Summary
Une plate-forme de molécules simples pinces magnétiques pour manipuler les G-quadruplexes est signalée, qui permet l’étude de stabilité G4 et règlement de diverses protéines.
Abstract
Structure secondaire de l’acide nucléique non canonique G-quadruplexes (G4) sont impliqués dans divers processus cellulaires, telles que la réplication de l’ADN, transcription, ARN et l’allongement des télomères. Au cours de ces processus, diverses protéines se lient et résoudre les structures G4 pour remplir leur fonction. Comme la fonction G4 dépend souvent de la stabilité de sa structure repliée, il est important d’étudier comment les protéines liant le G4 régulent la stabilité du G4. Ce travail présente une méthode pour manipuler les molécules G4 uniques à l’aide de la pince à épiler magnétique, qui permet des études de la régulation des protéines liant le G4 sur une seule molécule G4 en temps réel. En général, cette méthode consiste à une étendue des applications dans les études des interactions entre protéines/ligands et des règlements sur diverses structures secondaires d’ADN ou d’ARN.
Introduction
Quatre brins ADN ou ARN G4 structures jouent un rôle crucial dans de nombreux processus biologiques importants1. Beaucoup de protéines est impliquées dans la liaison G4 et de règlement, y compris les protéines de liaison des télomères (télomérase, POT1, TEBPs, RPA, TRF2)1,2, facteurs de transcription (nucléoline, PARP1)3, protéines (hnRNP A1, ARN hnRNP A2)4et réplication de l’ADN hélicases (BLM, FANCJ, RHAU, AVT, Dna2, Pif1)5associés protéines (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. La liaison aux protéines peut stabiliser ou déstabiliser les structures G4 ; ainsi réguler les fonctions biologiques ultérieures. La stabilité du G4 a été mesurée par thermal fusion à l’aide de rayons ultraviolets (UV) ou de méthodes de dichroïsme circulaire (DC)7. Toutefois, ces conditions ne sont pas physiologiques pertinentes et sont difficiles à appliquer à l’étude des effets de liaison des protéines7.
Le développement rapide des technologies de manipulation de la molécule unique a permis à des études de pliage et dépliage d’une biomolécule, tel qu’un ADN ou une protéine, à un niveau de molécule unique avec une résolution nanométrique en temps réel8. Microscopie à force atomique (AFM), pinces optiques et magnétiques pincettes sont les méthodes de manipulation de la molécule unique plus couramment utilisés. Par rapport à l’AFM et pinces optiques9, pincettes magnétiques permettent des mesures stables de pliage-dépliage de la dynamique d’une seule molécule au cours des jours en utilisant une technique de anti-dérive10,11.
Ici, une plate-forme de manipulation de la molécule unique à l’aide de pincettes magnétiques pour étudier la régulation de la stabilité du G4 par des protéines de liaison est signalé12,13. Cet ouvrage décrit les approches de base, y compris les échantillon et flux de préparation de canal, le programme d’installation de pinces magnétiques et la calibration de la force. Le contrôle de la force et les protocoles anti dérive comme décrit dans étape 3 permettent depuis longtemps des mesures de temps sous les divers contrôles de force, comme la force constante (pince de force) et constante de chargement note (force-ramp) et mesure de force-saut. Le protocole d’étalonnage de force décrit à l’étape 4 permet la calibration de la force de < 1µm sangles courtes sur une large force allant jusqu'à 100 pN, avec une erreur relative au sein de 10 %. Un exemple de règlement de la stabilité de l’ARN hélicase associée AU riche en élément (RHAU) hélicase (alias DHX36, G4R1) qui joue un rôle essentiel dans la résolution de que RNA G4 est utilisé pour démontrer les applications de cette plate-forme13.
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Protocol
1. préparation de l’ADN G4 pour seule molécule Stretching
- Prepare 5 '-thiol étiquetés et 5 '-biotine étiqueté dsDNA poignées par PCR à l’aide de polymérase DDNA sur une matrice d’ADN de phage lambda à l’aide de 5 '-thiol et 5 '-biotine amorces 14 ( Figure 1). Les deux poignées de dsDNA ont haute teneur en GC (> 60 %) pour éviter l’ADN fonte lorsque l’ADN est maintenu à des forces ou au cours de l’insuffisance de l’ADN de transition 15.
- Les produits de PCR purifier à l’aide d’un kit de purification commerciale et digest avec BstXI des enzymes de restriction selon le fabricant ' protocole de s.
- G4 ligate formant ADNsb et flanc ADNsb et dsDNA handles à l’aide de T4 DNA ligase selon le fabricant ' protocole s. Purifier le produit ligaturé en gel extraction à l’aide d’un kit de purification commerciale selon le fabricant ' protocole de s.
2. Préparation du canal d’écoulement
- lamelle nettoyage et fonctionnalisation de surface
- lieu bas lamelles couvre-objet (#1.5, 22 × 32 mm) et albums lamelles couvre-objet (#1.5, 20 x 20 mm) dans le couvercle en verre bocaux (chaque pot peut contenir 7 morceaux de lamelles, de coloration le volume est de ~ 20 mL). Rincer les lamelles dans les bocaux avec l’eau distillée, 2 - 5 fois.
- Ajouter ~ 20 mL de solution détergente de 5 à 40 % dans chaque pot et puis les placer dans un bain de nettoyage ultrasonique pour 30 min. Rincer à l’eau distillée pour > 10 fois pour enlever le détergent.
- Sécher les lamelles dans les pots au four (~ 150 ° C. Attention, chaud), ou de gaz 2 N. Stocker les lamelles albums séchés dans un placard sec.
- Plasma utilisation (O 2 gas) pour nettoyer les lamelles dans le bocal pendant 10 min. Au cours des 10 minutes, préparation 20 mL de solution à 1 % (3-Aminopropyl) triéthoxysilane (APTES) dans le méthanol (attention, toxique/inflammables). Utiliser une hotte chimique pour dissoudre APTES dans le méthanol.
NOTE : Éviter l’humidité lors du stockage solution APTES. Selon vieux souvent pose problème dans la fonctionnalisation de surface lamelles. - Immédiatement après le plasma nettoyage, ajouter toute la solution selon de 1 % dans les bocaux et incuber pendant 1 h. verser les déchets dans la bouteille déchets spécifique pour le méthanol selon 1 %. Effectuez les opérations axées sur le méthanol dans la hotte de laboratoire pour les produits chimiques inflammables.
- Rincer les bocaux une fois avec du méthanol et > 10 fois avec l’eau distillée et séchez-les de four (~ 150 ° C ; Attention, chaud). Stocker les lamelles selon-enduit de fond dans un placard sec, si ce n’est en cours d’utilisation pendant deux semaines.
Remarque : Après chaque étape secondaire de 2.1.1 à 2.1.4, le processus de nettoyage peut être interrompu avant la prochaine étape.
- Assemble le canal d’écoulement
- préparer deux " entretoises ", c.-à-d. parafilm ou double-face ruban (~ 4 × 20 mm) pour chaque canal. Placez les deux morceaux d’entretoises sur une lamelle de fond le long du bord long. Placez une lamelle supérieure sur l’entretoise, formant des cellules de circulation entre les deux (~ zone de 10 × 20 mm, Figure 2 a , B).
- Si parafilm est utilisé comme entretoise, placer le canal d’écoulement sur un appareil de chauffage (60-120 ° C ; Attention, chaud) pour 5-10 s tout en appuyant doucement sur les côtés de la lamelle supérieure à coller les deux lamelles de parafilm. Le canal d’écoulement qui en résulte a une hauteur de ~ 100 µm, et est ainsi le volume du canal ~ 20 µL.
- Joint le côté long de la chaîne avec la colle silicone pour éviter les fuites. Utiliser de la colle de silicone pour faire une petite structure d’évier-comme à chaque bord ouvert du chenal de flux, qui sert comme une entrée et une sortie de la solution.
NOTE : L’entrée et la sortie peuvent également par d’autres manières, par exemple, par l’adhérent aux petits anneaux en plastique à l’aide de cire. - Stocker des chaînes dans un placard sec jusqu'à 4 semaines.
- ADN d’attache sur la surface du fond du chenal d’écoulement
- diluer les billes de polystyrène amino-enduit (diamètre : 3 µm) par 200 X en distillée 1 X tampon phosphate saline tampon (PBS). Vortex la solution de perle et puis écoulement dans les canaux. Incuber la solution perle dans les canaux pour ~ 30 min. retirer tout perles décollées en lavant avec 200 µL de solution tampon PBS de X 1.
- Ajuster (hausse ou baisse) le temps d’incubation pour atteindre une densité de surface de 1-5 perles par surface de 50 x 50 mm. Stocker les chaînes avec les perles de référence a été déposés pendant 3 jours. Sulfosuccinimidyl
- diluer 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (Sulfo-CCAP) en poudre dans 1 solution de PBS de X (~ 0,5 mg/mL). Vortex la solution et puis couler dans le canal.
NOTE : Préparer une solution Sulfo-CCAP fraîche avant de l’utiliser et ajouter immédiatement à la chaîne pour éviter l’hydrolyse du CCAP. - Incuber la solution CCAP dans le canal pendant 30 min. enlever la solution de CCAP en lavant avec une grande quantité (1 mL, ~ 50 X le volume du canal) de 1 solution de PBS de X.
Remarque : Le laver soigneusement le CCAP excès. Cette étape est essentielle pour la liaison de l’ADN sur la lamelle couvre-objet. - ADN attacher
- diluer la thiol-biotine appelée ADN dans 1 X PBS, avec une concentration d’ADN résultante de ~ 0,3 nM. Pipetez doucement pour mélanger la solution, la solution d’ADN se jettent dans le canal de CCAP-enduit et incuber 30 min à température ambiante (~ 23 ° C).
- Laver doucement les ADN gratuit avec 200 µL de solution qui contient 1 X PBS avec 10 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,01 % de 2-mercaptoéthanol de blocage.
- Bloquer la surface du canal en incubant le canal en bloquant la solution (10 mg/mL de BSA, 0,01 % de 2-mercaptoéthanol) pour > 2 h ; après cette étape, le canal est prêt pour des expériences. Le canal préparé peut être conservé à 4 ° C pendant ~ 1 jour.
NOTE : La blocage étape est importante pour réduire les liaisons non spécifiques de l’ADN et des billes magnétiques pour les lamelles couvre-objet.
3. DsDNA pincettes Setup et Identification of Single magnétique d’attache
- installation de pincettes magnétiques
- début le magnétique pincettes contrôlent le programme. Ici, les pinces magnétiques étaient contrôlées par un programme LabVIEW écrit in-house.
- Aligner les centres de l’aimant devant la chaîne de montage. Utiliser un objectif 4 X pour régler les axes x et y des aimants dans l’axe optique du microscope.
- Utiliser un manipulateur motorisé commandé par ordinateur pour déplacer les aimants le long de l’axe z ( Figure 2 a) et régler la distance d = 0 (d : distance entre les aimants et la lamelle couvre-objet) lorsque les aimants joins à une lamelle sur le microscope.
- Programmer le mouvement des aimants par celui qui les manipule pour obtenir un contrôle de la force, y compris la force constante (c.-à-d., la constante d) et variables dans le temps la force F (t) (c.-à-d., variables dans le temps d(t )).
- Utiliser lumineux une source lumineuse à diodes électroluminescentes (LED) pour l’éclairage arrière-dispersés de la perle à travers l’objectif. Recueillir les images de perle à une fréquence d’échantillonnage de 100 Hz par un dispositif à couplage de charge (CCD) caméra. < / lJ’ai >
- échantillon d’installation et d’identifier d’ADN double brin unique attache
- formation d’attache
- doucement les flux en 200 X dilué M-280, paramagnétiques perles dans une solution de test (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7,4 ) dans un canal. Incuber pendant 10 min permettre les perles lier aux molécules d’ADN biotine-étiquetés immobilisés sur la surface enduite CCAP jusqu'à la fin de thiol-étiqueté. Laver doucement les perles non attachés à l’aide de 200 µL de solution de réaction standard.
Remarque : Les perles de M-280 montrent inférieur non-spécifiques à la surface par rapport aux autres billes magnétiques commerciaux tels que M-270.
- doucement les flux en 200 X dilué M-280, paramagnétiques perles dans une solution de test (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7,4 ) dans un canal. Incuber pendant 10 min permettre les perles lier aux molécules d’ADN biotine-étiquetés immobilisés sur la surface enduite CCAP jusqu'à la fin de thiol-étiqueté. Laver doucement les perles non attachés à l’aide de 200 µL de solution de réaction standard.
- Monter la chaîne sur la platine du microscope. Recherche de la perle sur la surface inférieure en utilisant 100 X objectif à immersion d’huile.
- Choisir une perle de référence sur la surface et une perle captif mobile. Construire les bibliothèques de l’image initiale de la perle de référence et talon captif à défocalisation différents avions.
- Calibration d’image de perles
- avant les expériences, utiliser un actionneur piézo-électrique objective d’obtenir des images de référence et perles attachés aux plans différents défocalisation espacées de 20 à 50 nm, qui sont stockés sous forme de deux images distinctes perle bibliothèques et sont respectivement indexé avec la distance de défocalisation ( Figure 2D).
- x, y, détermination de position z
- au cours d’expériences, déterminer la position du talon dans le plan x-y par le centre de gravité de perle. Déterminer la variation de la hauteur du talon captif en comparant l’image actuelle de la perle avec ceux stockés dans la bibliothèque. Utiliser l’analyse de fonction d’autocorrélation du spectre de puissance de la transformée de Fourier de la perle images 16.
- Anti-dérive feedback avec filet référence
- au cours d’expériences, utiliser le piezo à " serrure " la distance entre l’objectif et une image de perle de référence spécifique stocké dans la bibliothèque grâce à une faible fréquence contrôler vos commentaires, afin que l’image de la perle coincé a la meilleure corrélation avec une image spécifique, stockée dans la bibliothèque ( Figure 2D).
- Déterminer si la sangle est une molécule d’ADN double brin unique en appliquant ~ 65 AP force déterminer une molécule d’ADN double brin unique si la sangle subit l’ADN caractéristique surexploiter transition 17 , 18 , 19. Répétez le processus jusqu'à ce qu’une sangle unique dsDNA est trouvée. (Veuillez vous reporter à la section suivante pour la calibration de la force et l’ADN surexploiter la transition).
- formation d’attache
4. Étalonnage de forcer pincettes magnétiques
- déterminer directement la force (jusqu'à 100 pN) de longues molécules de (ADN λ bp 48 502) d’ADN à l’aide de la fluctuation de la perle à travers :
, où k B est la constante de Boltzmann, T est la température à l’échelle de Kelvin, δ 2 y est la variance de la fluctuation de perle dans la direction perpendiculaire au champ magnétique et la force direction. Dans ce sens, le mouvement du talon peut être décrite comme une fluctuation de la pendule d’une longueur de l + r 0, où l est la distance de bout en bout le long de la direction de la force (extension) de l’ADN, et r 0 est le rayon de la perle 10 ( Figure 3 a). - Déterminer la courbe d’étalonnage pour la force F en fonction des aimants à distance talon d et F (d) pour différentes perles en utilisant l’ADN long de λ. Habituellement, la distance entre l’aimant et la lamelle est utilisée comme l’ADN de la longueur d’attache peut être ignoré. Monter le F-d courbe de la fonction exponentielle double décomposition :
, où le raccord paramètres α1, α2, γ1, γ2 sont déterminées par le pince magnétique et le paramètre C est déterminée par la propriété hétérogène des billes magnétiques. En déplaçant le C, le F-d courbe obtenue à partir des perles différentes peut être superposées 10 ( Figure 3 b). - Calibration du paramètre C pour des billes magnétiques pour l’ADN courte expériences.
- La détermination de la force en se basant sur la fluctuation nécessite la position de perle à une fréquence plus élevée que la fréquence d’enregistrement :
, où γ est la traînée coefficient de la perle. Pour courts d’ADN à grande force, il faut enregistrement fréquence plus vite que le 100 Hz, par conséquent, la force ne peut pas être mesurée directement basée sur la fluctuation avec l’appareil photo. Toutefois, le paramètre C peut être déterminé en mesurant la force à une faible force gamme (< 15 pN) à l’aide de fluctuation et ajustement des données avec un calibré F-courbe d obtenir le paramètre C 20. - Alternativement, pour des expériences avec l’ADN double brin, déterminer le paramètre C en utilisant l’ADN surexploiter la transition à une force de ~ 65 AP ( Figure 3) 21 , 22 , 23 en enregistrant la position d à quel saut en extension a montré dsDNA (0,6 X augmentation de longueur de longueur contour). Après avoir déterminé le paramètre C, calculer la force pour les perles captifs.
- La détermination de la force en se basant sur la fluctuation nécessite la position de perle à une fréquence plus élevée que la fréquence d’enregistrement :
- Contrôler le taux de charge en programmant le mouvement des aimants par le biais de la fonction inverse de F (d). L’aimant doit approcher l’échantillon double exponentielle.
Remarque : L’erreur relative de la force déterminée par une méthode d’extrapolation est ~ 10 % et est principalement due à la perle d’hétérogénéité rayon 20.
5. Manipulation de la molécule unique de G4 en présence et en Absence de protéines de fixation
- Force-rampe expériences
- après avoir identifié la sangle de l’ADN double brin, effectuer une analyse de la force-augmentation à un taux de charge de 0,2 pN/s suivie d’une analyse de la force-décès à -0,2 pN/s. Après chaque cycle étirement, tenez la molécule d’ADN à 1 pN pendant 30 s pour permettre à l’ADN simple brin à replier à G4.
- Force-saut expériences
- passer la force d’un pN 54 pendant 30 s en vertu de laquelle un G4 plié peut être déplié et 1 AP pour 60 ans, en vertu duquel un plié G4-15 t pouvait replier.
- Solution protéique Flowing
- couler la solution protéique quand à ~ 20 AP force pour éviter l’attachement des perles à la lamelle. L’hélicase RHAU DEAH-box, qui a montré la grande spécificité de la structure du G4, a été utilisé 24. Le recombinant helicase RHAU (DmRHAU) de Drosophila melanogaster est exprimé chez Escherichia coli et purifié comme décrit plus haut 25. Le G4 activité déroulement de DmRHAU a été testée sur un tétramoléculaire G4 ADN substrat 13.
- Analyser la force qui se déroule à l’aide d’un interne écrit Matlab programme 14.
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Representative Results
Le montage pour étirer une seule molécule G4 est illustré à la Figure 4. Une séquence de formation G4 monocaténaire durée entre deux poignées de dsDNA était attachée entre un lamelle couvre-objet et un talon paramagnétique. Pour trouver une perle captif dsDNA unique, un dosage overstretching a été réalisé en augmentant la force à des taux de charge constante. Trois types de mesures ont été souvent utilisés pour étudier le pliage et le dépliage des biomolécules : mesure (i) constant force, mesure de la force II-rampe et de mesure (iii) force-saut. En raison du taux très lent se déroule de cette structure de G4, l’équilibre de pliage-dépliage de transition ne peut se produire à la fois au fil des jours, si les mesures force-rampe et force-saut ont été utilisées pour caractériser la cinétique qui se déroule et la stabilité du G4 Ouvrages d’art.
Mesures de la force-rampe pour G4 qui se déroulent en présence ou en Absence de la protéine RHAU :
Figure 4 b montre typique force-extension courbes obtenues par une augmentation de force scan à un taux de charge de 0,2 pN/s suivie d’une analyse de la force-décès à -0,2 pN/s. Après chaque cycle de vibration, la molécule d’ADN a eu lieu à 1 pN pendant 30 s pour permettre d’ADNsb à replier à G4. Le saut de l’extension dans l’analyse de l’augmentation de la force ont indiqué une transition qui se déroule du G4. Lorsque vous utilisez une séquence de formation non-G4, le saut brusque extension ne peut être observé. La distribution se déroule de force pourrait être obtenue en enregistrant les forces qui ont eu lieu de déroulement. Le déroulement forcer la distribution de G4-15 t obtenu à 0,2 pN/s a montré un pic unique à ~ pN 52. Toutefois, en présence de 10 nM RHAU, G4-15 t est resté plié lors de l’analyse-l’augmentation de la force pour jusqu'à 60 pN, indiquant G4 stabilisation par liaison RHAU. En présence de 10 nM RHAU et 1 mM d’ATP, la répartition de la force qui se déroule a été déplacée à une force inférieure, signe d’une déstabilisation de l’ATP-dépendante du G4 par RHAU.
Mesures du G4, qui se déroulent en présence ou en Absence de la protéine RHAU force-saut :
La figure 5 montre une trace représentative de la hauteur du talon pendant les quatre cycles de force-saut (Figure 5, panneau de gauche) ; la force exercée sur la molécule a été roulée entre 54 pN pendant 30 s en vertu de laquelle un G4 plié peut être déplié et 1 pN pendant 60 s dans lesquelles puisse replier un plié G4-15 t. La durée de vie moyenne de plié G4-15 t à 54 pN était ~ 6,4 s, estimée en ajustant l’histogramme à vie avec une décroissance exponentielle fonction13. Après circulant dans une solution de 10 nM RHAU helicase sans ATP, l’extension de l’ADN captif est demeuré à plié pendant toute la durée de détention s 30 à 54 pN, indiquant que le RHAU stabilise fortement la structure de G4-15 t contre mécanique qui se déroulent dans le absence d’ATP. Après qui coule à 10 nM RHAU et 1 mM d’ATP, l’extension de la même molécule juste après le saut de 1 pN à 54 pN était au niveau de l’ADN simple brin déplié, indiquant que le RHAU déstabilise la structure G4 en présence d’ATP.
Figure 1 : Préparation de l’ADN de G4 pour les molécules simples étirements expériences.
Les poignées de l’ADN double brin ont été préparées par PCR avec des amorces thiol-5' et 5'-biotine. Produits PCR ont été purifiées et digérés par les enzymes de restriction de BstXI et ont été purifiées par extraction du gel. SsDNA formant G4, double flanc ADNsb et poignée anti-ADNdb ont été ligaturé à l’aide de T4 DNA ligase. Le produit ligaturé a été purifié par extraction du gel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Croquis de l’appareil de base magnétique pincettes.
(A) esquisse d’un canal d’écoulement avec une paire d’aimants placés au-dessus et un objectif de microscope placé en-dessous. (B) esquisse d’une voie d’écoulement assemblés où les rectangles de couleurs bleus représentent le couvre-objet en haut et en bas, et les lignes elliptiques grises représentent l’entrée et la sortie du chenal d’écoulement. (C) esquisse de la mise sur pied et l’étalonnage de la configuration magnétique pincettes. (D) des exemples d’images de la perle de référence et de mouvement talon à différents dé-focus postes stockés dans les bibliothèques d’images de perle. Le signe rouge désigne la mise au point de l’image de perle de référence obtenue à un particulier avion utilisé pour le blocage du plan focal. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : La Force d’étalonnage des pinces magnétiques.
(A) Calibration de la force à l’aide des fluctuations de perles le long d’un axe y exempt de rotation. Axe des abscisses sont le long de la même direction que le champ magnétique. Force est le long de l’axe z et est contrôlée en ajustant la distance d, entre la paire à un aimant permanent et la lamelle. Étalonnage (B) d’utiliser un long 48 502 bp-ADN. Propriété de billes magnétiques hétérogène peut être décrite par un seul paramètre ch. Ce chiffre a été modifié par10. (C) réglage du paramètre C d’une perle magnétique fixée sur un 2 Ko-ADN à l’aide de B à S surexploiter la transition. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Manipulation de molécules simples d’un G4.
(A) esquisse d’une qui s’étend de la structure unique de G4 et de mesurer le déroulement des événements. (B) exemple typique de force-augmentation (cyan) et courbe de diminution de la force d’un G4 captif. Ce chiffre a été modifié par12. (C) courbe Force-extension du G4 en absence (gris) ou en présence (rose) de la protéine RHAU. (D) dépliage force distribution du G4 en l’absence (gris) (n = 140) ou la présence (rouge) de RHAU et ATP (n = 117). Ce chiffre a été modifié par13. S’il vous plaît cliquez surici pour obtenir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Les mesures de Force-saut du G4 se déroule.
(A) trace de temps représentant le changement de hauteur de talon dans la force sauter cycles entre 1 et 54 mesurée sans DmRHAU, avec 10 nM DmRHAU mais sans ATP et avec 10 nM DmRHAU et ATP, comme il est indiqué dans le panneau de la figure 1 mM. (B) les traces de temps représentatif du changement d’extension d’une molécule G4 (données grises) après avoir sauté à 54 pN en plusieurs cycles de force-saut tirées de données (A). Les extensions correspondant aux plié (F) et déplié G4 (U) sont également indiqués ; Déroulement des événements G4 sont indiqués par des flèches. Ce chiffre a été modifié par13. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Comme décrit ci-dessus, une plate-forme pour l’étude de la stabilité mécanique de l’ADN du G4 et les interactions de protéine à l’utilisation de G4 seule molécule pincettes magnétiques est signalée. Accompagnant la plate-forme, des protocoles très efficaces de trouver l’attache d’ADN G4 et mesure de la dynamique de pliage-dépliage et la stabilité de la structure de G4 avec résolution spéciale nanomètres sont développés. Le blocage du plan focal permet un contrôle anti-dérive très stable, ce qui est important pour la détection d’une transition de petite structure comme le G4 (taille d’étape ~ 7 nm) et les interactions avec les protéines dans des expériences d’échange tampon. Cette plateforme a utilisé récemment pour études de la dynamique de pliage et dépliage de télomérique G414 et c-Myc promoteur G412, ainsi que des études de G4 liaison protéine RHAU helicase13.
Une erreur expérience typique est la liaison non spécifique de l’ADN et de perles sur la lamelle couvre-objet ou plusieurs DNAs le lier à billes magnétiques. Tout d’abord, afin de réduire les liaisons non spécifiques, le stockage de produits chimiques comme APTES et CCAP doivent être vérifiés régulièrement. Deuxièmement, il est important de choisir un bon type de billes magnétiques et de bloquer la liaison non spécifique. À l’aide de la mémoire tampon de 10 mg/mL de BSA ou petit ADN oligo, tels que poly T, pour bloquer la surface hydrophobe des perles peut réduire considérablement les liaisons non spécifiques. Enfin, une sangle unique d’ADN peut être aisément distinguée des multiples sangles d’ADN par la caractéristique ADN surexploiter transition17,18,19.
Actuellement, la détermination de la position de la plate-forme est basée sur la pastille d’imagerie analyse, qui a une résolution spatiale limitée de ~ 2 nm. En outre, il a un taux d’échantillonnage restreint de ~ 100 Hz, principalement en raison de la fréquence d’acquisition limitée de type caméras CCD et analyse de corrélation des images. Ces limitations peuvent être surmontées à l’aide d’illumination de microscopie (FRBR) de réflexion totale interne. Elle produit une fine couche de lumière évanescente qui décroît exponentiellement avec la hauteur de la surface, qui peut être utilisée pour déterminer la modification de l’extension de quelques molécules à un rapport signal sur bruit élevé, tout en évitant la perle image acquisition et analyse26 . Une autre limitation est qu’il est difficile de visualiser directement la molécule captif ou le ligand lié à la molécule attachée à l’aide d’imagerie de fluorescence dans la conception d’étirement verticale, qui peut être surmontée en étirant les molécules dans le plan focal, en utilisant pince magnétique transversal27. Enfin, la conception actuelle de la chaîne de réaction ne permet pas d’échange de solution rapide en raison de la perturbation de l’écoulement de la molécule. En outre, une force de traînée importante générée à haute vitesse écoulement peut même casser les sangles. Cette limitation peut être surmontée en manipulant les sangles à l’intérieur du puits placés sur la surface inférieure du canal28.
G4 composés stabilisateurs sont actuellement considérés comme cibles thérapeutiques potentielles pour les maladies, y compris le cancer, le virus apparenté maladies et neurodégénérescence maladies29,30,31. Le protocole peut être appliqué à une large gamme de G4 liaison protéines2 et petits ligands32. En plus des applications dans les études de G4, cette plate-forme ainsi que les protocoles, en principe, peuvent être utilisés pour l’étude des autres structures secondaires d’acides nucléiques, y compris les ADN et ARN épingles à cheveux, triplex et i-motif33.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Meng Pan pour la relecture du manuscrit. Ce travail est soutenu par Singapour Ministère de l’éducation académique recherche fonds de niveau 3 (MOE2012-T3-1-001) à J.Y. ; la Fondation de recherche National par le biais de la mécanobiologie Institut de Singapour à J.Y. ; la Fondation nationale de la recherche, Office, Singapour du premier ministre, en vertu de son Programme de recherche de NRF (NRF recherche prix no FRO-NRFI2016-03 de J.Y. ; le Fonds de la recherche fondamentale pour les universités de la centrale (2017KFYXJJ153) à H. Y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
| DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
| restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
| coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
| Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
| M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
| Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
| Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
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References
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