域を測定します。関心の特定の領域を分析します。
- 画像を変換する 'イメージ' と '色' ドロップ ダウン メニューの下 'チャネルを分割」を選択します。
- 関心のある蛍光領域をキャプチャする「フリーハンド選択」ツールを利用します。
- '分析' ドロップ ダウン メニューの下の「測定」コマンドを選択し、ピクセル強度解析を実行します。
- ピクセル強度は、強度分析総面積で除算して正規化する必要があります。正規化時にした DsRed 比22に GFP を計算します。
- いずれかのソフトウェア実施学生t統計的分析を使用-テスト (2 つのグループの比較) または重要な5,17 p < 0.05 を統計分析の分散 (複数のグループ間での比較).
- 1 日目:エシェリヒア属大腸菌(OP50) 解剖顕微鏡5を使用して、シード線虫成長メディア (NGM) プレート体壁筋細胞のミトコンドリア標的ローゼラ (mtRosella) を表現するワームの L4 幼虫を選択します。少なくとも 3 つの 3.5 cm プレートに 10-20 ワーム/プレートを配置します。基準温度 20 ° C5の線虫を孵化させなさい。
- DCT 1 と LGG 1 間の共局在を使用して mitophagy の評価
注: DCT 1 はその推定における第オーソロガス BNIP3 とニックス/BNIP3L 哺乳類5に近い状況をストレス反応における mitophagy 受容体として機能する外のミトコンドリア膜タンパク質です。したがって、mitophagy 開始は DCT 1 mitophagy 受容体と autophagosomal 膜タンパク質 LGG-1 (哺乳類の LC3 の相同物) の間の共局在によって評価されます。- 1 日目: 体壁筋細胞5 OP50 に DCT 1::GFP と DsRed::LGG 1 の両方を表現するトランスジェニック動物のピック L4 幼虫シード NGM プレートです。5-10 ワーム/3.5 cm プレートを配置し、少なくとも 3 つのプレートを使用します。20 ° C で線虫を孵化させなさい
注: 遺伝子は独立したプラスミドにあるし、彼らはゲノムに統合されていません。Rol-6(su1006)とpの墓 2 GFP contransformation マーカーを運ぶ線虫を拾います。両方の contransformation マーカー遺伝子組換えワーム表現 DCT 1::GFP と体壁筋細胞の DsRed::LGG 1。 - 2.1.2-2.1.5 から手順に従います。
- 画像 1 つ体壁筋細胞の共焦点顕微鏡5,23に接続されているカメラを使用して。全体の体壁筋細胞の境界線を検出し、取る z スタック画像下 63 倍の倍率。高倍率を使用もできます。
- 開き、共焦点のソフトウェアで画像を処理します。Mitophagy の開始は、autophagosomal のマーカー (DsRed::LGG-1) に mitophagy 受容体 (DCT 1::GFP) の共局在によって示されます。体壁筋細胞5の各スタック内の共局在イベントを手動で測定します。(レンズ、拡大鏡、フィルター、露光時間、解像度、レーザー強度、ゲイン、等) はすべて顕微鏡とカメラの設定の実験全体で一貫性を保つことが不可欠です。すべての設定は注意してください。
- いずれかのソフトウェア実施学生t統計的分析を使用-テスト (2 つのグループの比較) または重要な5,17 p < 0.05 を統計分析の分散 (複数のグループ間での比較).双方向比較用スチューデントのt-テスト (p < 0.05 は、重要とみなされます)。複数の比較ボンフェローニのホックを投稿テストによって修正 (ANOVA) の単一の要因分散分析を使用します。少なくとも 50 70 動物や実験条件ごとに 30-50 体壁筋細胞の分析をお勧めします。少なくとも 3 回実験を繰り返します。
- 1 日目: 体壁筋細胞5 OP50 に DCT 1::GFP と DsRed::LGG 1 の両方を表現するトランスジェニック動物のピック L4 幼虫シード NGM プレートです。5-10 ワーム/3.5 cm プレートを配置し、少なくとも 3 つのプレートを使用します。20 ° C で線虫を孵化させなさい
3. マウスの Mitophagy の検出
注: マウスの mitophagy を検出する以前の方法は、面倒な小文字を区別しない、定量化することは困難が。蛍光レポーター桂馬のミトコンドリアをターゲットとした形を表現するトランスジェニック マウス モデル (mt 桂馬) は、生理学的および病態生理学的条件の広い範囲で mitophagy のレベルを評価するために今利用できます。
- 14の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルを使用してマウスを安楽死させます。
- 手足をピンを使用して作業を行うプラットフォームにマウス (を腹側) を保護します。肝臓24を公開するマイクロサージェリーはさみや鉗子を使用して下腹部に切開を行います。肝臓 (例えば1 × 1 × 1 cm で右葉の部分) の部分をカット マイクロサージャリーはさみと鉗子を使用しています。
注: マウスの mitophagy の検出は複雑であり、マウスの解剖学と非常に巧みなマウス処理とマウス外科の知識が必要です。このプロトコルは、このメソッドの重要な基本的なステップを提供しより詳細な方法は利用できる24。 - 組織を急速に冷やすための氷の上の金属板に肝のサンプルを置きます。冷たい金属板の組織を維持し、可能な限り迅速に処理します。解離の 1 h 以内使用最適、です。
- カーブタイプ鉗子を使用して肝臓のサンプルを持ち上げ、5 mL の冷たい 1x PBS ですすいでください。
- ヘラのスプーンの端を使って氷の上肝臓をシャーレ (Ø 100 mm) に転送します。
- 切り肝臓サンプル手で 0.5-1 mm 厚いセクション シングル エッジの刃を使用します。
- 慎重に組織切片を顕微鏡手術鉗子を用いたガラス底皿に転送します。
- 慎重に底面を平らに鉗子で肝のセクションを設定します。
- スライスした肝冷 1x PBS の 3-5 滴をカバーします。
注: は、特定の組織 (例えば脳)24への関心の領域を識別する勧め DAPI 染色します。リソソームと赤 mt 桂馬信号の共局在を検証するため、デキストラン カスケード ブルー、lysosensor などのライソゾーム染料は使用される24をすることができます。 - 2 つの連続した励起24経由共焦点顕微鏡下組織切片をイメージします。2 つの画像のチャンネルを設定:「グリーン」mt 桂馬チャネル (励起 458 nm、発光 570 695 nm の範囲) と「赤」mt 桂馬 (励起 561 nm、発光 570 695 nm の範囲)。実験条件のイメージング設定を維持します。効率的なイメージングの 2 つの動物を一度に分析します。
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Representative Results
ひと細胞における Mitophagy の検出:
ここに示す手順を使用して、人間の HeLa 細胞は mt 桂馬プラスミドを導入させた。健康な細胞を示したよく組織化されたミトコンドリア ネットワーク (GFP、488 nm) と mitophagy のいくつかの発生率 (RFP、561 nm)。しかし、細胞ミトコンドリア ランプ FCCP 前処理 (3 h の 30 μ M) mitophagy 発生率 (図 1 a) の深遠な増加を展示します。Mitophagy はまた LAMP2 と COXII (図 1 b) の間の共局在を使用して測定しました。
線虫の Mitophagy の検出
酸化ストレスなど通常と mitophagy を誘発する条件下での GFP 融合 LGG 1 と mtRosella または DCT 1 と融合した DsRed 発現組換え線虫の細胞体壁筋を調べた。トランスジェニック動物は、パラコート (2 日間 8 mM) にさらされました。Mitophagy 誘導は、mtRosella 蛍光 (図 2 a) の減少した DsRed GFP/比で示されます。さらに、昇格した DCT 1::GFP と DsRed::LGG 1 信号間の共局在のイベント数は酸化ストレス (図 2 b) mitophagy 刺激を意味します。
Mitophagy mt 桂馬のマウスを使用しての検出:
Mitophagy生体内での画像解析正常と病態生理学的条件下で mitophagy に洞察力を提供します。上記プロトコルを使用して、肝臓、小脳 (図 3) などの異なる臓器組織における mitophagy の発生は、共焦点 mitophagy を視覚化できます。
図 1。ひと細胞での mitophagy を評価するさまざまな方法です。(A) 人間 HeLa 細胞が両方 488 でイメージングに続いて 3 日間、トランスフェクション mt 桂馬プラスミドと nm と 561 nm。肯定的な制御として ceflls は、イメージングに FCCP (30 μ M) 3 h 前と扱われました。(B) LAMP2 (RFP) と COXII (GFP) 染色一次線維芽細胞の画像。ひと線維芽細胞 (C) 画像は、アンチ TOM20 (赤) と抗 LC3 (グリーン) 抗体染色。右側のバーは、オートファゴソームと共同をローカライズするミトコンドリアの読み出しを見る。エネルギッシュなストレス (無料のグルコース ガラクトース メディア) と (A) の 24 h. 代表的なスケール バーのライソゾーム阻害剤 E64d とペプスタチン A (EP) 添加により共局在が増加 (B) および (C) 最後のラベル独立して各パネルのない図します。平均 ± S.E.M. の定量的なデータが表示されます * * *p < 0.001;t-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。線虫の mitophagy のin vivo検出。(A) 遺伝子組換え線虫体壁筋細胞における mtRosella の発現は 8 mM パラコートと扱われました。Mitophagy 刺激は pH に敏感な pH に依存しない下流に GFP の減少比率によって示される (n = 50; * * *p < 0.001;t-テスト)。矢印は、腸内の自家蛍光を指摘します。スケール バーは、20 μ m の範囲取得の詳細を示す: 露出時間、200 ms;一方、中程度。10 倍の対物レンズを使用して画像を取得しました。定量的なデータは、平均 ± S.E.M. 値のとおりです。(B) 遺伝子組換え線虫 LGG 1 融合した DsRed 体壁筋細胞における autophagosomal タンパク質と GFP 融合 DCT 1 mitophagy 受容体の共発現は 8 mM のパラコートにさらされました。Mitophagy 誘導は GFP の共局在によってシニフィエし、下流の信号 (DCT 1 の画像の各グループがトップ、以下、赤でオートファゴソーム; 下部にマージされた画像の緑色で表示され n = 30; * * *p < 0.001;t-テスト)。販売バーは 20 μ m の範囲取得の詳細を示す: 解像度 1,024 × 1,024;マスターを得るため、トラック 1: 562 とトラック 2: 730;放出フィルター、トラック 1 チャンネル 1: 639 nm とトラック 2 チャンネル 2: 519 nm;レーザー強度、トラック 1 (543 nm): 12.9% とトラック 2 (488 nm): 39.4%。40 倍の対物レンズを使用して画像を取得しました。定量的なデータは平均 ± S.E.M.,この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。Mitophagy mt 桂馬トランスジェニック マウスでのin vivo検出します。肝臓 (上部) と mt 桂馬マウスの小脳エリア (プルキンエ細胞、下部のパネルを含む) における mt 桂馬信号の代表的な画像 (458 nm、緑; 561 nm、赤色)。スケール バーを示します 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
Mitophagy の正確な測定は技術的に要求しています。ここでは、我々 は mitophagy の両方の定性的検出と最も一般的な実験室の実験モデルで mitophagy レベルの定量化を可能にする堅牢な手法を提示しています。
レプリケート可能なデータを取得するには、少なくとも 3 つの生物学的繰り返しで実験デザインが必要です。実験や解析に関与するすべての研究者は、実験グループの id に盲目にする必要があります。さらに、映像分野選ばれなければならないランダムに画像取得中。細胞培養および線虫の研究は、生物学的に少なくとも 3 つの繰り返しを実行してください。Mt 桂馬マウス研究は、統計的有意性を達成するためにマウスの十分な数を使用することをお勧めします。哺乳類セルの各実験のための 30-100 個の細胞を分析し、少なくとも 3 つの実験を実行します。品質管理の手順でにより、レプリケート可能な結果です。酵母における mitophagy の検出は最近要約他25。
Mitophagyの in vitro検出の技術のいくつかの重要な手順があります。トランスフェクション試薬・ DNA の品質に依存する使用、mt 桂馬タンパク質のトランスフェクションの中に不可欠です。したがって、さまざまな条件 (例えば、別のセルの行を使用して) のトランスフェクション効率の最適化が必要です。LAMP2/COXII メソッドの抗体の特異性と最適な一次抗体希釈倍画像の品質に影響を与えるし、実験を開始する前にテストする必要があります。抗体の品質と希釈が重要、高コンテンツ イメージング法も同様です。自動顕微鏡システムとカスタマイズされた分析プロトコル イメージングと解析、少なくとも 1,500 セル/条件、その他生体内イメージング ベース手法と比較して非常に堅牢な結果になることができます。さらに、分析のプロトコルは、mitophagy 研究で非常に有用なあるセルごとに長さや合計などさらにミトコンドリア パラメーターにデータを提供します。
いくつかのケースでは、LAMP2 の TOMM20 などのミトコンドリア外膜蛋白質との共存を試金することをないお勧めします。Mitophagy の非常に初期の段階は、TOMM20 と Mitofusin 1 (MFN1) を含むミトコンドリア外膜タンパク質のユビキチン化のパーキン媒介を含みます。パーキンは、26 s プロテアソームによるタンパク質の分解を促進する K48 リンク ユビキチン鎖を含むこれらのタンパク質に複数の異なるユビキチン チェーン リンケージを抱合体します。したがって、にもかかわらず、mitophagy はブロック6これらおよびミトコンドリア外膜タンパク質は劣化まだ。これは、全体的なデータの解釈で、偽陽性の結果データをスキューできます。さらに、ミトコンドリア DNA (mtDNA ユーグレナグラシリス) の除去は、mitophagy の二番目のインジケーターと抗 DNA 抗体6を使用して蛍光抗体法により定量化することができます。
線虫の体内の mitophagy を監視するためのいくつかの重要なステップを以下に示します。
1. 新しいプレートに混合された人口や飢餓、自体につながる子孫の副産物を避けるためにすべての 24-48 h お勧めトランスジェニック動物の転送は、mitophagy を引き起こす可能性があります。したがって、非飢えた線虫を使用する必要があります。
2. レバミゾールは線虫類の固定に使用される穏やかな麻酔です。アジ化ナトリウムなどのミトコンドリアの活性に影響を与えることができる麻酔薬は避けてください。アジ化ナトリウムは、ミトコンドリアの呼吸鎖のコンポーネントをブロックし、ミトコンドリアおよび酸化ストレスにつながるエネルギー生成の摂動します。したがって、アジ化ナトリウムは mitophagy をトリガーする可能性があります。
3. 顕微鏡検査の間に乾燥する、標本はできません。したがって、浸透の有利な条件を確保するのには、水の代わりに M9 バッファーの使用の使用をお勧めします。
4. 腸の蛍光は、線虫の年齢とともに増加します。したがって、顕微鏡検査中、腸に近い体壁筋細胞は避けるべき。
5. パラコートが mitophagy を誘導するために失敗した場合: a. b.ワームにパラコート露出時間が長く増加パラコート濃度またはcは、その効率は時間の経過とともに低下するのでパラコートの新鮮な作業ソリューションを準備します。
6 matricidal の孵化を増加した場合はワームかパラコート、公開で観察される: a削減パラコート治療期間、 b.減らすパラコート濃度フルオロデオキシウリジン (FUdR) (最終的なc.サプリメント板100-400 μ M の濃度)、卵の孵化、またはdを防ぎます DNA 合成阻害が古いワーム (例えば4 日古いワーム) で実験を行います。
この手順では、図 3に示すように、mt 桂馬のトランスジェニック マウスを用いた肝臓の mitophagy をイメージングするための手順について説明します。脳と肝臓以外の組織は mt 桂馬システム14を使って解析しました。肝組織内における二重励起比撮像は、2 つの連続した励起を介して取得されます。すべての画像は、たて摘出した臓器から取得する必要があります。検討組織保管すべき寒さと加工可能な限り迅速に。あらゆる年齢層で肝スライスを取得ことができます。Mitophagy をイメージングと顕微解析中に各器官のレーザー力および露出回数を最適化します。レーザー出力は、mt 桂馬信号14明確に可視化を可能にする最低出力で設定必要があります。ただし、mt 桂馬 transgenic マウスのためのいくつかの制限があります。固定ライソゾーム膜 pH 勾配の損失と同様、桂馬の不安定性、のためこのマウス モデルを用いて電子顕微鏡や免疫組織化学に適してではありません。別の制限は、mt-桂馬、またはこの蛋白質のマトリックス集計可能性がありますに影響を与える未知のミトコンドリアや細胞の機能にもかかわらず、ミトコンドリアの酸素消費率14は変更されません。さらに、mt 桂馬マウスに関連付けられているコストと時間は前述の細胞培養およびc. の elegansメソッドよりも高スループット分析のための望ましい少ないレンダリングされます。ここで説明した方法以外にもその他さまざまな mt 桂馬マウスで mitophagy を定量的研究は西部のしみまたは FACS を含めます。Mt 桂馬トランスジェニック マウスに加えて、別の mitophagy マウス モデルがあるに注意する、「水戸-QC"pH に敏感な蛍光ミトコンドリア信号26トランスジェニック マウス モデル。複雑さと mitophagy のダイナミクス、電子顕微鏡検査、ウエスタンブロット、調査結果を強化するなど、他の共通の mitophagy 検出方法と前述の蛍光方法を組み合わせることをお勧めします。
ここに挙げたなど新しい mitophagy 検出技術の開発でお越しの際にも高スループット薬物画面に mitophagy の解明からの広範なアプリケーション。その mitophagy は内因性と外因性の変動 (例えば、細胞密度、飢餓、低酸素状態などの細胞培養条件) の影響を受けやすいことに注意してください。1,5,8します。 したがって、同じ実験条件は、すべての実験で維持されることが重要です。In vitroとin vivoの研究で異なる mitophagy の検出方法の組み合わせを使用して mitophagy 状態の正しい解釈を確認することが重要です。Mitophagy 検出の新しいより正確な方法の開発により、記載されている、技術を通じた mitophagy の機構のさらなる理解できます。
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Disclosures
ボーア研究所は、ChromaDex とグラクソ ・ スミスク ラインの CRADA 手配をしてください。
Acknowledgments
Mt 桂馬プラスミドを共有、宮脇敦史博士と博士リチャード j. もちろん感謝、mt 桂馬は Hela 細胞を統合します。原稿の重要な読書、Raghavendra a. Shamanna と博士デボラ ・ l ・ croteau さんに感謝します。この研究は、NIH (VAB) の学内研究によって支えられた、2014-2015 と同様、高齢化、国立研究所と 2016-2017 NIA の内研究室 (EFF、VAB) を付与します。EFF は HELSE SOR OST RHF によって支えられた (プロジェクト No: 2017056)、ノルウェーの研究評議会 (プロジェクト No: 262175)。
著者の貢献:
EFF は、原稿を設計し、下書きを準備KP、NS、EMF、RDS、ジャンパー スカート、SAC、YH、エドを書いた用紙の別のセクションNT、JP、HN、VAB 原稿し、専門知識を提供します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | serum-free medium |
| mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII antibody (mouse) | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 antibody (rabbit) | NOVUS | #CD107b | |
| goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 dye |
| goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 dye |
| prolong gold antifade with DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6-well plate | SIGMA Corning Costar |
#CLS3516 | |
| 4-well chamber slide | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96-well plate | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B antibody rabbit | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA antibody | Progen Biotechnik | #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | antifade mounting medium with DAPI |
| IN Cell analyzer (fluorescent reader ) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e confocal microscope | Nikon | #TE-2000e | |
| Colocalization software | Volocity | #Volocity 6.3 | alternative Zeiss ZEN 2012 software |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| cell culture medium | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Cell culture Incubator | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator | |
| epifluorescence microscope | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| camera | Olympus | Olympus DP71 | |
| confocal microscope | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| confocal software | Zeiss | ZEN 2012 | |
| image analysis software | Image J | colocalization analysis, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| material to make a worm pick | Surepure Chemetals | #4655 | The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire |
| IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | Maintain transgenic animals at 20 °C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | Material inquiry to Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat solution | see supplementary data for preparation | ||
| M9 buffer | see supplementary data for preparation | ||
| M9-levamisole buffer | see supplementary data for preparation | ||
| Glass Microscope Slides and Coverslips | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Surgical forceps | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| Surgical scissors | STERIS Animal Health | 19 Piece Canine Spay Pack Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O |
| shaker | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A |
| 2% agarose pad | see supplementary data for preparation | ||
| Vibroslice blades | World precision instruments | #BLADES-2 | single-edge blade |
| metal plate | MSC | #78803988 | 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet |
| Triton X-100 | detergent | ||
| Methyl viologen dichloride hydrate | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubator for nematodes | AQUALYTIC | Incubator to maintain 20 °C | |
| Dissecting stereomicroscope | Olympus | SMZ645 | |
| Confocal microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | For nematodes (step 2) |
| epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImager Z2 | For nematodes (step 2) |
| UV crosslinker | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | UV light source; 356 nm |
References
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A.
- Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Fivenson, E. M., et al.
- Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
- Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
- Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
- Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16 (2012).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
- Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
- Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397 (2015).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215 (2017).
- Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
- Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Eiyama, A., Okamoto, K.
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).
