Summary
G-quadruplexes işlemek için bir tek molekül manyetik cımbız platform, G4 istikrar ve yönetmelik çalışması için izin veren çeşitli proteinler tarafından bildirilmektedir.
Abstract
Sigara-kurallı nükleik asit ikincil yapı G-quadruplexes (G4) DNA ikileşmesi, transkripsiyon, RNA işlenmesi ve telomer uzama gibi çeşitli hücresel süreçler söz konusu. Bu işlemler sırasında çeşitli proteinlerin bağlamak ve onların işlevi gerçekleştirmek için G4 yapıları gidermek. G4 fonksiyonu kez katlanmış yapısını istikrar üzerinde bağlı olarak, nasıl G4 proteinler G4 kararlılığını düzenleyen araştırmak önemlidir. Bu çalışma tek G4 molekülleri G4 proteinler G4 molekülünü gerçek zamanlı olarak düzenlenmesi çalışmaları sağlayan manyetik cımbız kullanarak işlemek için bir yöntem sunar. Genel olarak, bu yöntem çalışmaları uygulamalarında geniş bir kapsamı proteinler/ligandlar etkileşimleri ve çeşitli DNA veya RNA ikincil yapılar üzerinde düzenlemeler için uygundur.
Introduction
4 iplikçikli DNA veya RNA G4 yapıları birçok önemli biyolojik süreçlerin1' kritik rol oynarlar. Çoğu protein G4 bağlama ve yönetmelik, telomer proteinler (Revers, POT1, RPA, TEBPs, TRF2) dahil olmak üzere dahil olan1,2, transkripsiyon faktörleri (nucleolin, PARP1)3, RNA proteinleri (hnRNP A1, işleme hnRNP A2)4, helikazlar (BLM, FANCJ, RHAU, UYR, Dna2, Pif1)5ve DNA ikileşmesi proteinleri (Rif1, Değişiklik1, PrimPolymerase)6ile ilgili. Protein bağlayıcı stabilize veya G4 yapıları istikrarsızlaştırmak; Böylece sonraki Biyolojik işlevleri düzenleyen. G4 kararlılığını ultraviyole (UV) veya dairesel dichroism (CD) yöntemleri7kullanarak erime termal tarafından ölçüldü. Ancak, bu koşullar fizyolojik değildir ilgili ve proteinler7bağlama etkilerini eğitim için uygulamak zordur.
Tek molekül işleme teknolojilerinde hızlı geliştirme çalışmaları katlama ve DNA veya nanometre çözünürlük gerçek zamanlı8ile tek molekül düzeyinde bir protein gibi bir biomolecule, elinde tutmasına sağlamıştır. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM), optik cımbız ve manyetik cımbız en yaygın olarak kullanılan tek molekül manipülasyon yöntemleri vardır. AFM ve optik cımbız9ile karşılaştırıldığında, manyetik cımbız katlama-unfolding dinamikleri tek bir molekül istikrarlı ölçümleri gün içinde bir anti-drift tekniği10,11kullanarak izin.
Burada, bir tek molekül manipülasyon platform G4 istikrar Yönetmeliği proteinler bağlayarak çalışmaya manyetik cımbız kullanarak bildirilen12,13. Bu eser örnek ve akışı kanal hazırlanması, manyetik cımbız kurulum ve güç kalibrasyon dahil olmak üzere temel yaklaşımlar özetliyor. Kuvvet kontrolü ve anti-drift protokolleri açıklandığı adım 3 olarak uzun zaman ölçümleri sürekli gücü (kuvvet kelepçe) gibi çeşitli güç kontrolleri altında izin verir ve sabit yükleme (kuvvet-rampa) oranı ve kuvvet-ölçüm atlama. 4. adımda açıklanan güç kalibrasyon Protokolü güç kalibrasyonu sağlayan < 1 µm kısa bağları üzerinde geniş bir güç aralığı 100 pN, % 10 içinde göreli bir hata ile. RNA helikaz kararlılığını düzenlenmesi örneği RNA G4 bu platform13uygulamaları göstermek için kullanılan çözümlenmesinde temel rol oynar AU-zengini eleman (RHAU) helikaz (diğer adı DHX36, G4R1) ile ilişkili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlık G4 DNA tek molekül Stretching için
- hazırla 5 '-etiketli thiol ve 5 '-dsDNA kolları tarafından PCR DDNA polimeraz 5 kullanarak lambda fajının DNA şablonunda kullanarak etiketli biotin '-thiol ve 5 '-biotin astar 14 ( şekil 1). Her iki dsDNA kolları yüksek GC içeriğe sahip (> % 60'ı) DNA önlemek için erime DNA yüksek güçler veya DNA esneme sırasında tutulduğu zaman geçiş 15.
- Arındırmak PCR ürünleri üretici göre BstXI restriksiyon enzimi ile ticari arıtma kit ve Özet kullanarak ' s protokolü.
- Ligate G4 şekillendirme ssDNA ve yan ssDNA ve dsDNA tutamaçları T4 DNA ligaz üreticiye göre kullanarak ' s protokolü. Üreticiye göre ticari arıtma seti kullanarak jel çıkarma tarafından ve birleştirilmiş ürün arındırmak ' s protokolü.
2. Akış kanal hazırlanması
- Coverslip temizlik ve yüzey functionalization
- yer Cam Kavanoz (her kavanoz tutabilir coverslips, 7 adet boyama alt coverslips (#1.5, 22 mm × 32 mm) ve en iyi coverslips (#1.5, 20 x 20 mm) birim ~ 20 mL). Coverslips 2 - 5 kez kavanoz distile su ile durulama.
- Ekle ~ 20 mL % 5-40 deterjan solüsyonu her kavanoz ve bir ultrasonik Temizleme banyo 30 dk. sonra yerde durulama için distile su ile > deterjan kaldırmak için 10 kez.
- Kuru kavanozlara fırında coverslips (~ 150 ° C; Dikkat, sıcak), veya N 2 gaz tarafından. Kurutulmuş en iyi coverslips kuru bir dolapta saklamak.
- Coverslips 10 dk için kavanoza temizlemek için kullanım plazma (O 2 gaz). 10 dk 20 mL metanol içinde %1 (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) çözeltisi hazırlamak (dikkat, toksik/yanıcı). APTES metanol içinde çözülmeye kimyasal duman başlığı kullan.
Not: APTES çözüm saklarken nem kaçının. Eski APTES kez neden olan sorun yüzey coverslips functionalizing içinde. - Sonra hemen plazma temizlik, tüm % 1 APTES çözüm kavanoz eklemek ve 1 h. dökmek için % 1 APTES metanol için belirli atık şişe içine atık kuluçkaya. Yanıcı kimyasallar için duman başlıklı metanol ile ilgili adımları gerçekleştirin.
- Kavanoz metanol ile durulayın ve > 10 kat ile distile su ve sonra kuru tarafından fırın (~ 150 ° C; Dikkat, sıcak). Kuru bir kabine değilse kullanım için ilâ iki hafta APTES kaplı alt coverslips mağaza.
Not: her alt adımından sonra 2.1.1 2.1.4 için temizleme işlemi Sonraki adımdan önce duraklatılmış.
- Araya akışı kanal
- iki hazırlamak " çubukları ", Yani, parafilm ya da çift taraflı bant (~ 4 mm × 20 mm) her kanal için. Bir alt coverslip uzun kenarı boyunca uzanan çubukları iki adet yerleştirin. En iyi coverslip arasında bir akış hücre şekillendirme spacer üzerinde yer (~ 10 mm × 20 mm alan, şekil 2A , B). Parafilm bir yer açıcı kullanılır,
- akışı kanal bir ısıtıcı (60-120 ° C; koyun. Dikkat, sıcak) iki coverslips birbirine parafilm tarafından destek için en iyi coverslip kenarlarına hafifçe basarken 5-10 s. Elde edilen akışı kanal yüksekliği vardır ~ 100 µm, ve böylece kanal birimdir ~ 20 µL.
- Kaçağı önlemek için silikon yapıştırıcı ile kanal uzun kenarını kapatın. Bir giriş ve bir çıkış çözüm hizmet akışı kanal açık her kenarında küçük bir lavabo gibi yapı yapmak için silikon yapıştırıcı kullanın.
Not: Giriş ve çıkış da diğer yolları tarafından örneğin, tarafından yapışan küçük plastik halkalar balmumu kullanarak yapılabilir. - 4 hafta kadar kuru bir dolapta saklamak kanalları.
- Urgan DNA akışı Kanal alt yüzeyinin
- amino-kaplı polistren boncuk seyreltik (çapı: 3 µm) 200 X distile 1 X tarafından serum fizyolojik (PBS) arabellek fosfat tamponlu. Girdap boncuk çözüm ve sonra akış kanalları içine. Kanallar için boncuk çözümde kuluçkaya ~ 30 dk. kaldırmak herhangi bir ipin ucundaki boncuk 1 X PBS arabellek 200 µL ile yıkayarak.
- Ayarla (artış/50 x 50 mm alan başına 1-5 boncuk yüzey yoğunluğu elde etmek için kuluçka süresi azaltma). Başvuru boncuk ile 3 gün için yatırılır kanalları saklar.
- Dilute sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) Siklokekzan-1-karboksilat (Sulfo-SMCC) toz haline 1 X PBS çözüm (~ 0,5 mg/mL). Girdap çözüm ve sonra kanal akışına.
Not: kullanmadan önce taze Sulfo SMCC çözüm hazırlamak ve hemen SMCC hydrolyzation önlemek için kanala ekle. - Incubate 30 dakika süreyle kanaldaki SMCC çözüm SMCC çözüm büyük bir miktar ile yıkayarak kaldırmak (1 mL, ~ 50 kanal birim X) 1 X PBS çözüm.
Not: aşırı SMCC dikkatli yıkayın. DNA bağlama üzerinde coverslip için çok önemli bir adımdır. - DNA hayvan zinciri seyreltik bir elde edilen DNA konsantrasyon ile 1 X PBS içine DNA etiketli thiol biotin ~ 0,3 nM. Yavaşça çözüm mix, DNA çözüm SMCC kaplı kanal içine akışı ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya pipet (~ 23 ° C).
- Yavaşça ücretsiz DNA ile 10 mg/mL sığır serum albumin (BSA) ve %0.01 2-Mercaptoethanol ile 1 X PBS içeren çözüm engelleme 200 µL silsin.
- Blok kanal yüzey çözüm (10 mg/mL BSA, %0.01 2-Mercaptoethanol) kapatmaktır kanal kuluçka için > 2 s; Bu adım sonra kanal deneyler için hazır. Hazır kanal-ebilmek saklanmak için 4 ° c ~ 1 gün.
Not: Engelleme non-spesifik bağlama DNA ve coverslips için manyetik boncuklar azaltmak için önemli bir adımdır.
3. Manyetik cımbız kurulum ve tek kimlik dsDNA urgan
- manyetik cımbız kurulum
- Başlangıç manyetik cımbız kontrol programı. Burada, manyetik cımbız bir all-in house yazılı LabVIEW program tarafından kontrol.
- Kanal montaj önce mıknatıs merkezleri hizalayın. X - ve y - ekseni mikroskop optik eksenindeki mıknatıslar ayarlamak için bir 4 X objektif lens kullanın.
- Z-yön ( şekil 2A) boyunca mıknatıslar hareket ve mesafe d ayarlamak için bir bilgisayar kontrollü motorlu manipülatör kullanın = 0 (d: mıknatıslar ve coverslip arasındaki mesafe) ne zaman mıknatıslar eklemek için mikroskop üzerinde bir coverslip.
- Program aracılığıyla kontrol gücünün sabit kuvvet (Yani, sabit d) dahil olmak üzere elde etmek için manipülatör mıknatıslar hareket ve zaman değişen kuvvet F (t) (Yani, zaman değişen d(t )).
- Parlak boncuk amacı ile geri dağınık aydınlatma için bir ışık yayan diyot (LED) ışık kaynağı kullanın. 100 Hz örnekleme hızında boncuk görüntüleri şarj kuplajlı cihaz (CCD) kamera. tarafından toplamak < / lBen >
- tek dsDNA urgan tanımlamak ve kurulum örnek
- urgan oluşumu
- yavaşça 200 X akışında M-280, paramagnetic boncuk tahlil çözüm (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7.4 içinde seyreltilmiş ) bir kanal içine. Biotin etiketli DNA molekülleri thiol etiketli sonuna SMCC kaplı yüzeyinde immobilize bağlamak boncuk izin vermek 10 min için kuluçkaya. Hafifçe un gergin boncuk 200 µL standart reaksiyon çözüm kullanarak silsin.
Not: M-280 boncuk alt non-spesifik bağlama diğer ticari manyetik boncuklar gibi M-270 göre yüzeye göster.
- yavaşça 200 X akışında M-280, paramagnetic boncuk tahlil çözüm (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10 mM Tris-pH 7.4 içinde seyreltilmiş ) bir kanal içine. Biotin etiketli DNA molekülleri thiol etiketli sonuna SMCC kaplı yüzeyinde immobilize bağlamak boncuk izin vermek 10 min için kuluçkaya. Hafifçe un gergin boncuk 200 µL standart reaksiyon çözüm kullanarak silsin.
- Kanal mikroskop Sahne Alanı'na bağlayın. Arama 100 X yağı daldırma amacı istimal alt yüzeyinde boncuk için.
- Bir başvuru boncuk yüzeyi ve hareketli bir hayvan zinciri boncuk seçin. Başvuru boncuk ve farklı odak uçaklar, hayvan zinciri boncuk ilk görüntü kütüphaneler derlenir.
- Boncuk görüntü kalibrasyonu
- deneyler, daha önce başvuru ve iki ayrı boncuk görüntüsü olarak saklanan 20-50 nm tarafından aralıklı farklı odak uçaklar, hayvan zinciri boncuk görüntüleri elde etmek için bir objektif piezo aktüatör kullanın kütüphaneler ve are sırasıyla odak uzaklığı ( şekil 2B) ile dizine.
- x, y, z konumunu belirleme
- deneyler sırasında x-y uçak boncuk konumunu tarafından boncuk centroid belirlemek. Hayvan zinciri boncuk yükseklik değişikliği bu kitaplıkta depolanan geçerli boncuk görüntü karşılaştırarak belirle. Fourier dönüşümü boncuk görüntüleri 16 güç spektrumu auto-korelasyon işlevi analizini kullanın.
- Anti-drift geribildirim başvuru boncuk kullanarak
- deneyler sırasında kullanmak için piezo " kilit " amaç ve düşük frekans üzerinden kitaplığında depolanan belirli boncuk resmin arasındaki mesafe geribildirim kontrol, böylece sıkışmış boncuk görüntü ( 2D rakam) kitaplığında depolanan belirli bir görüntü ile en iyi korelasyon vardır.
- Uygulayarak urgan bir tek dsDNA molekül olup olmadığını belirlemek ~ 65 pN kuvvet belirlemek bir tek dsDNA molekül urgan geçiş 17 , esneme karakteristik DNA geçer 18 , 19. bir tek dsDNA urgan bulunana kadar bu işlemi yineleyin. (Lütfen güç kalibrasyon ve geçiş esneme DNA için sonraki bölüme bakın).
- urgan oluşumu
4. Manyetik cımbız kalibrasyon zorla
- doğrudan boncuk dalgalanma ile kullanarak uzun DNA (48,502 bp λ-DNA) molekülleri için kuvvet (ilâ 100 pN) belirler:
, Boltzmann sabiti k B nerede T sıcaklığı Kelvin ölçekte, δ 2 y boncuk dalgalanma manyetik alan ve kuvvet dik yönde varyansını yön. Bu yönde hareket boncuk l + nerede l uçtan uca mesafe boyunca DNA kuvvet yönünü (uzantısı) ve r 0 r 0, uzunluğu ile bir sarkaç dalgalanması olarak tanımlanabilir boncuk 10 ( şekil 3A) RADIUS. - Karar vermek için kuvvet F boncuk mesafe mıknatıslar bir fonksiyonu olarak kalibrasyon eğrisi d ve F (d) için farklı boncuk uzun λ-DNA kullanarak. Genellikle, DNA urgan uzunluğu göz ardı edilemez mıknatıs ve coverslip arasındaki mesafe kullanılır. Uygun F-d eğri çift-üstel çürüme işlevi tarafından:
, nerede uygun parametreleri α1, α2, γ1, γ2 göre belirlenir Manyetik cımbız ve parametre C manyetik boncuklar türdeş olmayan özelliği tarafından belirlenir. C, F değişen tarafından-d eğri farklı boncuk elde-ebilmek var olmak örtüşen 10 ( şekil 3B). - Kısa DNA için parametre C bireysel manyetik boncuklar için kalibrasyon deneyler.
- Üzerinde dalgalanma temel kuvvet belirleme gerektirir köşe sıklığı yüksek bir frekansta boncuk pozisyon kayıt:
, γ sürükle nerede boncuk katsayısı. Yüksek güç kısa DNA, 100 Hz daha hızlı kayıt frekans gerektirir, bu nedenle, kuvvet doğrudan fotoğraf makinesi ile dalgalanma üzerinde göre ölçülen olamaz. Ancak, C belirlenen bir düşük güç ölçerek parametre zorla aralığı (< 15 pN) dalgalanma kullanarak ve kalibre edilmiş F verilerle montaj-parametre C 20 elde etmek için d eğri. - Alternatif olarak, dsDNA ile deneyler için belirlemek parametre C geçiş bir kuvvet, esneme DNA'yı kullanarak ~ 65 pN ( şekil 3 c) 21 , 22 , hangi dsDNA gösterdi uzantısı atlama (kontur uzunluğu uzunluğu artış X 0,6) d konumunda kaydederek, 23. C parametresi belirledikten sonra gergin boncuk için güç hesaplamak.
- Üzerinde dalgalanma temel kuvvet belirleme gerektirir köşe sıklığı yüksek bir frekansta boncuk pozisyon kayıt:
- Yükleme hızı ters fonksiyon F (d) aracılığıyla mıknatıslar hareket programlama tarafından kontrol. Mıknatıs örnek Çift Kişilik katlanarak erişmeniz gerekir.
Not: Böyle bir ekstrapolasyon yöntemi tarafından belirlenen kuvvet göreli hatadır ~ % 10 ve esas olarak boncuk RADIUS heterojenite 20 tarafından neden olur.
5. Tek molekül manipülasyon G4 varlığı ve yokluğu bağlayıcı proteinler
- 0.2 pN/s ve ardından yükleme hızında bir kuvvet-artış tarama gerçekleştirmek dsDNA urgan tanımlayan sonra kuvvet rampa deneyler
- bir -0.2 kuvvet-vefat tarama pN/s. Germe her döngüsü sonra DNA molekülünün 30 1 pN tutmak için G4 refold ssDNA izin vermek için s.
- Kuvvet-atlama deneyler
- 30 54 pN arasında güç döngüsü s altında bir katlanmış G4 gelişeceğini olabilir ve 60s, altında bir katlanmış G4-15T refold için 1 pN.
- Flowing protein çözüm
- protein çözüm akış yönü ne zaman ~ 20 pN kuvvet coverslip boncuk eki önlemek için. G4 yapısı yüksek özgüllük gösterdi, DEAH-box RHAU helikaz kullanılan 24 oldu. Rekombinant Drosophila melanogaster RHAU (DmRHAU) helikaz Escherichia coli ifade edilen ve daha önce 25 açıklandığı gibi saf. DmRHAU besleyicisini etkinliği bir tetramolecular G4 DNA substrat 13 denetlesinler G4.
- Bir in-house kullanarak unfolding kuvvet Matlab programı 14 yazılı analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneme kurulumu G4 molekülünü germe için şekil 4' te gösterilmiştir. Bir tek iplikçikli G4 şekillendirme sıra iki dsDNA kolları arasında yayılmış bir coverslip ve bir paramagnetic boncuk arasında gergin. Bir tek dsDNA gergin boncuk bulmak için overstretching bir tahlil kuvvet sabit yükleme hesaplı artırarak gerçekleştirildi. Ölçümleri üç tür katlama okuyan ve biomolecules unfolding için kez kullanılmıştır: (i) sabit kuvvet ölçüm, (ii) kuvvet-rampa ölçüm ve (iii) kuvvet-atlama ölçümü. Katlama-unfolding geçiş yalnızca günde, süre gerçekleşebilir denge bu G4 yapının son derece yavaş açılım oranları nedeniyle çok kuvvet-rampa ve kuvvet-atlama ölçümleri unfolding kinetik ve G4 kararlılığını karakterize için kullanıldı yapıları.
RHAU Protein içinde Unfolding kuvvet rampa ölçümleri G4 için:
Tipik kuvvet-uzantısı eğriler elde edilen bir kuvvet artışı tarafından 4B yolunu gösterir tarama 0.2 pN/s-0.2 bir kuvvet-vefat tarama ve ardından yükleme hızında pN/s. Germe her döngüsü sonra DNA molekülünün 30 1 pN yapıldı s ssDNA G4 için refold izin vermek. Kuvvet-artış tarama uzantısı atlamada G4 unfolding bir geçiş belirtti. G4 şekillendirme sırasını kullanırken ani uzantısı atlama gözlenen olamaz. Açılım güç dağıtım hangi oluştu unfolding, kuvvetler kaydederek elde. Unfolding zorlamak G4-15T 0.2 pN/s tek bir zirve gösterdi elde dağılımı ~ 52 pN. Ancak, huzurunda 10 nM RHAU, G4-15T 60 pN, RHAU bağlama gösteren G4 istikrar gücü artış taraması sırasında katlanmış kaldı. 10 nM RHAU ve 1 mM ATP huzurunda unfolding güç dağıtım için daha düşük bir güç göstergesi G4 RHAU tarafından bir ATP-bağımlı istikrarsızlık kaymıştır.
Kuvvet-RHAU Protein içinde Unfolding ölçümleri G4 atlama:
Şekil 5 boncuk yükseklik temsil edici bir iz dört kuvvet-atlama döngüsü (şekil 5, sol panelde); sırasında gösterir. molekül için uygulanan kuvvet arasında 30 54 pN sağlanıncaya s altında bir katlanmış G4 gelişeceğini olabilir ve 60 için 1 pN altında bir katlanmış G4-15T refold s. Katlanmış G4-15T 54 pN, ortalama ömrü olduğunu ~ 6.4 s, bir üstel çürüme işlevi13ile ömür boyu çubuk grafik yaklaştırarak tahmini. 10 nM RHAU helikaz ATP olmadan bir çözümde akan sonra gergin DNA uzantısı 54 pN RHAU güçlü mekanik olarak elinde tutmasına karşı G4-15T yapısı stabilize gösteren, 30 s holding zaman boyunca katlanmış bir düzeyde kaldı ATP yokluğu. 10 nM RHAU ve 1 mM ATP akan sonra doğru-den sonra 1 pN için 54 pN atlama aynı molekülün uzantısı RHAU ATP huzurunda G4 yapısı oynattığını gösteren gelişeceğini ssDNA düzeyde oldu.
Resim 1: Hazırlık G4 DNA'ın tek molekül germe deneyler için.
DsDNA kolları PCR tarafından 5'-thiol ve 5'-biotin primerler kullanılarak hazırlanmıştır. PCR ürünleri saflaştırılmış ve BstXI restriksiyon enzimi ile sindirmek ve jel çıkarma tarafından saf. G4 şekillendirme ssDNA, iki ssDNA kanattan ve dsDNA kolu bakmaksızın T4 DNA ligaz kullanarak. Ve birleştirilmiş ürün jel çıkarma tarafından saflaştırıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Çizimler temel manyetik cımbız aparatı.
(A)taslağını mıknatıslar üzerinde yer alan ve altına yerleştirilen bir mikroskobu objektif bir çift ile bir akış kanal. (B) taslağını bir birleştirilmiş akışı kanal nerede üst ve alt coverslips mavi renkli dikdörtgenler gösterir ve giriş ve çıkış akışı kanalının gri eliptik satırları gösterir. Kuvvet oluşturma ve manyetik cımbız Kur Kalibrasyonu (C) kroki. (D) örnekleri başvuru boncuk ve farklı, hareketli boncuk görüntüleri de-odak boncuk görüntü kitaplıklarda depolanan pozisyonlar. Kırmızı işaret belirli bir elde edilen referans boncuk görüntü odak düzlemi kilitleme için kullanılan uçak de-odak gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: manyetik cımbız kalibrasyonu zorlamak.
(A)kalibrasyon boncuk döndürme-Alerjik y yönü boyunca dalgalanmalar kullanarak güç. X ekseni manyetik alan gibi aynı yönde birlikte olduğunu. Kuvvet z ekseni ve mesafe, d, Daimi Mıknatıs çifti ve coverslip arasında ayarlayarak denetlenir. Uzun bir 48,502 kullanarak (B) kalibrasyonu bp-DNA. Türdeş olmayan manyetik boncuk özelliği tek parametreli C. tarafından tanımlanabilir Bu rakam10' dan değiştirildi. (C) kalibrasyon parametre C 2 kb-DNA üzerinde bağlı bir manyetik boncuk B geçiş esneme s kullanma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Tek molekül bir G4 manipülasyon.
Bir tek G4 yapısı germe ve olaylar unfolding ölçme(a)kroki. Kuvvet-artış (mavi) ve gergin bir G4 kuvvet-azalma eğrisi (B) tipik örneği. Bu rakam12den değiştirildi. (C) G4 kuvvet-uzantısı eğrisi devamsızlık (gri) veya RHAU protein (pembe) varlığı. (D) açılım zorlamak G4 dağılımı (gri) yokluğunda (n = 140) veya varlığı (kırmızı) RHAU ve ATP (n = 117). Bu rakam13değiştirildi. TıklayınızBurada bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için.
Şekil 5: Force-atlama ölçümleri G4 unfolding.
(A)temsilcisi zaman izleme boncuk yükseklik değişikliği sırasında kuvvet 1 pN ve 54 pN DmRHAU, 10 ile ölçülen arasında devir atlamak nM DmRHAU ama olmadan ATP ve hem 10 nM DmRHAU ve 1 mM ATP, resim Masası'nda belirtildiği gibi. (B) temsilcisi zaman izleme veri(a)alınan birkaç kuvvet-atlamak döngü için 54 pN atlama sonra uzantısı değişim G4 molekülünün (gri veri). (F) karşılık gelen uzantıları katlanmış ve gelişeceğini (U) G4 da belirtti; G4 olaylar unfolding oklarla belirtilmiştir. Bu rakam13değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda, bir platform G4 DNA'ın mekanik sağlamlık ve G4 kullanarak için protein etkileşimleri çalışmak için açıklandığı gibi tek molekül manyetik cımbız bildirilmektedir. Platform refakat, G4 DNA urgan ve ölçüm katlama-unfolding dinamikler ve istikrar nanometre özel çözünürlük ile G4 yapısının bulma yüksek verimli iletişim kuralları geliştirilmiştir. Odak düzlemi kilitleme küçük yapı geçiş G4 gibi algılamak için önemlidir son derece kararlı Anti-drift denetim sağlar (adım boyutu ~ 7 nm) ve arabellek Satım deneylerde proteinler ile etkileşim. Bu platform son zamanlarda telomeric G414 ve c-Myc organizatörü G412katlama ve açılım dinamikleri çalışmaların yanı sıra çalışmalar G4 bağlayıcı protein RHAU helikaz13istihdam edilmiştir.
Non-spesifik bağlama DNA ve coverslip üstündeki bir tipik deneme hatasıdır ya birden fazla DNA'lar için manyetik boncuklar bağlayabilirsiniz. Non-spesifik bağlama azaltmak için öncelikle, APTES ve SMCC gibi kimyasallar depolanmasını gerekir düzenli olarak kontrol edilmesi. İkinci olarak, manyetik boncuk uygun türü seçin ve non-spesifik bağlama engellemek önemlidir. 10 mg/mL BSA arabellek veya Poli T, gibi küçük DNA oligo kullanarak boncuk hidrofobik yüzey engellemek için önemli ölçüde belirsiz bağlama azaltabilir. Son olarak, tek bir DNA urgan kolayca birden çok DNA bağları DNA esneme geçiş17,18,19özelliklerine göre ayrılır.
Şu anda, konum belirleme platformu analizi, Imaging boncuk dayanır sınırlı kayma çözünürlüğe sahip olduğu ~ 2 nm. Buna ek olarak, bir sınırlı örnekleme oranına sahip ~ 100 Hz, özellikle tipik CCD kameralar sınırlı Alım oranı ve korelasyon analizi görüntüleri nedeniyle. Toplam iç yansıma mikroskobu (TIRF) aydınlatma kullanarak bu sınırlamalar üstesinden gelebilir. İnce bir tabaka halinde katlanarak boncuk resim alma ve analiz26 kaçınırken sinyal / gürültü oranı yüksek, kısa molekülleri uzantısı değiştirmek belirlemek için kullanılan yüzey yüksekliğiyle bozunmaları fani ışık üretir . Başka bir sınırlama doğrudan gergin molekül veya odak düzlemi kullanarak molekülleri yayarak aşılabilir dikey germe tasarım Floresans Imaging'i kullanma gergin molekül bağlı ligand görselleştirmek için zorlu olmasıdır enine manyetik cımbız27. Son olarak, reaksiyon kanal geçerli tasarım hızlı çözüm değişimi nedeniyle akış pertürbasyon molekül için izin vermez. Ayrıca, yüksek hızlı akış oluşturulan bir büyük sürükle güç bile bağları kırmak. Bu sınırlama bağları kanal28alt yüzeyine yerleştirilen microwells içinde işleyerek üstesinden gelebilir.
G4 teskin bileşikler şu anda hastalıklar, dahil olmak üzere kanser, potansiyel terapötik hedef olarak kabul edilir virüs ilgili hastalıklar ve ateş hastalıkları29,30,31. Protokol geniş aralığı G4 bağlayıcı proteinler2 ve küçük ligandlar32uygulanabilir. G4 çalışmalarda uygulamaları ek olarak, bu platform gibi protokolleri, prensip olarak, DNA ve RNA saç tokaları, tripleks ve i-motif33dahil olmak üzere diğer nükleik asitler ikincil yapılar çalışmaları için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Meng Pan el yazması proofreading için teşekkür ederiz. Bu eser tarafından Singapur Bakanlığı, eğitim akademik araştırma fonu Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) J.Y. için desteklenir; J.Y. Mechanobiology Enstitüsü Singapur'a aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı; Ulusal Araştırma Vakfı, Başbakan'ın Office, Singapur, onun NMG Investigatorship programı (NMK Investigatorship Ödülü No altında NATO Mukabele Gücü-NRFI2016-03 J.Y. için; Temel Araştırma Fonu (2017KFYXJJ153) Merkez üniversitelere H. Y için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA PCR primers | IDT | DNA preparations | |
| DNA PCR chemicals | NEB | DNA preparations | |
| restriction enzyme BstXI | NEB | R0113S | DNA preparations |
| coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) | BMH.BIOMEDIA | 72204 | flow channel preparation |
| Decon90 | Decon Laboratories Limited | flow channel preparation | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | flow channel preparation |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | flow channel preparation |
| M-280, paramganetic beads,streptavidin | ThermoFisher Scientific | 11205D | flow channel preparation |
| Polybead Amino Microspheres 3.00 μm | Polysciences, Inc | 17145-5 | flow channel preparation |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | flow channel preparation |
| Olympus Microscopes IX71 | Olympus | IX71 | Magnetic tweezers setup |
| Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | Magnetic tweezers setup |
| Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | Magnetic tweezers setup |
| CCD/CMOS camera | AVT | Pike F-032B | Magnetic tweezers setup |
| Translation linear stage | Physik Instrumente | MoCo DC | Magnetic tweezers setup |
| LED | Thorlabs | MCWHL | Magnetic tweezers setup |
| Cubic Magnets | Supermagnete | Magnetic tweezers setup | |
| Labview | National Instruments | Magnetic tweezers setup | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | Data analysis |
References
- Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
- Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
- Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).
- Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L.
- Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
- Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
- Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
- You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
- You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
- You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
- Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
- Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
- Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
- Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
- Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
- Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
- Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
- Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
- Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
- Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy? Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
- Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
- Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).
